利用锌指核酸酶敲除人乳头瘤病毒E6E7基因的方法

摘要

本发明涉及基因治疗领域，提供了一种利用锌指核酸酶敲除高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)E6E7基因的方法，其是根据高危型HPV E6E7基因序列，设计靶向特异位点的ZFNs表达载体，靶向切割细胞中HPV E6E7基因序列，进而敲除目的基因，在感染相应亚型HPV的细胞中可以明显的诱导细胞凋亡和增殖抑制，而对其他亚型HPV阳性的细胞和HPV阴性的细胞都无作用。在HPV阳性宫颈癌细胞的皮下瘤模型中转染ZFNs表达载体，能明显的抑制皮下瘤的生长速度，而且使得瘤重减轻。利用锌指核酶靶向敲除高危型HPV E6E7基因的方法，能高效的在DNA水平上破坏病毒癌基因，使得HPV感染细胞发生凋亡和增殖抑制，对于HPV感染相关性疾病特别是宫颈上皮内瘤变等癌前病变有巨大的治疗价值。

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，该公开内容包括针对高危型人乳头瘤病毒E6E7癌基因序列构建靶向的锌 指核酸酶，并利用锌指核酸酶靶向敲除高危型人乳头瘤病毒E6E7癌基因的方法。

背景技术

宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌的最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率居女性恶性肿瘤第二位。在 一些发展中国家其发病率居首位。据国际癌症研究中心估计，每年大约有3,710,200的宫颈癌新发病例， 占所有肿瘤的9.8％，占女性新发病例的15％，其中78％的病例发生在发展中国家。我国地域广阔、人口 众多，根据卫生部全国肿瘤防治研究办公室组织的大规模全国人口死亡原因调查显示，每年有新发病例 约10万，占世界宫颈癌新发病例总数的四分之一。

人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)特别是16亚型、18亚型等高危型HPV的感染是宫颈 癌发生发展最重要的致病原因。HPV通过侵入上皮细胞的基底层细胞并依赖细胞内的复制机制完成自身遗 传物质的复制，这一过程主要依赖于两个重要的病毒早期癌蛋白——E6和E7。E6蛋白通过与p53蛋白 形成复合物诱导p53的泛素化降解；E6蛋白也可以通过直接与p53蛋白结合干扰其DNA结合活性而阻碍 p53基因的转录；E7则靶向灭活RB1家族蛋白并因此激活E2F转录冈子。在E6蛋白和E7蛋白的共同作 用下，最终使得宿主细胞逃逸细胞凋亡，增强细胞增殖。冈此，E6与E7已成为HPV相关肿瘤的预防和基 因治疗的理想靶点。

既往发展的利用靶向于E6和E7的反义RNA技术(Hamada，K等，1996，Gynecologic oncology.63： 219-227)、Ribozymes(核酶)技术(He，Y等，1993，FEBS letters.322：21-24)或小干扰RNA(siRNA) 技术(司马妮等，2008，Apoptosis.13：273-281；王薇等，2010，Cancer letter.291：67-75)等基因 治疗的途径都已被证明能在一定程度上抑制E6和E7蛋白的表达，并逆转宿主细胞的恶性表型。但是， 此类技术只能靶向于已转录的RNA，纵然能在一定程度上抑制相关基因表达为蛋白质，然而DNA水平上的 癌基因依然存在，并没有从根本上去除；此外，稳定性差，给药方式的缺陷等进一步限制了其在体内应用 的潜力(Shillitoe，E.J，2006，Cancer gene therapy.13：445-450)。

锌指蛋白核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)技术是一种可以在活体细胞或组织里对感兴趣的基 因的DNA序列进行定点基因修饰的技术，已经成为一种新兴的靶向基因编辑技术，能从DNA水平上影响基 因的表达。ZFNs是由一个可定制的靶序列特异性的DNA结合域和DNA切割域(主要是非特异性核酸内切 酶FokI)构成的人工合成的融合蛋白质(Kim，Y G等，1996，美国国立科学院院报.93：1156-1160)。应 用这种靶向核酸酶可在预定的DNA位点上通过FokI的二聚体化发挥核酶的切割作用，形成双链DNA的断 裂(double-strand breaks，DSB)。DSB的产生立即启动细胞的自我修复机制以修复DSB。主要的修复机 制有两种：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining， NHEJ)(Chapman，J R等，2012，Molecular cell.47：497-510)。同源重组一般是以另一条姐妹染色单体 为模板进行精确的修复，是一种高保真的修复方式；非同源末端连接是真核生物细胞在不依赖DNA同源序 列的条件下，为避免DNA断裂造成的DNA降解对细胞生存的影响，强行将两个DNA断端直接连接在一起的 特殊的DNA修复机制，这种修复方式极易在修复位点处引入小片段基因的插入或缺失，造成框移突变。而 在哺乳动物细胞中，后一种修复方式又占据着主导作用。因此，应用ZFNs，即可通过在特异的DNA位点上 诱导产生DSB，再借助细胞通过非同源末端连接方式修复，在特异的DNA位点上小片段基因的插入或缺失， 造成框移突变，最终达到基因敲除的目的(图1)。

ZFNs已在细胞系和广泛的生物组织中实现基因修饰。靶向于HBV的ZFNs能有效切割HBV病毒序列 (Cradick，T J等，2010，Molecular Therapy.189：947-954)，在成人T细胞白血病模型中应用靶向于 人T细胞白血病病毒1型(human T cell leukemia virus type 1，HTLV-1)的ZFNs能有效杀灭HTLV-1 感染的细胞(Tanaka，A等，2013，Leukemia.27：1621-1627)。此外，体内外实验已经证实靶向于HIV受 体CCR5的ZFNs能有效的预防HIV-1的感染(Perez，E E等，2008，Nature Biotechnology.26：808-816)， 目前已被FDA批准进行临床II期试验，且临床试验结果证实体内应用ZFNs是有效并且安全无毒的(Tebas， P等，2014，The New England Journal of Medicine.370：901-910)。

针对高危型HPV病毒E6E7癌基因的ZFNs是由本实验室构建合成的，并经过大量的实验对构建的ZFNs 进行了优化和改进，前期的研究结果显示，靶向于高危型HPV16和HPV18的癌基因E6E7基因的ZFNs能有 效的切割E6E7DNA序列，结果导致相应亚型HPV感染阳性的细胞增殖抑制和细胞凋亡。体内实验进一步 证实靶向E6E7的ZFNs能在体内有效的切割E6E7基因序列，并阻止实体瘤的进展。

本发明旨在利用人工构建的靶向于高危型的HPV E6E7基因的ZFNs，诱导相应亚型HPV阳性细胞的增殖 抑制和细胞凋亡，阻断或逆转高危型HPV感染患者宫颈上皮内瘤变Cervical intraepithelial neoplasia， CIN)的病情进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用锌指核酸酶技术敲除高危型人乳头瘤病毒E6E7基因的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用锌指核酸酶敲除人乳头瘤病毒E6E7基因的方法，包括如下 步骤：

1)根据高危型人乳头瘤病毒E6E7基因序列，设计ZFN对，其作用的DNA序列分别为：HPV16和HPV18 E6E7碱基序列(NCBI数据库RefSeq：NC_001526.2和NC_001357.1)

2)构建ZFNs的真核表达载体。由于ZFNs是以二聚体的形式发挥作用(图1)，因此每个作用位点都需 要两个锌指核酶表达元件，以靶向HPV16E7基因603为例，ZFN16-603L和ZFN16-603R两个锌指核酶需要 同时表达才能发挥敲除HPV16E7基因的功能，在构建表达载体的时候可分别构建ZFN16-603L和ZFN16-603R 两个真核表达载体，将两个真核表达载体同时转染到细胞中即可同时表达两个锌指核酶，在HPV16E7基 因603位点处发挥切割作用，进而达到敲除HPV16E7基因的目的。

选定位点后，即可将成对ZFNs构建到表达载体pcDNA3.1+上，通过测序确保碱基序列正确。

3)本发明提供利用锌指核酶特异性的敲除高危型HPV16和HPV18的E6E7基因的方法。所述特异性指 HPV亚型的特异性，以HPV16E6E7基因为例，靶向HPV16E6E7基因的ZFNs仅能特异性的敲除HPV16E6E7 基因，对HPV18以及其他HPV亚型的E6E7基因无敲除作用。

4)本发明提供利用锌指核酶特异性诱导相应HPV亚型阳性细胞的凋亡增加和促进增殖抑制。所述特异 性指HPV亚型阳性细胞的特异性，以靶向HPV16E6E7基因的ZFNs为例，仅能特异性的诱导HPV16阳性的 细胞(如SiHa等)的凋亡增加和增殖抑制，对HPV18阳性的细胞(如HeLa等)和HPV阴性的细胞(如HEK293 等)无促进凋亡和抑制增殖的作用。

5)本发明提供利用锌指核酸酶特异性的抑制动物模型中相应HPV亚型阳性细胞系所构建的皮下瘤的生 长的方法。以靶向HPV16E6E7基冈的ZFNs为例，仅能特异性的抑制SiHa细胞(HPV16阳性)皮下瘤的生 长，对HeLa细胞(HPV18阳性)皮下瘤无抑制作用。

附图说明

图1为锌指核酸酶结合并敲除高危型HPV16或HPV18E6E7基因作用示意图。

图2为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的ZFN16-603诱导SiHa细胞凋亡增加。图中Blank代表未 处理的SiHa细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有FokI切割域，不含有DNA识别结构域)转染后的 SiHa细胞凋亡率，ZFN16-603代表ZFN16-603转染后的SiHa细胞凋亡率。

图3为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的ZFN16-603未能诱导HeLa细胞凋亡增加。图中Blank代 表未处理的HeLa细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有FokI切割域，不含有DNA识别结构域)转染后 的HeLa细胞凋亡率，ZFN16-603代表ZFN16-603转染后的HeLa细胞凋亡率。

图4为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的ZFN16-603未能诱导HEK293细胞凋亡增加。图中Blank 代表未处理的HEK293细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有FokI切割域，不含有DNA识别结构域)转 染后的HEK293细胞凋亡率，ZFN16-603代表ZFN16-603转染后的HEK293细胞凋亡率。

图5为实施例中裸鼠皮下瘤内应用ZFN16-603能抑制SiHa细胞皮下瘤的生长。图中横坐标标示时间 为开始瘤内注射ZFN16-603后的时间。0代表第一次瘤内注射ZFN16-603的时间，以后每3天瘤内注射一 次，同时测量瘤体的长短径并计算瘤体体积。

图6为实施例中裸鼠皮下瘤内应用ZFN16-603共计18天后的皮下瘤图片。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本实施例中使用的引物设计均使用Primer3Plus在线引物设计工具完成，合成由武汉擎科创新生 物科技有限公司；构建所使用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒 均购自美国Fermentas公司。

例1.ZFN16-603表达载体的构建

HPV16的E6E7癌基因序列信息从NCBI网站中获得，将序列导入到在线设计工具ZiFiT (http：//zifit.partners.org/ZiFiT/)中，完成设计。挑选出靶向于第603碱基的ZFNs对，命名为 ZFN16-603。其靶向的DNA序列为：

ZFN16-603：CAG AGG AGG AGG ATGAAA TAG ATG GTC CAG

下划线部分为锌指蛋白结合序列，中间部分为FokI内切酶的切割位点。对应的ZFNs表达载体分别命 名为ZFN16-603F和ZFN16-603R。

锌指核酶的表达载体构建方法参考Wright，D A等，Nature Protocol杂志，(2006)1：1637-1652， 构建使用载体为pcDNA3.1+(美国Invitrogen公司，货号：V790-20)。

构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提 取质粒。

例2.ZFN16-603诱导细胞凋亡

靶向于HPV16E6E7的ZFN16-603转染到细胞后表达出来的锌指核酶，可以迅速的识别并与靶序列结 合，再发挥切割作用，使其在靶点处产生DSB，DSB启动细胞利用易错的NHEJ修复机制进行修复；由于修 复时引起的碱基插入或缺失导致密码子的框移突变，最终使得HPV16E6E7蛋白的表达受到抑制。而E6E7 蛋白可通过一系列的机制使得宫颈癌细胞增殖能力增强并逃逸凋亡，E6E7蛋白的表达受到抑制后，细胞的 增殖能力下降，凋亡增加。另一方面，ZFN16-603仅能特异性的识别并结合HPV16E6E7序列，不能识别其 他亚型如HPV18的E6E7序列。因此，ZFN16-603仅能引起HPV16阳性细胞的凋亡(如SiHa细胞)，而对 HPV18阳性的细胞(如HeLa细胞)和HPV阴性的细胞(如HEK293细胞)等无此作用。

具体操作方法是：

(1)细胞的准备

HPV16阳性宫颈癌细胞系SiHa、HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa和人胚肾细胞系HEK293用含有10％血 清的DMEM完全培养基在37℃、5％C02培养箱里培养。待细胞融合度达到80％时用0.25％的胰酶消化后， 用DMEM完全培养基终止消化，接种到12孔板中，继续培养24小时。

(2)表达质粒的共转染

24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到70％，即可进行转染。每孔转染500ng ZFN16-603F 和500ng ZFN16-603R(共计1μg)，使用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000转染试剂按照说明书要 求进行转染，以等量的空载体(共计1μg)作为阴性对照。转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养箱中培 养。

(3)转染质粒后细胞凋亡的检测

转染48小时后，相差显微镜下观察可发现转入ZFN16-603F+ZFN16-603R的SiHa细胞有大量的变圆漂 起(提示细胞凋亡)，而同样转入ZFN16-603F+ZFN16-603R的HeLa和HEK293细胞无此现象。使用0.25％ 的胰酶消化后，收集细胞，常温条件下300g离心5分钟，PBS洗涤一次，再常温条件下300g离心5分 钟。使用南京凯基生物的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号：KGA-107)BD公司的FACSCalibur 流式细胞仪检测细胞凋亡。

试验结果显示，转入ZFN16-603处理的SiHa细胞凋亡率达到50％，而转入等量空载体的SiHa细胞凋 亡与未处理的SiHa细胞相比无明显差别，均在5％左右。转入ZFN16-603的HeLa细胞凋亡率未见明显增加， 与转入等量空载体的和未处理的HeLa细胞的凋亡率基本持平，均在10％以下。同样，转入ZFN16-603或等 量空载体的HEK293细胞也未见明显的凋亡增加。

例3.ZFN16-603的切割效率验证

锌指核酶在细胞内发挥作用后切割形成DSBs，诱导细胞利用易错的NHEJ修复方式进行修复。修复后 在靶向位点处造成碱基的插入或缺失，进而引起框移突变，达到基因敲除的目的。此时，这种错误修复的 碱基序列若与正常的(野生型的)碱基序列进行退火延伸，即可形成杂交双链，这种杂交双链在原位点处 就会发生碱基的错配(与修复后的碱基插入或缺失相对应)，再利用能识别并切割序列中这种错配碱基的 T7Endonuclease I(New England Biolabs公司，货号：M0302S)进行处理，即可间接的反映ZFN的切割 效率。由于转染效率的限制，成功转入后的细胞被ZFN16-603有效的切割，而未成功转染的细胞基因组中 HPV E6E7序列未受影响。因此，提取转染后的细胞总基因组DNA，再经PCR扩增，产物中即可同时获得含 有错误修复的序列片段和未受影响的野生型的序列片段，与野生型序列片段相比，切割后修复的片段在靶 点处存在数个碱基或者小片段的插入或缺失突变，将此种混合产物进行退火再延伸，即可产生特殊的杂交 双链，这种双链在切割位点处存在碱基错配，可以通过T7 Endonuclease I内切酶识别这种错配并将其切 断而形成两个小片段产物。

本试验具体实施方法如下：

(1)细胞的转染及细胞基因组DNA的提取

将设计的针对HPV16 E6E7的ZFN16-603表达质粒转入到SiHa中(转染体系：十二孔板，每孔转入 500ng+500ng，总量1μg，转染方法同实施例2)，转染48小时后，0.25％的胰酶消化，用DMEM完全培养基 终止消化，常温300g离心5分钟，弃除培养基，PBS洗涤一次，300g离心5分钟，再用细胞基因组提取试 剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号：DP304)提取细胞基因组DNA。

(2)引物的设计

根据HPV16 E6E7基因序列设计引物，引物两端跨靶点(产物长度控制在400～500bp效果最好，并且 靶点距离两段的距离应当差别50bp以上以便在凝胶电泳时能有效的区分切开的两个小片段)。本实施例中 与ZFN16-603相对应的引物序列为：

603F：caaaagccactgtgtcctga

603R：ggggcacacaattcctagtg

设计PCR产物长度约400bp，引物两端距离ZFN16-603切割位点的长度分别约150bp和250bp。

(3)PCR反应及PCR产物的纯化。以上述提取的ZFN16-603转染后的SiHa细胞基因组DNA为模板进行 PCR，将PCR产物纯化回收后定量备用。

(4)T7Endonuclease I酶切反应及聚丙烯凝胶电泳

取200ng纯化PCR产物进行如下反应：

反应体系：

反应条件：

反应完成后，再加入1μLT7 Endonuclease I，快速震荡混匀，37℃孵育15分钟，加入2μL0.25M  EDTA溶液终止反应。

再取10μL反应产物进行5％聚丙烯凝胶电泳，结果显示靶向于HPV16 E6E7的ZFN表达质粒转入到SiHa 细胞后可以明显的切割细胞中E6E7基因序列，再利用Image J软件计算电泳条带的灰度值即可估算出具 体的切割效率，试验结果显示，ZFN16-603在SiHa细胞中的切割效率可达40％。

例4.ZFN16-603对细胞增殖的影响

(1)将处于对数生长期的SiHa、HeLa、HEK293细胞用0.25％胰酶消化，含10％胎牛血清的DMEM完全培 养基终止消化，计数，接种于96孔板，共5块孔板，每块孔板上每种细胞设3组，每组5个复孔，每孔 细胞数5,000个，继续在37℃、5％CO₂培养箱里培养。

(2)转染24h后，转染ZFN16-603表达质粒或等量空载体表达质粒，转染混合物的配制方法同实施例2 所述。96孔板中每孔加入完全培养基100μL，转染混合物加入量为20μL(对应质粒总量为0.4μg)， 共转染4块孔板。

(3)将第5块孔板里每孔(100μL培养基)加入CCK-8试剂(日本东仁化学科技公司，货号：CK04) 10μL，另选5个无细胞孔，每孔加100μL培养基和CCK-8试剂10μL，作为检测时的Blank对照。37 ℃避光培养2h后在多功能酶标仪检测490nm处的吸光度值(第0d数据)，记录数据，并计算平均值 及标准差。

(4)第2天同一时间，取一块96孔板，处理方式同(3)，得到1d数据。以此类推，分别于第3、4、 5天检测490nm处的吸光度值获得第2d、3d、4d的数据。由于长时间的培养会消耗培养基，因此在第2天 以后应注意更换培养基，以保证加入CCK-8前的液体总量为100μL。

(5)汇总数据，计算出增殖抑制率。结果显示，ZFN16-603仅特异性的抑制SiHa细胞的增殖，而对HeLa、 HEK293细胞的增殖无影响。

例5.皮下瘤内注射ZFNs的抑制试验

(1)准备肿瘤细胞

HPV16阳性宫颈癌细胞系SiHa用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％CO₂培养箱里培养。待 细胞融合度达到80％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，将细胞收集到15mL离心管 中，300g离心5分钟，弃去上清，用细胞用PBS重悬，再次300g离心5分钟，弃去上清，用细胞用PBS 重悬，计数细胞密度。

(2)皮下瘤模型

4-5周龄的BALB/c-nude裸鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司，于华中科技大学同济医学院 动物实验中心SPF级动物房中饲养)。分别在每只BALB/c-nude裸鼠臀部接种1×10⁷个SiHa或5×10⁶个 HeLa细胞，继续饲养等待皮下瘤的生长

(3)待接种15-20天后裸鼠皮下瘤长到约100～150mm³时，进行瘤内转染。取50μL 5％的葡萄糖溶液， 加入10μg的ZFN16-603(5μg ZFN16-603F+5μgZFN16-603R)表达质粒，混匀。加入1.2μLTurboFect in vivo转染试剂(购自Fermentas公司，货号：R0541)，混匀，室温下孵育15～20分钟后将转染混合物 直接注射到皮下瘤内。同样方式下转染等量空载体质粒作为阴性对照，转染每3天1次，共6次。每次处 理前用游标卡尺测量瘤体大小。

(4)皮下瘤注射18天后，BALB/c-nude裸鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠溶液麻醉后处死，取出皮下瘤，称 重。结果发现，瘤内注射转染ZFN16-603后，SiHa细胞皮下瘤生长速度明显变缓，而作为对照的转染等量 空载体后的SiHa细胞皮下瘤生长速度未见明显影响。瘤体称重结果显示转染ZFN16-603后的SiHa细胞皮 下瘤的重量明显轻于对照组皮下瘤。