一种具有糖、脂代谢调节活性的滇黄精多糖提取物及其制备方法

摘要

本发明滇黄精多糖的提取方法及用途，以滇黄精为原料，洗净切片，自然晒干后，打成粗粉。用蒸馏水提取三次后浓缩到一定浓度，用无水乙醇沉淀得黄精多糖粗品。用蒸馏水溶解，加入α-淀粉酶去淀粉，再用无水乙醇沉淀后分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤去脂溶性成分，得到黄色粉末。去离子水溶解后用Sevage法去蛋白，挥去有机溶剂后透析，最后冷冻干燥即得白色粉末的黄精多糖。得到的多糖用于制作片剂，具有降血压降血脂血糖的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及中药提取领域，具体涉及一种滇黄精多糖的提取物及其制备方法。

背景技术

黄精是我国重要的药食两用资源，《中国药典》2010版收载黄精为百合科黄精属植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl. 黄精P. sibiricum Red.或多花黄精P. cyrtonema Hua的干燥根茎，分别习称“大黄精”“ 鸡头黄精”或“姜形黄精”。

滇黄精在云南蕴藏量大，《滇南本草》、《云南植物志》等中均有其药用记载，是重要的“云药”品种，也是产量及市场份额最大的一个黄精品种，具有广泛的临床应用基础及良好的深入开发前景。

滇黄精多糖一直被认为是滇黄精中主要的化学成分类型，也是《中国药典》2010版中规定对滇黄精进行质量控制的化学成分。现研究表明滇黄精多糖具有降血糖降血脂以及增强人体免疫功能。

常规的多糖提取方法主要为粉碎药材、脱脂、脱色后，用水提醇沉的方法得到黄精多糖粗品，多糖的精制过程通常为离子交换、凝胶过滤及过层析柱后浓缩、冷冻干燥而得。上述多糖制备方法存在以下不足：首先，药材脱脂过程中频繁受热，多糖损耗较多，影响多糖的提取率；其次，脱脂、脱色过程复杂，时间长，成本高，难以规模化生产；此外，常规方法制备所得的多糖含杂质较多，多含有大分子物质如蛋白质、淀粉及酚类物质等，小分子物质葡萄糖及果糖等。

发明内容

本发明黄精多糖提取的原料为滇黄精，制片剂的原料是滇黄精多糖。

本法特点： 

1. 所提粗多糖中常常含有大分子蛋白质、无机盐、木质素、色素及醇不溶的小分子有机物等杂质。本方法采用一次水提加多次醇沉的方法结合冷冻干燥，过程中除去了大分子物质淀粉、蛋白质及小分子物质等，最后一步透析除去无机小分子，挥去有机物质后冷冻干燥得到较纯的白色的黄精多糖。

2. 本法初提精制过程中避免了多糖颜色的变化，粗提精制过后得率为13%，黄精多糖为白色，紫外分光光度法检测精制多糖280nm处无吸收，即不含蛋白。用蒽酮-硫酸法测定多糖含量为85%以上。

3. 本法适用于用80%乙醇提取皂苷后回收的滇黄精粗粉，将回收的滇黄精粉末自然晾干以后，用本法继续提取多糖，提取率为9%。实现了资源回收再利用。

4. 本法得到的黄精多糖用于制备黄精多糖片剂，含糖量为10%，药理证明，黄精多糖具有降低甘油三酯（TG)、胆固醇（TC）、血糖及提高糖耐量的作用。

具体方法如下：

以滇黄精为原料，洗净切片，自然晒干后，打成粗粉；取500-1000g，用6-10倍量的蒸馏水提取三次，过滤，合并滤液后浓缩到含1.2g/ml的原生药，放置室温；在浓缩液中加入4倍量的无水乙醇，静置24h后于4000r/min条件离心10-20min，分离沉淀物，得黄精多糖粗品；用蒸馏水溶解，加入α-淀粉酶去淀粉；再用4倍量无水乙醇沉淀，加入4倍量的无水乙醇，静置24h后于4000r/min条件离心10-20min，分离沉淀物，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤去脂溶性成分，室温挥掉有机溶剂，得到黄色粉末；再用去离子水溶解后用Sevage法去蛋白，挥去有机溶剂后进行流水透析2天，去离子水透析1天，最后冷冻干燥即得白色粉末的黄精多糖。

所述的去淀粉步骤具体为：加入α-淀粉酶充分搅拌后于50℃水浴锅中水解淀粉至碘化钾溶液不变蓝为止；之后直接用沸水浴灭活α-淀粉酶5min；放至室温，离心弃杂。

所述的Sevage法去蛋白的具体步骤为：用去离子水溶解配成5%的溶液后加入氯仿-正丁醇=4:1，充分震荡萃取后于4000r/min条件下离心10min，分离取出上清液，除蛋白。

附图说明

图1 标准曲线图

图2 细胞TC含量图

图3 细胞TG含量

图中，***表示模型组与正常组相比P<0.01；###表示给药组与模型组相比P<0.01。

CON：正常组MOD：模型组GL：多糖低剂量组GM：多糖中剂量组GH：多糖高剂量组LGLT：罗格列酮中剂量组

具体实施方式

实施例1

将生滇黄精洗净自然晒干，晒干后干品得率为20%，将滇黄精打成粗粉，取100g粉末，分别用12倍量、10倍量、8倍量蒸馏水提取，提取时间分别为1.5h、1h、0.5h，提取温度设为80℃。合并三次提取液，浓缩浓度为1g/ml(原生药）。用4倍量无水乙醇沉淀24h后过滤，滤渣用蒸馏水溶解，加入α-淀粉酶去淀粉，再用4倍量无水乙醇沉淀，相同条件下离心取沉淀物，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤去脂溶性成分,室温通风干燥，挥掉有机溶剂，得到黄色粉末湿重含量为67.2g。粉末用蒸馏水溶解，后用Sevage法去蛋，挥去有机溶剂后进行流水透析2天，去离子水透析1天，最后冷冻干燥即得白色粉末的黄精多糖含量为13.7g。

实施例2

将实验室用80%乙醇提取皂苷后回收的滇黄精粉末，自然烘干后，称取100g，用上述同样的方法提取精制，粗提后得到的多糖湿重44g。精制过后冷冻干燥得9 g。

实施例3

滇黄精多糖片剂的制备：以重量份计，以千克为单位，分别称取：滇黄精多糖100份、木糖醇300份、糊精250份、微晶纤维素250份、甲壳素50份、柠檬酸25份、硬脂酸镁25份。

将上述滇黄精多糖、木糖醇、糊精、微晶纤维素、甲壳素充分混合，用水润湿，制软材，过筛、干燥后整粒，加入柠檬酸、硬脂酸镁，混合后压片，每片重250mg,活性成分滇黄精多糖含25mg。

本发明滇黄精总多糖具有降低脂甘油三酯和胆固醇的作用，具有一定的α糖苷酶抑制率，结果表明，黄精多糖可用于预防和调节糖脂代谢紊乱。

实施例4

1. 蒽酮-硫酸法测定滇黄精多糖纯度

1.1 对照品及样品的制备

精密称定于105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品50mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.5mg/mL的标准品溶液；精密称取滇黄精多糖粉末100mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得1mg/mL的样品溶液。

1.2 标准曲线的制定

精密量取对照品溶液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL分别置于10mL试管中，各加蒸馏水至2.0mL，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，摇匀，放冷后置水浴中保温10分钟，取出，以不加样品为空白，用紫外分光光度法于582nm处测定吸光度。结果如表1，图1.

                     

1.3 滇黄精多糖纯度的测定

用1.2的方法分别测定滇黄精多糖的的含量，配制的浓度分别为：0.01mg/mL，0.03mg/mL，0.050mg/mL，0.07mg/mL。根据吸光度带入标准曲线公式测定滇黄精多糖的纯度为85%以上，结果表2.

                                

 2. 滇黄精多糖α-糖苷酶抑制活性

2.1 材料与方法

材料及滇黄精总多糖的制备

α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC 3.2.1.20），4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，批号：101324963，CAS：3767-28-0）；胎牛血清（Foetal Bovine Serum，LOT：1413865）；其余化学试剂均为分析纯。

精密称取适量滇黄精多糖，分别配制成0.1mg/m，1mg/mL，10mg/mL，20mg/mL的浓度作为待测样品。

方法

在磷酸钾缓冲液(pH6.8)体系中，反应温度37℃，以pNPG为反应底物，加入α-糖苷酶，以Na₂CO₃为终止液。pNPG溶液无色，但经葡萄糖苷酶水解释放出对硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下呈黄绿色，在400nm处有最大吸收，当加入α-葡萄糖苷酶抑制剂时，可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，减少pNP的释放，因此可以通过吸光度的变化来测定抑制活性。

反应体系

取pH 6.8磷酸盐缓冲液725μL，待测样品溶液10μL，α-葡萄糖苷酶（0.15U/mL）100μL，混匀，以不加待测样品溶液作为空白对照( pH 6.8磷酸盐缓冲液补足)，以不加酶溶液的反应体系作为背景除去，37℃恒温水浴保温10 min，再向反应体系中加入175μL 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷( pNPG)，恒温10 min后，立即加入2mL的0.1mol/L Na₂CO₃终止反应。

结果

由表可以看出在体外模型中，滇黄精总多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。如表3.

3. 滇黄精多糖对脂肪化肝L-02细胞脂代谢的调节作用

3.1 材料与方法

材料

正常人肝L-02细胞，医用脂肪乳（10%胎牛血清、10%医用脂肪乳及RPMI-1640培养液），正常培养液（含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液），及G0（含0.2%胎牛血清的RPMI-1640培养液）溶液等。

方法

造模：将细胞培养到一定数量后传到6孔板中，除正常组用正常培养液培养外，其余均用医用脂肪乳培养细胞48h，诱导肝L-02脂肪化后，分为模型组、滇黄精多糖低（10μg/mL）、中（50μg/mL）、高（100μg/mL）三个浓度组及罗格列酮（50μmol/L）组，每组做三个复孔。给药24h后测定细胞内甘油三酯（TG）及胆固醇（TC）的含量。

统计方法：正常组与模型组比较、给药组与罗格列酮比较用t检验、给药组间比较用单因素方差分析法。

3. 2 结果

由图2和图3可知，模型组细胞TC、TG含量显著高于正常组，通过给予滇黄精多糖及罗格列酮后，细胞TC、TG含量明显下降，且与模型组相比具有显著性差异，而滇黄精多糖作用与罗格列酮相比无显著性差异。由此得知滇黄精总皂苷具有明显的调节脂代谢活性。如图2，图3。

图中，***表示模型组与正常组相比P<0.01；###表示给药组与模型组相比P<0.01。

CON：正常组MOD：模型组GL：多糖低剂量组GM：多糖中剂量组GH：多糖高剂量组LGLT：罗格列酮中剂量组。