一种λ核酸外切酶活性测定方法

摘要

本发明公开了一种λ核酸外切酶活性测定方法，所述方法包括以下步骤：获得一条链的5'端磷酸化的双链DNA，然后以该双链DNA为底物在λ核酸外切酶存在下在反应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出λ核酸外切酶的活性程度。本发明方法与现有技术的方法相比，无放射性污染，操作简单快捷，灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种λ核酸外切酶活性测定方法。

背景技术

λ核酸外切酶由λ噬菌体核酸外切酶基因编码。λ核酸外切酶作用于双链DNA，沿5′→3′方向逐步切去5′单核苷酸，最适底物是5′磷酸化的双链DNA。

λ核酸外切酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，可用于制备单链DNA模板。标准的测活方法采用放射性同位素法，即首先合成一条5’末端带³²P标记dATP的双链DNA。λ核酸外切酶活性可将[³²P]-dATP切除。再经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸可溶性物质中放射性的含量，计算λ核酸外切酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。

发明内容

本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的λ核酸外切酶测活方法。本发明原理如图1所示。

具体来说，本发明采用的是以下技术方案：

一种λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获得一条链的5'端磷酸化的双链线性DNA，然后以该双链线性DNA为底物在λ核酸外切酶存在下在反应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出λ核酸外切酶的活性程度。

优选地，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。在一个实施方案中，所采用的染料是成熟的商用双链DNA特异性荧光染料，例如picogreen染料。

在一个实施方案中，所采用的双链线性DNA模板是以λDNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA，以便于建立标准的检测体系，其中所用的正向和反向引物中的一者的5’端具有磷酸化基团。在一个相应的实施方案中，所用正向引物为5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物为5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。

本发明的优点：

1. 无放射性污染；

2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定。

3. 灵敏度高，可检测到10 mU的λ核酸外切酶。

附图说明

图1是本发明的测定方法的原理图。

图2是通过本发明方法测定活性获得荧光活性曲线图。

具体实施方式

本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的λ核酸外切酶测活方法。本发明原理如图1所示。

如图1所示，λ核酸外切酶可以将一端磷酸化的双链DNA降解为单链DNA，双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合，产生荧光；而picogreen染料不能结合单链DNA，从而不能产生荧光。λ核酸外切酶的活性在一定范围内单链DNA产物的量成正比，因此其活性就可以用Picogreen荧光强度来进行测定。

举例来说，本发明的测定方法涉及以下方面：

1. 磷酸化双链DNA的制备

引物F（5’磷酸化修饰）：5’-aataacgtcggcaactttgg-3’；

引物R：5’-gttacgccaccagtcatcct-3’；

PCR模板：λ DNA

PCR反应：

组分体积DDW至50μl10x Taq缓冲液5dNTP (10 mM)1μl引物F (10 μM)2μl引物R (10 μM)2μlλ DNA10 ngTaq酶1 U

PCR产物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式纯化。纯化的PCR产物用A260测定浓度。

3. λ核酸外切酶反应：

组分体积DDW至50μl10 x λ外切酶缓冲液5磷酸化PCR产物100 ngλ核酸外切酶1 mU-1024 mU

温度时间37℃30分钟4℃保持

4. picogreen荧光检测：

向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。

5. 标准曲线绘制及待测样品酶活计算：

标准品活力单位(U)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。根据待测样品荧光强度，软件即可自动回算出待测样品的酶活(U/μl)。

下面将结合具体实施例来对本发明作更详细的说明。

实施例1. 荧光法测定λ核酸外切酶活性方法的建立

1. 磷酸化双链DNA的制备

引物F（5’磷酸化修饰）：5’-aataacgtcggcaactttgg-3’；

引物R：5’-gttacgccaccagtcatcct-3’；

PCR模板：λ DNA

PCR反应：

组分体积DDW至50μl10x Taq缓冲液5dNTP (10 mM)1μl引物F (10 μM)2μl引物R (10 μM)2μlλ DNA10 ngTaq酶1 U

PCR产物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式纯化。纯化的PCR产物用A260测定浓度。

3. λ核酸外切酶反应：

组分体积DDW至50μl10x λ外切酶缓冲液5磷酸化PCR产物100 ngλ 核酸外切酶0-1024 mU

温度时间37℃30分钟4℃保持

4. picogreen荧光检测：

向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：

λ核酸外切酶酶量 (mU)荧光数值1024211.512217.256210.128222.64286.32416.16578.8697.4831.2957.11003.01109

这一结果表明，磷酸化的双链DNA可被λ核酸外切酶降解，且降解程度呈现剂量依赖性。

以λ核酸外切酶活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现这些数据点可以很好地拟合出一条倒S型曲线，如图2所示。

通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：

实验EC50 (mU)111.75212.04311.66411.37

平均值 (U)11.71标准差SD (U)0.24变异系数 CV (%)2.04

因此，这一EC50值可作为本方法的活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的λ核酸外切酶酶量定义为1个荧光法单位（Fluoresence Unit, FU）；1 FU=11.71 mU。

上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。