利用MicroRNA156及其靶基因调控植物挥发油含量的方法

摘要

本发明涉及利用MicroRNA156及其靶基因调控植物挥发油或其中倍半萜含量的方法。首次揭示一种调控植物挥发油或其中倍半萜类物质合成的关键基因——Squamosa启动子结合蛋白基因(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPLs)，该基因是miR156的靶基因。SPLs通过直接与倍半萜合酶启动子结合激活其转录；并通过转基因技术，证实该机制在多种植物中发挥作用，可基于此获得高产植物挥发油的植物。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及利用MicroRNA156及其靶基因调控植物挥发油或其中倍半萜含量的方法。

背景技术

植物挥发油(精油)是具有一定挥发性的油状液体的统称，是植物芳香物质的提取物。含挥发油的中草药非常多，亦多具芳香气味，尤以唇形科(薄荷、紫苏、藿香等)、伞形科(茴香、当归、芫荽、白芷、川芎等)、菊科(艾叶、茵陈篙、苍术、白术、木香等)、芸香科(橙、桔、花椒等)、樟科(樟、肉桂等)、姜科(生姜、姜黄、郁金等)等科更为丰富。植物挥发油成分复杂，主要由萜类化合物构成，芳香族化合物次之，还包含少量的脂肪酸衍生物。其中萜类化合物又分为单萜、倍半萜以及少量的二萜，常见的如薄荷中的薄荷酮、广藿香中的广藿香醇等。挥发油大多具有抑菌杀毒、凝神静气、解热镇痛、矫味定香等作用，在医药、食品、日化用品等方面应用广泛。目前植物挥发油的研究主要集中在提取工艺优化、化学成分分析以及精油成分的生物活性研究等方面，挥发油合成途径的转录调控研究很少。

模式植物拟南芥开花后，花序会释放以单萜和倍半萜为主的挥发性成分，其中大部分倍半萜由TPS21和TPS11两个倍半萜合酶催化合成，其中TPS21主要催化法尼基焦磷酸合成石竹烯，它们在拟南芥花器官特异表达，而在叶片中几乎不表达(Chen，F.等(2003).The Plant cell15，481-494；Tholl，D.等(2005).The Plant journal:for cell and molecular biology42，757-771)。推测植物发育因子在调控植物萜类合成的时空特异性方面发挥重要作用。拟南芥中最近的研究表明SPL9通过破坏花青素合成的转录激活复合体MYB-bHLH-WD40抑制了拟南芥中花青素的积累。

广藿香(Pogostemon cablin)是唇形科多年生草本植物，所产生的广藿香精油被广泛应用于香料及医疗行业。与其它唇形科植物产生的混合型精油不同，广藿香精油主要是由倍半萜构成(Deguerry，F.等(2006).Archives ofbiochemistry and biophysics454，123-136)。广藿香精油包含约24种倍半萜(Buré，C.M.等(2004).Journal of Essential Oil Research16，17-19)，其中广藿香醇((-)-patchoulol)约占35%，是其重要组分。广藿香醇香味持久、独特宜人是良好的定香剂，目前作为天然香料被广泛用于日化产品中。此外，广藿香醇还具有抑制真菌繁殖，驱除和毒杀白蚁的作用。广藿香醇合酶(patchoulol synthase，PTS)是一个多功能酶，负责合成广藿香叶片提取物中广藿香醇以及其它13种倍半萜产物(Deguerry et al.，2006)。

本领域有必要对植物挥发油在植物中等产生机制进行有效研究，并基于此改进植物中植物挥发油有效成分的含量。

发明内容

本发明的目的在于提供利用MicroRNA156及其靶基因调控植物挥发油或其中倍半萜含量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种调节植物(如芳香植物)挥发油或其中的倍半萜含量的方法，所述方法包括：调节植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达。

在一个优选例中，所述的调节植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达是：上调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，从而提高植物挥发油或其中的倍半萜含量。

在另一优选例中，所述的上调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达包括：将Squamosa启动子结合蛋白基因转化植物，获得过表达Squamosa启动子结合蛋白基因的转基因植物，所述的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量提高。

在另一优选例中，所述的将Squamosa启动子结合蛋白基因转化植物包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有Squamosa启动子结合蛋白基因的表达盒；

(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及

(d)将步骤(c)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

在另一优选例中，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因(SPL)是miR156靶向的Squamosa启动子结合蛋白基因；更佳地，选自：SPL3，SPL4，SPL5，SPL9，SPL15，SPL2，SPL10，SPL11，SPL6，SPL13A，SPL13B。

在另一优选例中，所述的SPL9基因选自：(a)At2g42200所示核苷酸序列的多核苷酸；或(b)核苷酸序列在严格条件下能够与(a)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白具有At2g42200编码的蛋白同样功能的多核苷酸；(c)核苷酸序列与(a)限定的多核苷酸序列有70%以上(较佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上)相同性且编码的蛋白具有At2g42200编码的蛋白同样功能的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的SPL10基因选自：(a’)AT1G27370所示核苷酸序列的多核苷酸；或(b’)核苷酸序列在严格条件下能够与(a’)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白具有AT1G27370编码的蛋白同样功能的多核苷酸；(c’)核苷酸序列与(a’)限定的多核苷酸序列有70%以上(较佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上)相同性且编码的蛋白具有AT1G27370编码的蛋白同样功能的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的上调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达包括：将下调miR156表达的抑制分子转化植物，通过下调miR156来上调Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，获得的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量提高。

在另一优选例中，所述的下调miR156表达的抑制分子是MIM156或其活性片段(发挥抑制作用的关键位点片段)；较佳地，所述的MIM156的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的MIM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ IDNO:2中第237-256位所示。

在另一优选例中，所述的调节植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达是：下调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，从而降低植物挥发油或其中倍半萜含量。

在另一优选例中，所述的下调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达包括：将Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子转化植物，获得Squamosa启动子结合蛋白基因表达受抑制的转基因植物，所述的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量降低。

在另一优选例中，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子是miR156f；较佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO:1中第82-101位所示核苷酸序列；所述的miR156f前体具有SEQ ID NO:1或其中第82-171位所示核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)：十字花科植物(如拟南芥)，唇形科植物(如广藿香，薄荷，罗勒)，伞形科植物，菊科植物，芸香科植物，樟科植物，姜科植物，禾本科植物，茄科植物。

在另一优选例中，所述的倍半萜包括(但不限于)：石竹烯，广藿香醇，β-广藿香烯，γ-广藿香烯，α-广藿香烯，β-榄香烯，α-愈创木烯，4,11-愈创木二烯，α-布藜烯。

在本发明的另一方面，提供Squamosa启动子结合蛋白的用途，用于提高植物挥发油或其中倍半萜含量。

在本发明的另一方面，提供下调miR156表达的抑制分子的用途，用于提高植物挥发油或其中倍半萜含量。

在一个优选例中，所述的下调miR156表达的抑制分子是MIM156或其活性片段；较佳地，所述的MIM156的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的MIM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。

在本发明的另一方面，提供Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子的用途，用于降低植物挥发油或其中倍半萜含量。

在一个优选例中，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子是miR156f；较佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO:1中第82-101位所示核苷酸序列；所述的miR156f前体具有SEQ ID NO:1或其中第82-171位所示核苷酸序列。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、miR156f、rSPLs(以SPL10为例)的双元植物表达载体构建示意图。

A、截取miR156f基因组中包含前体序列(下划线标出)共计276bp长的片段构建Pro35S:MIR156f双元载体。

B、将SPL10基因cDNA中miR156靶位点的核苷酸序列进行同义突变。单下划线：SPL10基因中原始miR156靶位点的核苷酸序列；方框：靶位点的核苷酸序列对应的氨基酸序列；黑色：SPL10基因中miR156靶位点突变后的核苷酸序列。

C、PCR突变SPL10中miR156靶位点的核苷酸序列示意图。P1(S)和P2(AS)为片段全长序列。P3(AS)为突变位点上游反向引物。P4引物5’端15-20bp与引物P3互补，3’端20bp左右与突变位点下游序列互补，中部为突变后序列。

图2、TPS21受miR156调控。其中，thujopsene：罗汉柏烯；trans-β-Caryophyllene（Caryophyllene）：石竹烯；n-Nonyl acetate：乙酸壬酯。

A和B、GC-MS检测Pro35S:MIR156和Pro35S:MIM156植物花序中倍半萜含量。**代表P<0.01，*代表P<0.05，即与野生型拟南芥相比具有显著差异。

C、Pro35S:MIR156和Pro35S:MIM156植物花序中TPS21、TPS11表达水平qRT-PCR检测。

图3、miR156靶基因SPLs激活TPS21表达。

A、qRT-PCR检测TPS21在Pro35S:rSPL3、ProSPL9:rSPL9、Pro35S:rSPL10花序中表达。

B、qRT-PCR检测TPS21在诱导体系ProAlcA:MIR156f和ProSPL9:rSPL9-GR植物中的瞬时表达水平。

C-E、ProTPS21:GUS在野生型(C)、Pro35S:MIR156(D)、Pro35S:MIM156(E)背景下花序的GUS染色结果。Bar=1cm。

图4、SPL9直接结合TPS21启动子。

A、TPS21上游1376bp片段包含SPL蛋白结合位点GTAC(以黑色三角标注)示意图。cis1、cis2、cis3代表用于EMSA实验的3个片段；I、II、III、IV代表ChIP实验中Real-time扩增片段位置。

B、体外EMSA验证SPL9与TPS21启动子结合。上行是不同浓度HIS–SPL9融合蛋白(0、30、90ng)分别与Cy5标记的cis1、cis2、cis3以及负对照kasO启动子片段结合实验；下行是cis1、cis3分别与各自未标记的冷探针的竞争实验。

C、体内ChIP富集实验证明GFP-rSPL9蛋白结合TPS21启动子。收集生长4周的ProSPL9:GFP-rSPL9和野生型对照的花序作为ChIP实验材料。TPS21启动子不同区域富集倍数计算：首先以GFP抗体沉淀得到DNA中基因丰度比加HA抗体沉淀得到DNA中基因丰度，再以ProSPL9:GFP-rSPL9植物中该比值比野生型植物中该比值。

图5、转基因广藿香阳性植株筛选。

A、qRT-PCR检测SPL10在Pro35S:rSPL10叶片中表达。以空质粒转基因广藿香为对照组，以广藿香Pat18S(EF529587)作为内标基因。“L+数字”表示相应转基因株系中不同植株编号，后续同。

B、qRT-PCR检测Pro35S:MIR156转基因广藿香叶片中成熟miR156水平。以空质粒转基因广藿香为对照组，以广藿香Pat18S(EF529587)作为内标基因。

图6、转基因广藿香阳性植株中PTS表达水平检测。

A、qRT-PCR检测PTS在Pro35S:rSPL10叶片中表达。以空质粒转基因广藿香为对照组，以广藿香Pat18S(EF529587)作为内标基因。

B、qRT-PCR检测Pro35S:MIR156转基因广藿香叶片中PTS水平。以空质粒转基因广藿香为对照组，以广藿香Pat18S(EF529587)作为内标基因。

图7A-B、miR156靶向的SPL基因调控广藿香精油成分的合成。n-Nonylacetate：乙酸壬酯；β-patchoulene：β-广藿香烯；β-elemene：β-榄香烯；trans-β-caryophyllene：石竹烯；α-guaiene：α-愈创木烯；α-patchoulene：α-广藿香烯；γ-patchoulene：γ-广藿香烯；guai-4,11-diene：4,11-愈创木二烯；α-bulnesene：α-布藜烯；(-)-patchoulol：广藿香醇；pogostone：广藿香酮。

图8、一月大T1代转基因广藿香叶片中PTS表达水平和广藿香醇含量检测。

A、qRT-PCR检测PTS在Pro35S:rSPL10和Pro35S:MIR156f转基因植物叶片中表达。空质粒转基因广藿香为对照组，广藿香Pat18S(EF529587)作为内标基因。

B、Pro35S:rSPL10、空质粒、Pro35S:MIR156f叶片中广藿香醇含量检测。首先与内标相比，然后除以样品鲜重，得出百分比。^**代表P<0.01，^*代表P<0.05，即与空质粒转基因广藿香相比具有显著差异。

图9、扫描电镜检测广藿香叶片表皮毛。

A、广藿香叶片三种表皮毛：非腺毛(左)、头状腺毛(中)、盾状腺毛(右)扫描电镜图。

B-C、广藿香近轴面B和远轴面C叶片表皮毛扫描电镜图。

D、广藿香近轴面和远轴面叶片表皮毛密度统计结果。**代表P<0.01，*代表P<0.05，即与空质粒转基因广藿香相比具有显著差异。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种调控植物挥发油或其中倍半萜类物质合成的关键基因——Squamosa启动子结合蛋白基因(SQUAMOSAPROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPL(s))，该基因是miR156的靶基因。SPL通过直接与倍半萜合酶启动子结合激活其转录；并通过转基因技术，证实该机制在多种植物(包括香料植物)中发挥作用，可基于此获得高产植物挥发油的植物。

如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：十字花科植物、唇形科植物等。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科鼠耳芥属植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)，唇形科广霍香属植物如广藿香(Pogostemoncablin)。较佳地，所述的“植物”为香料植物，例如但不限于唇形科薄荷和罗勒、禾本科的柠檬香茅、茄科的番茄等。所述的植物适合进行基因的转化操作。

本发明人以拟南芥为模式植物，发现拟南芥miR156靶基因SPL9直接结合TPS21启动子，并激活TPS21转录，从而使TPS21催化产物石竹烯成为拟南芥花序的主要挥发成分，含量翻倍。广藿香(学名Pogostemon cablin)是唇形科植物，多年生草本直立植物，有香气；拟南芥miR156靶基因SPL10能够提高广藿香中PTS转录水平，从而提高了广藿香精油重要组分广藿香醇及大部分倍半萜成分的含量(如广藿香醇及其他8种PTS催化的倍半萜产物)。本发明的研究结果提示，miR156靶基因SPLs同样调控了十字花科(拟南芥)和唇形科(广藿香)的其他香料作物，甚至伞形科、菊科、芸香科、樟科、姜科等的作物中植物挥发油含量，提供了通过基因工程改进作物中植物挥发油含量的方法。

在本发明中，“Squamosa启动子结合蛋白(SPL)”指具有提高植物挥发油或其中倍半萜含量功能的多肽。较佳地，所述的SPL是编码基因受到miR156调控的一类SPL。例如，拟南芥中，miR156可调控11个SPL靶基因，进一步分为SPL3/4/5，SPL9/15，SPL2/10/11和SPL6/13A/B共4个分枝。作为本发明的优选方式，所述的SPL是SPL9或SPL10；所述的SPL9可以具有At2g42200所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或变异体；所述的SPL10可以具有AT1G27370所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或变异体。

本发明还包括具有与SPL蛋白相同功能的、SPL蛋白的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SPL蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明还包括SPL蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SPL蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种SPL蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，SPL蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的SPL蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长SPL蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长SPL蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SPL蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗SPL蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SPL蛋白或其片段的融合蛋白。

任何与所述的SPL蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性95%，98%或99%)的、且具有SPL蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

本发明还涉及编码本发明SPL蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码多肽的多核苷酸(编码基因)”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还包括与本发明的核苷酸序列具有70%以上，更优选80%以上，更优选90%以上，最优选95%以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO:1所示序列相同的调控作用。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。

应理解，虽然本发明的SPL基因优选获自十字花科植物，但是获自其它植物的与拟南芥SPL基因高度同源(如具有70%以上，如80%，85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它SPL基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或SPL基因工程产生的宿主细胞。

SPL基因可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得植物挥发油性状发生改变的植物。

本发明的SPL基因可由组织特异启动子驱动，特异性表达。所述的特异启动子可以是外源(异源)的。对所述特异启动子的核酸序列没有特别的限制(如一种结构性核酸序列)，例如某些在农业或植物改良上具有重要器官特异性的启动子。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子序列和目的基因(可操作地连接)的表达载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥，广藿香。

本发明提供了所述的SPL蛋白或SPL基因的用途，用于提高植物挥发油或其中倍半萜含量。

本发明还涉及SPL的上调剂或下调剂及其用途。由于SPL的上调剂或下调剂可调节SPL的表达和/或调节SPL的活性等，因此，所述的SPL的上调剂或下调剂也可通过对SPL的影响来调节植物挥发油或其中倍半萜含量，从而达到改良植物的目的。

任何可提高SPL蛋白的活性、提高SPL蛋白的稳定性、促进SPL蛋白的表达、延长SPL蛋白有效作用时间、或促进SPL的转录和翻译的物质均可用于本发明，用于提高植物挥发油或其中倍半萜含量。任何可降低SPL蛋白的活性、降低SPL蛋白的稳定性、抑制SPL蛋白的表达、减少SPL蛋白有效作用时间、或降低SPL的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为SPL的下调剂、拮抗剂或抑制剂(即：下调SPL蛋白表达的物质)，如抗所述SPL蛋白的抗体，干扰所述SPL蛋白的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于通过下调SPL的表达，降低植物挥发油或其中倍半萜含量。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中SPL基因的表达。

一方面，本发明还提供了一种提高植物挥发油或其中倍半萜含量的方法，所述的方法包括：上调所述植物中SPL基因的表达(包括使SPL基因过表达)。

在得知了所述的SPL蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的SPL蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带SPL基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的SPL蛋白。

此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低SPL基因的表达或使之缺失表达，比如将靶向SPL基因的miRNA或携带反义SPL基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达SPL基因。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：(1)将外源的SPL基因转入植物组织、器官或组织，获得转化入SPL基因的植物细胞、组织、器官或种子；和(2)将步骤(1)获得的转入了外源SPL基因的植物组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SPL基因；(s2)将植物组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使SPL基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(s3)选择出转入SPL基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

作为另一种优选方式，鉴于SPL基因是miR156的靶基因，可通过下调miR156来上调SPL基因的表达。可下调miR156的抑制分子例如是MIM156。

其它增加SPL基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强SPL基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该SPL基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

优选的，还提供了一种降低植物中SPL基因的表达的方法，所述的方法包括：(1)将SPL基因表达抑制分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所述表达抑制分子的植物组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述表达抑制分子的植物组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述的表达抑制分子是miR156f。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了SPL基因或其同源基因的转基因植物；或者SPL蛋白表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、拟南芥miR156和SPL10基因的分离

依据拟南芥信息资源网站(The Arabidopsis Information Resource，TAIR)网站上AT5G26147(miR156f)的基因组序列信息，序列是(SEQ ID NO:1)：TGGCTAGGGTTTATAGATGTATGTGATATTAAGAGATATGAAACATATTTGTCGACGGTTTGAGTGGTGAGGAATTGATGGTGACAGAAGAGAGTGAGCACACATGGTGGCTTTCTTGCATATTTGAAGGTTCCATGCTTGAAGCTATGTGTGCTCACTCTCTATCCGTCACCCCCTTCTCTCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTACAGCATTTCATTTAGTTTTTAGAGTTAAACATTTTGATTTTGATTTTTACATCCATTCTTTTGGTTT。

合成引物miR156-F-BamHI、miR156-R-SacI，PCR扩增得到拟南芥miR156f基因组部分序列(图1A)；根据AT1G27370(SPL10)序列信息，合成引物SPL10-F、SPL10-R，PCR扩增得到编码拟南芥SQUMOSA PROMOTER BINDINGPROTEIN LIKE基因SPL10序列。将miR156f和SPL10的PCR扩增片段TA克隆到pMD18-T载体中，测序正确后作为模板。

表1、载体构建及qRT-PCR引物列表

实施例2、miR156f和SPL10基因的双元载体构建

首先用高保真酶扩增CaMV35S启动子，两端引入HindIII/PstI位点，经酶切连入pCAMBIA2301(Cambia公司)相应位点中，构建pCAMBIA2301-35S。然后将测序后pMD18-T载体中的miR156f的基因片段经BamHΙ和SacΙ酶切后，引入到pCAMBIA2301-35S多克隆位点BamHΙ和SacΙ之间，从而获得Pro35S:MIR156f双元载体。

通过两轮PCR进行SPL10中miR156剪切序列突变(不改变所编码的氨基酸种类)，从而形成抗miR156剪切的rSPL10(图1B和C)：第一轮PCR以高保真酶扩增突变位点两侧片段，以pMD18-T载体中的SPL10的基因片段为模板，引物为SPL10-F和SPL10-P3-R，SPL10-P4-S和SPL10-R。割胶回收2个PCR产物，各取0.1μL共同作为第二轮PCR模版，引物是SPL10-F和SPL10-R。PCR扩增片段TA克隆到pMD18-T载体中，测序正确后作为模板，通过SPL10-F-BamHI和SPL10-R-SacI引物在片段两端引入BamHΙ和SacΙ位点，通过酶切连接克隆到pCAMBIA2301-35S多克隆位点BamHΙ和SacΙ之间，从而获得Pro35S:rSPL10双元载体。Pro35S:rSPL3、ProSPL9:rSPL9双元载体构建参照Pro35S:rSPL10双元载体的构建方法。

MIM156序列(SEQ ID NO:2，其中下划线是发挥抑制作用的序列)：

TCAAACACCACAAAAACAAAAGAAAAATGGCCATCCCCTAGCTAGGTGAAGAAGAATGAAAACCTCTAATTTATCTAGAGGTTATTCATCTTTTAGGGGATGGCCTAAATACAAAATGAAAACTCTCTAGTTAAGTGGTTTTGTGTTCATGTAAGGAAAGCGTTTTAAGATATGGAGCAATGAAGACTGCAGAAGGCTGATTCAGACTGCGAGTTTTGTTTATCTCCCTCTAGAAAATGCTCACTTCTATCTTCTGTCAAGCTTCGGTTCCCCTCGGAATCAGCAGATTATGTATCTTTAATTTTGTAATACTCTCTCTCTTCTCTATGCTTTGTTTTTCTTCATTATGTTTGGGTTGTACCCACTCCCGCGCGTTGTGTGTTCTTTGTGTGAGGAATAAAAAAATATTCGGATTTGAGAACTAAAACTAGAGTAGTTTTATTGATATTCTTGTTTTTCATTTAGTATCTAATAAGTTTGGAGAATAGTCAGACCAGTGCATGTAAATTTGCTTCCGATTCTCTTTATAGTGAATTCCTCTTA

SPL9序列见At2g42200。SPL3序列见At2g33810。

Pro35S:MIM156：参见The Plant Cell，Vol.23:1512-1522，April2011。

Pro35S:rSPL3：参见The Plant Cell，Vol.23:1512-1522，April2011。

ProSPL9:rSPL9：参见The Plant Cell，Vol.23:1512-1522，April2011。

拟南芥的转基因过程：采用冻融法将上述构建的质粒转入农杆菌GV3101(购自Invitrogen公司)。然后将阳性克隆通过采用农杆菌介导的花芽浸泡法(Floral Dip)转入到盛花期的野生型拟南芥中。T₀代种子经0.8%琼脂的1/2MS抗性培养基(含50μg/ml Kan)筛选，阳性转基因小苗(T1代)移栽到营养土中温室培植。通过上述方法，分别获得转基因植株Pro35S:MIR156f、Pro35S:MIM156、Pro35S:rSPL3、ProSPL9:rSPL9、Pro35S:rSPL10。

实施例3、miR156调控拟南芥花序中倍半萜合成

拟南芥花序释放挥发性物质，其中60%是单萜和倍半萜，而倍半萜又占花序挥发性萜类的95%。很多萜类的合成具有时空特异性，由于miR156在植物生长发育和时相转换中发挥了重要作用，本发明人首先通过GC-MS(gaschromatography-mass spectrum)分析了过表达miR156(Pro35S:MIR156f)和模拟miR156(Pro35S:MIM156)花序中挥发性倍半萜含量。

取5周左右的拟南芥花序约100朵，放入英国Markes的微池热萃取仪μ-CTE(预先进行温度及载气平衡)中插入样品收集吸附管(Tenax TA，C-T9TNX-2S)，42℃下，氦气流速50ml/min，萃取30min。将样品收集吸附管插入连接有气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的TD100热脱附仪进行热解析进样分析。

本发明人发现，(E)-β-caryophyllene在Pro35S:MIR156f中几乎检测不到，而在Pro35S:MIM156中含量提高(图2A和B)，提示miR156影响了拟南芥倍半萜合成。

提取Pro35S:MIM156、Pro35S:MIR156及野生型拟南芥花序RNA：取7朵拟南芥花序，用液氮破碎成细粉。移入1.5ml离心管中，加入0.5mLTrizol(Invitrogen，Cat.15596-018)混匀，室温放置5min；加入100μL三氯甲烷充分混匀后12000rpm冷冻离心10min。取上清，加入等体积异丙醇沉淀RNA。12000rpm冷冻离心10min，沉淀用75%(v/v)酒精洗涤，真空干燥，溶于20-50μL H₂O(RNase free)。取1μg花序总RNA为模板依据M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen)说明进行反转录。反转录产物稀释10倍后作为定量分析的模板，采用Premix ExTaq^TM试剂盒(TaKaRa)进行qRT-PCR检测。以β-TUBULIN2(AT5G62690)为内参基因。

TPS11和TPS21是两个主要在花序高表达的倍半萜合酶基因，本发明人研究发现：TPS21转录本在Pro35S:MIM156植物中提高而在Pro35S:MIR156中显著降低；然而另一个重要的多产物倍半萜合酶基因，TPS11，其表达似乎不受miR156影响(图2C)。与转录水平一致，TPS21的主要催化产物(E)-β-caryophyllene的挥发量在Pro35S:MIR156花序中明显降低而在Pro35S:MIM156中增多(图2A和B)。相比之下，TPS11的催化产物Thujopsene的挥发量在Pro35S:MIR156和Pro35S:MIM156花序中均没有明显变化，尽管Thujopsene在野生型植物花序的挥发物中含量较低(图2A和B)。由这些结果提示，miR156通过调控TPS21的表达影响拟南芥花序中倍半萜(E)-β-caryophyllene的合成。

实施例4、miR156靶基因SPLs直接激活TPS21转录

拟南芥基因组中共有17个SPL基因，其中11个受miR156调控，这11个靶基因可进一步分为SPL3/4/5，SPL9/15，SPL2/10/11和SPL6/13A/B共4个分枝。本发明人分析了TPS21在抗miR156剪切的SPL(rSPL)转基因植物(Pro35S:rSPL3、ProSPL9:rSPL9、Pro35S:rSPL10)花序中的表达。结果显示各转基因植物中TPS21转录本都有不同程度的上升，其中以过量表达rSPL9最为显著(图3A)，说明miR156靶向的SPL基因特别是SPL9正向调控TPS21转录。

为了阐明SPL9是否直接调控TPS21表达，本发明人引入了瞬时诱导体系(ProAlcA:MIR156f和ProSPL9:rSPL9-GR)。

ProAlcA:MIR156f质粒构建：参见文献Yu，N.等(2010).The Plant cell22，2322-2335。ProSPL9:rSPL9-GR质粒构建：参见文献Wang，J.W.等(2009).Cell138，738-749。ProAlcA:MIR156f中miR156的表达受到酒精诱导启动子AlcA的驱动(Yu，N.等(2010).The Plant cell22，2322-2335)。对抽苔的ProAlcA:MIR156f喷洒5%浓度酒精，会瞬时诱导载体中miR156f基因表达，从而导致植物中miR156靶向的SPL基因水平降低。6小时后取材进行qRT-PCR分析发现酒精处理的植物花序中TPS21含量比用水处理的对照组降低50%(图3B)。ProSPL9:rSPL9-GR植物在施加地塞米松(DEX)后会诱导rSPL9入核(Wang，J.W等(2009)Cell138，738-749)。向转入该体系的抽苔前的植物施加10μM DEX，5小时后取莲座叶，检测基因表达量发现，TPS21转录水平增加1倍(图3B)。以上结果表明，SPL9能够直接调控TPS21表达。

将pBI101(Takara)的GUS-NOS编码区用HindIII/EcoRI切入pCAMBIA2300(Cambia)构建成pCAMBIA2300-GUS。利用高保真酶扩增TPS21编码区上游1.5kb片段，连入经PstI/BamHI酶切pCAMBIA2300-GUS载体，形成ProTPS21:GUS载体。采用冻融法将ProTPS21:GUS质粒转入农杆菌GV3101(购自Invitrogen公司)。然后将阳性克隆通过采用农杆菌介导的花芽浸泡法(floral dip)转入到盛花期的野生型拟南芥中。T₀代种子经0.8%琼脂的1/2MS抗性培养基(含50μg/ml Kan)筛选，阳性ProTPS21:GUS转基因小苗(T1代)移栽到营养土中温室培植。

以T2代ProTPS21:GUS转基因植物为母本，挑选植株未开花的花苞(未看到白色的花瓣)用尖头镊子(Dumostar#3C，Electron Microscope Sciences，Cat.72683-01)去除雄蕊、花瓣和萼片，留下柱头。将Pro35S:MIR156或Pro35S:MIM156雄蕊反复涂抹母本的柱头，确保花粉接触到母本的柱头。用保鲜膜包裹住母本的柱头，3天后除去保鲜膜，等种子成熟即可。取F2代花序放入GUS反应缓冲液中(100mM NaH₂PO₄，10mM EDTA，0.5mM K₃[Fe(CN)₆]，0.5mM K₄[Fe(CN)₆]，0.1%Triton X-100，用NaOH调节pH至7.0。临用前加入X-Gluc(DMF配制母液)至终浓度为0.5mg/mL)，浸没真空抽2min使缓冲液浸入组织，37℃保温。每隔半小时在解剖镜下观察显色效果。当显色强度足够后，吸出GUS反应缓冲液，加入70%乙醇脱色，每隔数小时更换一次。拍摄时用50%甘油替换70%乙醇。研究发现TPS21的启动子活性在Pro35S:MIM156中增强，而在Pro35S:MIR156中几乎观察不到(图3C-E)，进一步说明SPL9控制TPS21转录。

实施例5、SPL9直接结合并激活TPS21启动子

GTAC元件是已经报道的SPL蛋白结合的核心DNA序列(Birkenbihl et al.，2005)，TPS21上游长1376bp的片段中包含8个GTAC元件(图4A)。为了研究SPL9能否直接结合TPS21启动子，本发明人用N-端融合有HIS标签的SPL9纯化蛋白进行了体外凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。

通过SacI和SalI将去掉终止密码子的SPL9装入pET32a(Novagen)与载体上的His-tag融合，利用His-tag进行体外蛋白纯化，纯化后的HIS-SPL9蛋白定量后加入20%甘油分装后-70℃冻存备用。

1376bp长度的TPS21启动子被分为cis1、cis2、cis3三段，每段之间有～70bp的重叠序列。通过两轮PCR在各个片段两端引入Cy5标记(EMSA具体方法参见Yu et al.，2012)。蛋白浓度梯度及冷探针竞争实验结果表明SPL9与cis1结合力最强，cis3次之(图4B)。

ProSPL9:GFP-rSPL9质粒构建，参见文献Wang，J.W.等(2009).Cell138，738-749。为了进一步验证SPL9在体内能否与TPS21启动子结合，本发明人利用ProSPL9:GFP-rSPL9转基因植物进行了染色质免疫沉淀实验(chromatinimmuno-precipitation，ChIP)，具体方法参见Yu，N.等(2010).The Plant cell22，2322-2335。将TPS21启动子中的8个GTAC元件分为4个片段，其中I(TPS21基因ATG上游-1137到-1376位)和II(TPS21基因ATG上游-937到-1156位)各包含3个元件，III(TPS21基因ATG上游-758到-959位)和IV(TPS21基因ATG上游-98到-202位)各包含一个元件(图4A)。利用GFP抗体沉淀GFP-rSPL9蛋白，分离蛋白所结合的DNA并以此为模板进行qRT-PCR检测，发现I被明显富集，II和IV也有一定程度富集(图4C)。这与EMSA的结果——SPL9与cis1结合最强相吻合，因为cis1包含了I和II这两个在ChIP实验中被明显富集的片段。

综合以上结果，说明SPL9能够直接结合TPS21启动子。

实施例6、表达miR156f和SPL10的转基因广藿香培育

野生栽培品系T002由芬美意香料(上海)有限公司提供。根据广霍香形态和挥发油成分鉴定分析，可分为3种生态类型(Sugimura，Y.等(1990).Flavour andFragrance Journal5，109-114)。T002为Class I(广霍香醇型)，其挥发油中富含广霍香醇(30%左右)。

分别将Pro35S:rSPL10、Pro35S:MIR156f和pCAMBIA2301空载体通过液氮冻融法转入根癌农杆菌EHA105中，挑取单菌落接种到25ml含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB液体培养基中，摇床上(200转/分，28℃)过夜培养菌至OD600=0.8-1.0。将菌液分装至离心管中，室温下，5000转/分，10分钟，离心收集菌体，去上清，用相同体积的液体共培培养基(1/2MS0+蔗糖30g/L+乙酰丁香酮200mM)悬浮菌体，备用。

取在MS0基本培养基中继代保存的广藿香组培苗正常伸展的叶片作为外植体。在无菌培养皿中用剪刀剪成约0.25平方厘米大小的叶盘，将菌液倒入，充分浸泡2-3分钟；用无菌滤纸吸干叶片表面多余菌液，接种到固体共培培养基(MS+BA0.25mg/L+ZT0.25mg/L+KT0.25mg/L+IBA0.25mg/L+蔗糖30g/L)上，于26℃弱光下共培养2-3天。把叶片转到第一次筛选培养基(MS+BA0.25mg/L+ZT0.25mg/L+KT0.25mg/L+IBA0.25mg/L+蔗糖30g/L+卡那霉素100mg/L+羧苄青霉素500mg/L)上，26℃光照培养2-3周；将分化的叶片转到二次筛选培养基(MS+BA0.25mg/L+ZT0.25mg/L+KT0.25mg/L+IBA0.25mg/L+蔗糖30g/L+卡那霉素120mg/L+500mg/L)上，26℃光照培养2-3周；分离抗性芽转到促苗培养基(MS+BA0.1+卡那霉素100mg/L+羧卞青霉素300mg/L)上，26℃光照培养2-3周；将长至一定高度的抗性芽转到生根培养基(MS+卡那霉素50mg/L+羧卞青霉素300mg/L)上，2周后获得抗性植株。

实施例7、miR156f和SPL10的转基因广藿香高表达植株筛选

本发明人将pCAMBIA2301空载体也转入广藿香作为对照(空质粒)，从而排除转基因操作对广藿香次生代谢产物合成的影响。分别从一个月大转基因植株(Pro35S:rSPL10、Pro35S:MIR156f)和对照组(空质粒)不同株系顶端第二对叶片取材，以广藿香的Pat18S(EF529587)分别作为内标参考，检测不同株系中SPL10基因表达水平。选取SPL10表达水平较高的三个株系Pro35S:rSPL10-L2，Pro35S:rSPL10-L3，Pro35S:rSPL10-L24进行后续研究(图5A)。

miRNA反转录及检测方法主要参照Varkonyi-Gasic等人的报道(Varkonyi-Gasic，E.等(2007).Plant methods3，12)。

将1μM的miR156f-stem-loop RT primer65℃变性5min后置于冰上2min；

反应体系：

轻轻混匀后离心至管底，16℃孵育30min，然后30℃30s、42℃30s、50℃1s重复60个循环；85℃孵育5min灭活反转录酶。

反转录产物可稀释5-10倍作为模板。以miR156特异引物miR156f-FP-QRT做正向引物，以与stem-loop RT primer上的一段序列反向互补的引物(Universal-RP-QRT)进行qRT-PCR分析，检测转基因植株中成熟的miR156丰度。选取miR156表达水平较高的三个株系Pro35S:MIR156-L3，Pro35S:MIR156-L4，Pro35S:MIR156-L5进行后续研究(图5B)。

实施例8、miR156f和SPL10的转基因广藿香植株中PTS转录水平检测

提取十个月大小3种转基因植物不同株系第2对(从上往下数)叶片的RNA，反转录后作为qRT-PCR模板，检测广藿香醇合酶PTS的转录水平，广藿香的Pat18S(EF529587)作为内标参考。本发明人发现：与对照相比(空质粒)，PTS转录本在Pro35S:rSPL10中至少提高了5倍(图6A)，而在Pro35S:MIR156中降低了约70%(图6B)。说明miR156抑制了PTS基因表达，而其靶基因SPL10激活了PTS基因表达。

实施例9、GC-MS检测miR156f和SPL10的转基因广藿香叶片中广藿香醇含量

用直径1cm的打孔器在广藿香第2到第4对的舒展叶片(由顶端向下)上各取1块材料，称取鲜重；液氮速冻后用植物组织破碎仪(TissueLyser II，QIAGEN)将材料研磨成粉；加入1.5ml萃取缓冲液(乙酸乙酯：正己烷=15：85，并加入终浓度为20ng/ul的乙酸壬酯为内参)；混匀后，超声20分钟；12000rpm，室温离心5分钟；吸取上清即为广藿香精油粗提物，加入适量的无水Na₂SO₄对精油进行干燥；12000rpm，室温离心5分钟后吸取上清，用萃取缓冲液稀释5-10倍后用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分析广藿香精油成分。

气相色谱条件：石英毛细管柱HP-1.30m×0.25mm，柱温50℃维持2min后以2℃/min升至250℃维持20min；载气为高纯氦气，流量1ml/min；进样口温度为250℃，分流比10:1，接口温度280℃。

本发明人发现：与PTS基因表达水平吻合，PTS催化产物主要产物广藿香醇的含量在十个月大的Pro35S:rSPL10叶片萃取物中至少提高了20%(图7A和B)，其他8种PTS催化倍半萜产物含量也相应提高(表2)，而在Pro35S:MIR156中这些成分均检测不到(图7A和B)。说明miR156靶基因SPL10通过激活了PTS基因转录，提高了广藿香精油主要成分广藿香醇及多种倍半萜含量。

表2、空质粒、Pro35S:rSPL10转基因广藿香叶片各倍半萜成分及总挥发油含量(%)。

分别统计10月大的不同转基因植物至少统计6棵以上。各组分含量首先与内标相比，然后除以样品鲜重，得出百分比。图标中的值代表：平均值±标准差。利用双尾t检验检测，^b代表P<0.05，即与空质粒转基因广藿香相比具有显著差异。

实施例10、T1代转基因广藿香中PTS转录水平、广藿香醇成分含量测定

由T0代广藿香叶片组培分化再生愈伤产生T1植株。T1代植株中PTS表达水平在Pro35S:rSPL10中提高1.5-2.5倍，在Pro35S:MIR156中降低80%(图8A)；叶片萃取物中广藿香醇的含量在Pro35S:rSPL10中分别提高3-7.5倍，在Pro35S:MIR156中则低于检测线(图8B)。说明miR156靶向的SPL对于广藿香中倍半萜合成的调控可以稳定遗传。SPL促进广藿香醇合成的效果在幼年植物中更明显，提示Pro35S:rSPL10植物提前成熟，其叶片中广藿香醇含量提前达到平台期，为一年之内多次收获广藿香提供可能。

实施例11、miR156调控多年生草本植物广藿香营养期时相转换

拟南芥营养期时相转换(幼年到成年)的一个重要特征是叶片远轴面表皮毛(非腺毛)的起始(Telfer，A.等(1997). Development 124，645-654)。为了研究miR156是否调控了广藿香营养生长阶段幼年期到成年期的转变，本发明人通过扫描电镜观测转基因广藿香叶片表皮毛变化。将广藿香第2片(从上向下)叶片部分组织(避开叶脉)置于FAA固定液中[50%(v/v)乙醇，5%(v/v)乙酸和3.7%(v/v)福尔马林]，抽真空使叶片材料下沉至固定液底部，固定过夜。固定后材料置于打孔小盒中进行干燥处理。在干燥的叶片表面进行表面喷钯金并固定在铜台上，待观察一面朝上。使用JSM-6360LV扫描电镜(JEOL，Tokyo，Japan)进行观察。

本发明人发现广藿香叶表面存在非腺毛、头状腺毛、盾状腺毛三种表皮毛(图9A)。Pro35S:rSPL10植物叶片近轴面表皮毛密度没有明显变化(图9B和D)，然而远轴面表皮毛密度翻倍，其中非腺毛增加最明显同时盾状腺毛密度也增长了79%，而Pro35S:MIR156远轴面表皮毛密度下降50%，其中非腺毛几乎观察不到(图9C和D)，说明SPLs促进广藿香叶片远轴面非腺毛形成，这与拟南芥中报道SPLs加速莲座叶远轴面表皮毛(非腺毛)产生的结果一致(Wu，G.等(2009).Cell138，750-759)。此外Pro35S:rSPL10植物中叶片远轴面腺毛数目也比对照组(空质粒)增加，而Pro35S:MIR156中降低，说明SPL对叶片远轴面腺毛的密度也有一定调控作用。尽管目前广藿香精油合成及储存部位尚无报道，但本发明的研究提示miR156靶向的SPLs通过或部分通过影响表皮毛形成进而影响广藿香精油成分的含量，包括(-)-patchoulol。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。