一种用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统双重抑制剂的化合物的制备方法

摘要

本发明涉及一种用于肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统双重抑制剂的化合物的制备方法，其中所述的RAAS系统双重抑制剂可用于治疗与RAS系统相关的疾病，包括高血压、心脏病等。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统双重抑制剂的化合物的制备 方法，其中所述的RAAS系统双重抑制剂可用于治疗与RAS系统相关的疾病，包括高血压、 心脏病等。

背景技术

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)是一种复杂、高效调节血流量，电解质平衡以及 动脉血压所必需的高效系统。这个系统的两个主要部分是肾素和血管紧张素转移酶。肾素是 一种天冬氨酰蛋白酶，它能使在肝脏产生血管紧张素原转化血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ在 血管紧张素Ⅰ转化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)的作用下生成血管紧张素Ⅱ， 最后转化为能促进醛固酮分泌的血管紧张素Ⅲ并灭活。血管紧张素Ⅱ是一种作用极强的肽类 血管收缩剂并能促进去甲肾上腺素从神经末梢释放，还可通过激活原癌基因c-jun、c-fos、c- myc、egr-1等表达促进血管平滑肌生长和心脏结构重构，在高血压病中产生重要的作用。

血管紧张素Ⅱ是一种作用很强的血管收缩物质，其升血压的效力相当于去甲肾上腺素的 50倍。血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)都可以抑 制血管紧张素II的生成，从而有效地舒张血管，降低血压，已广泛应用于治疗高血压及相关 疾病。

ACEI和ARB均作用于RAAS，理论上不能联合使用。但已有临床观察发现ACEI与ARB 联合应用对降低尿蛋白效果更好，随机对照试验也得出相同的结果。Val-Heft研究中93％患 者合用ACEI，结果显示：缬沙坦与ACEI联合应用的患病率和病死率、再住院率均减低，心 衰症状与LVEF改善比单用ACEI更好。CHARM-Added试验对于已经服用ACEI(和β受体 阻滞剂)的慢性心衰患者，加用坎地沙坦可以进一步减少心血管死亡和住院治疗的危险15％。 ARB和ACEI均能阻断RAAS的不利影响，治疗机制不尽相同，ACEI与ARB联合应用可能 产生协同作用，但是否具有普遍意义依然存疑。本发明人令人惊奇地发现了一种可以作用于 RAAS系统的双重抑制剂，并未出现ACEI与ARB联合应用的风险。

发明内容

本发明提供一种具有血管紧张素I转换酶抑制作用和血管紧张素II受体拮抗作用的 RAAS系统双重抑制剂的制备方法，其中所述的RAAS系统双重抑制剂可用于预防或治疗与 RAAS系统相关的疾病，包括高血压、充血性心脏衰竭、肺动脉高压、肾功能不全、肾缺血、 肾功能衰退、肾纤维化、心脏机能不全、心脏肥大、心脏纤维化、心肌缺血、心肌病、肾小 球肾炎、肾绞痛、由糖尿病引起的并发症例如肾病、血管病变以及神经病变、青光眼、眼内 压升高、动脉粥样硬化、血管形成术后的再狭窄、血管或者心脏外科手术后的并发症、勃起 功能障碍、醛固酮增多症、肺脏纤维化、硬皮病、焦虑、认知障碍、由免疫抑制剂的治疗所 引起的并发症、以及其他已知与所述的肾素-血管紧张素系统相关联的疾病。

本发明的目的之一是提供如下式(I)所示的化合物、其立体异构体，或者其盐的制备方 法：

包括：

使式(II)化合物与式(III)化合物接触以获得式(I)化合物；

其中，

X代表-NH-、-S-或-O-；

Y代表化学键或-CH₂O-；

Z代表

n为0或1；

R¹代表氢或C_1-6烷基，所述的C_1-6烷基可以被选自羟基、巯基、氨基、C_1-6烷基氧基、 C_1-6烷基硫基、氨基羰基、胍基、吲哚基和咪唑基的基团取代；

R²代表氢、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基；

R³代表氢、C_1-6烷基、其中m 代表1、2或3，R³¹代表氢或C_1-6烷基；

R⁴代表酸性基团，优选为羧基，磷酸基，磺酸基或者四唑基；

R⁵代表C_1-6烷基-酰基；

R⁶代表氢或C_1-6烷基，所述的C_1-6烷基可以被选自羟基、巯基、氨基、C_1-6烷基氧基、 C_1-6烷基硫基、氨基羰基、胍基、吲哚基和咪唑基的基团取代；

R⁷代表相同或不同的1-2个选自氢、卤素、氰基、羧基、C_1-6烷基或C_1-6烷氧基的基团。

根据本发明的方法制备的式(I)化合物可用于预防或治疗与RAAS系统相关的疾病，包 括高血压、充血性心脏衰竭、肺动脉高压、肾功能不全、肾缺血、肾功能衰退、肾纤维化、 心脏机能不全、心脏肥大、心脏纤维化、心肌缺血、心肌病、肾小球肾炎、肾绞痛、由糖尿 病引起的并发症例如肾病、血管病变以及神经病变、青光眼、眼内压升高、动脉粥样硬化、 血管形成术后的再狭窄、血管或者心脏外科手术后的并发症、勃起功能障碍、醛固酮增多症、 肺脏纤维化、硬皮病、焦虑、认知障碍、由免疫抑制剂的治疗所引起的并发症、以及其他已 知与所述的肾素-血管紧张素系统相关联的疾病。

在一个实施方式中，式(III)化合物通过式(V)所示的酰氯与式(IV)所示的醇缩合 获得：

在另一个实施方式中，还包括制备式(V)化合物的步骤：使式(VII)所示的酰氯与式 (VIII)所示的脯氨酸衍生物缩合，以形成式(VI)化合物，然后用氯化剂处理，以形成式 (V)化合物：

在另一个实施方式中，还包括使式(IX)所示的溴代物与式(X)化合物缩合，以形成 式(II)化合物的步骤：

优选地，制备式(II)化合物的步骤包括：

a)当Z代表且Y代表化学键时，使式(IX)所示的溴代物与式(XI)化 合物缩合，然后用含有R⁵基团的酰化剂酰化：

或者

b)当Z代表且Y代表-CH₂O-时，用固体光气处理式(XIV)化合物，以 获得式(IIb)化合物：

或者

c)当Z代表且Y代表化学键时，用氧化剂将式(XIII)化合物氧化成式 (XIV)所示的羧酸化合物，然后用氯化剂处理得式(IIc)化合物：

其中，所述氧化使用的氧化剂可以是任何合适的氧化剂，优选高卤酸盐(例如高碘酸钠、 高氯酸钠)、高锰酸钾、重铬酸钾、PCC氧化剂、Jones试剂、四氧化钌等。所述的氯化剂优 选为二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷等。

在又一个实施方式中，还包括使式(IX)所示的溴代物与式(XV)化合物缩合以形成式 (XIII)化合物的步骤：

其中，R¹-R⁷、X、Y、Z、n如上文所定义。

可选地，上述式(II)～(XV)化合物均可携带保护剂，关于保护基合适的例子是本领 域公知的。

当上述式(II)～(XV)化合物具有保护剂时，还包括脱除所述保护基的步骤。

除非特别说明，这里所使用的“烷基”意在包括具有指定的碳原子数目的支链或直链的 饱和脂肪烃基团。例如，“C_1-6烷基”或者“C₁-C₆烷基”代表具有指定碳原子数目的线性或 者支链的烷基基团，包括所有的异构体。C_1-6烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。

类似地，“环烷基”意在包括具有指定的碳原子数目的环状饱和脂肪烃基团。例如，“C_3-6环烷基”或者“C₃-C₆环烷基”代表具有指定碳原子数目的环状烷基基团，包括所有的异构体。 C_3-6烷基的实例包括环正丙基、环丁基、环戊基、环己基等。

本发明的化合物的盐包括药学上可接受的盐类，包括与无机酸形成的盐，例如盐酸、氢 溴酸、硫酸、磺酸、磷酸、硝酸以及类似酸；与有机酸加成盐，包括醋酸盐、己二酸盐、藻 酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑 磺酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙基磺酸盐、延胡索酸盐、葡萄 糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟 基乙基磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲基磺酸盐、2-萘基磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、 双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸 盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、以及十一酸盐；例如无机或者有机酸或者 碱的季胺盐类；酸碱式盐包括铵盐、碱金属盐例如钠盐以及钾盐、碱土金属盐例如钙盐以及 镁盐、与有机碱形成的盐例如二环己胺盐、N-甲基-D-葡萄糖胺，以及与氨基酸形成的盐例如 精氨酸、赖氨酸，等等。同样的，所述的碱性含氮基团可以被例如低级卤代烷这样的试剂季 胺化、例如甲基、乙基、丙基、以及丁基氯、溴以及碘；二烷基硫酸盐例如二甲基、二乙基、 二丁基；以及二戊基硫酸盐、长链卤化物例如十一烷基、十二烷基、十四烷基以及十八烷基 氯、溴以及碘、芳基烷基卤化物例如苯甲基以及苯乙基溴以及其他。

具体实施例

式(II)化合物的制备

1.N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-缬氨酰氯(中间体1) 的制备

步骤1、N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-缬氨酸的制备

在250mL三口烧瓶中加入碳酸钾(12.5g)和乙腈(85mL)，加入L-缬氨酸(5.0g)，搅 拌，反应0.5h；加入2-N-三苯甲基-5-(4'-溴甲基联苯-2-基)四氮唑(16.7g)，加热至回流反应 8h，冷却至室温，过滤，用10mL乙腈洗涤滤饼；合并滤液，减压旋蒸，回收溶剂。剩余物 中加入100mL乙酸乙酯，乙酸乙酯层盐水洗(30mL×2)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后过 滤，回收溶剂，得标题化合物。分子式：C₃₈H₃₅N₅O₂，质谱分析(m/z)：m/z:593.28(100.0％), 594.28(43.0％)。元素分析：C,76.87；H,5.94；N,11.80；O,5.39。

步骤2、N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-缬氨酸的制备

将步骤1所得产物溶于甲苯(100mL)中，加入碳酸氢钠(4.1g)，搅拌0.5h。冷却至5℃， 滴加戊酰氯(4.6mL)。加完后室温搅拌30h。反应完成后，加入10％碳酸氢钠溶液(30ml)， 室温搅拌4h。分层，甲苯层用盐水洗(30mL×2)，无水硫酸钠干燥后过滤，回收溶剂得标题 化合物。分子式：C₄₃H₄₃N₅O₃，质谱分析(m/z)：677.34(100.0％)，678.34(47.1％)。

元素分析：C,76.19；H,6.39；N,10.33；O,7.08。

步骤3、N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-缬氨酰氯的制 备

将步骤2的产物(8.9mmoL)加入到四口烧瓶中，室温搅拌下慢慢滴加等摩尔量的二氯 亚砜，用氢氧化钠或者氢氧化钾溶液吸收产生的气体。滴加完成后升温至70℃，继续搅拌反 应6h。减压蒸馏，得标题化合物。分子式：C₄₃H₄₂N₅O₂Cl，质谱分析(m/z)：6695.30(100.0％)， 696.31(47.1％)，697.30(32.8％)。

元素分析：C,74.17；H,6.08；Cl,5.09；N,10.06；O,4.60。

2.N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-亮氨酰氯(中间体2) 的制备

步骤1、N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-亮氨酸的制备

在250mL三口烧瓶中加入碳酸钾(12.5g)和乙腈(85mL)，加入L-亮氨酸(5.6g)，搅 拌，反应1h；加入2-N-三苯甲基-5-(4'-溴甲基联苯-2-基)四氮唑(16.7g)，加热至回流反应8h， 冷却至室温，过滤，用10mL乙腈洗涤滤饼；合并滤液，减压旋蒸，回收溶剂。剩余物中加 入100mL乙酸乙酯，乙酸乙酯层盐水洗(30mL×2)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后过滤， 回收溶剂，得标题化合物。分子式：C₃₉H₃₇N₅O₂；质谱分析(m/z)：607.29(100.0％),608.30 (42.7％)；元素分析：C,77.07；H,6.14；N,11.52；O,5.26。

步骤2、N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-亮氨酸的制备

将步骤1所得产物溶于甲苯(100mL)中，加入碳酸氢钠(4.1g)，搅拌0.5h。冷却至5℃， 滴加戊酰氯(4.6mL)。加完后室温搅拌30h。反应完成后，加入10％碳酸氢钠溶液(30ml)， 室温搅拌4h。分层，甲苯层用盐水洗(30mL×2)，无水硫酸钠干燥后过滤，回收溶剂得标题 化合物。分子式：C₄₄H₄₅N₅O₃；质谱分析(m/z)：691.35(100.0％),692.36(48.2％)；元素分 析：C,76.38；H,6.56；N,10.12；O,6.94。

步骤3、N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-亮氨酰氯的制 备

将步骤2的产物(9.0mmoL)加入到四口烧瓶中，室温搅拌下慢慢滴加等摩尔量的二氯 亚砜，用氢氧化钠或者氢氧化钾溶液吸收产生的气体。滴加完成后升温至65℃，继续搅拌反 应7h。减压蒸馏，得标题化合物。分子式：C₄₄H₄₄ClN₅O₂；质谱分析(m/z)：709.32(100.0％), 710.32(50.0％)；元素分析：C,74.40；H,6.24；Cl,4.99；N,9.86；O,4.50。

3.N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-丝氨酰氯(中间体3) 的制备

步骤1、N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-丝氨酸的制备

在250mL三口烧瓶中加入碳酸钾(12.5g)和乙腈(85mL)，加入L-丝氨酸(4.5g)，搅 拌，反应1h；加入2-N-三苯甲基-5-(4'-溴甲基联苯-2-基)四氮唑(16.7g)，加热至回流反应8h， 冷却至室温，过滤，用15mL乙腈洗涤滤饼；合并滤液，减压旋蒸，回收溶剂。剩余物中加 入100mL乙酸乙酯，乙酸乙酯层盐水洗(30mL×2)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后过滤， 回收溶剂，得标题化合物。分子式：C₃₆H₃₁N₅O₃；质谱分析(m/z)：581.24(100.0％),582.25 (39.4％)；元素分析：C,74.34；H,5.37；N,12.04；O,8.25。

步骤2、N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-丝氨酸的制备

将步骤1所得产物溶于甲苯(100mL)中，加入碳酸氢钠(4.1g)，搅拌0.5h。冷却至5℃， 滴加戊酰氯(4.6mL)。加完后室温搅拌30h。反应完成后，加入10％碳酸氢钠溶液(30ml)， 室温搅拌4h。分层，甲苯层用盐水洗(30mL×2)，无水硫酸钠干燥后过滤，回收溶剂得标题 化合物。分子式：C₄₁H₃₉N₅O₄；质谱分析(m/z)：665.30(100.0％),666.30(46.3％)；元素分析： C,73.96；H,5.90；N,10.52；O,9.61。

步骤3、N-戊酰基-N-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-丝氨酰氯的制 备

将步骤2的产物(8.9mmoL)加入到四口烧瓶中，室温搅拌下慢慢滴加等摩尔量的二氯 亚砜，用氢氧化钠或者氢氧化钾溶液吸收产生的气体。滴加完成后升温至65℃，继续搅拌反 应7h。减压蒸馏，得标题化合物。分子式：C₄₁H₃₈ClN₅O₃；质谱分析(m/z)：683.27(100.0％), 684.27(44.9％)；元素分析：C,71.97；H,5.60；Cl,5.18；N,10.24；O,7.01。

4.N2-戊酰基-N2-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-谷氨酰胺酰氯(中 间体4)的制备

步骤1、N2-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-谷氨酰胺的制备

在250mL三口烧瓶中加入碳酸钾(12.5g)和乙腈(85mL)，加入L-谷氨酰胺(6.2g)， 搅拌，反应1h；加入2-N-三苯甲基-5-(4'-溴甲基联苯-2-基)四氮唑(16.7g)，加热至回流反应 8h，冷却至室温，过滤，用15mL乙腈洗涤滤饼；合并滤液，减压旋蒸，回收溶剂。剩余物 中加入100mL乙酸乙酯，乙酸乙酯层盐水洗(30mL×2)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后过 滤，回收溶剂，得标题化合物。分子式：C₃₈H₃₄N₆O₃；质谱分析(m/z)：622.27(100.0％),623.27 (43.4％)；元素分析：C,73.29；H,5.50；N,13.50；O,7.71。

步骤2、N2-戊酰基-N2-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-谷氨酰胺的 制备

将步骤1所得产物溶于甲苯(100mL)中，加入碳酸氢钠(4.1g)，搅拌0.5h。冷却至5℃， 滴加戊酰氯(4.6mL)。加完后室温搅拌30h。反应完成后，加入10％碳酸氢钠溶液(30ml)， 室温搅拌4h。分层，甲苯层用盐水洗(30mL×2)，无水硫酸钠干燥后过滤，回收溶剂得标题 化合物。分子式：C₄₃H₄₂N₆O₄；质谱分析(m/z)：706.33(100.0％),707.33(47.1％)；元素分析： C,73.07；H,5.99；N,11.89；O,9.05。

步骤3、N2-戊酰基-N2-(4-(2-(1-三苯甲基-1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基-L-谷氨酰胺酰 氯的制备

将步骤2的产物(8.9mmoL)加入到四口烧瓶中，室温搅拌下慢慢滴加等摩尔量的二氯 亚砜，用氢氧化钠或者氢氧化钾溶液吸收产生的气体。滴加完成后升温至65℃，继续搅拌反 应7h。减压蒸馏，得标题化合物。分子式：C₄₃H₄₁ClN₆O₃；质谱分析(m/z)：724.29(100.0％), 725.30(47.1％),726.29(33.0％)；元素分析：C,71.21；H,5.70；Cl,4.89；N,11.59；O,6.62。

5.(2-丁基-4-氯-1-((2'-(1-三苯甲基-1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-1H-咪唑-5-yl)甲 醇氯甲酸酯(中间体5)的制备

在低温下将氯沙坦和三乙胺的混合液缓慢滴加到固体光气的二氯甲烷溶液中(氯沙坦与 固体光气的摩尔比1:0.5)，滴加完毕后，在温度为10℃下反应1小时。反应完成后再缓慢向 反应液中滴加定量的水，使未反应的固体光气分解，并用水洗直到pH值为5～6。随后向反 应混合物中加入三乙胺，搅拌混合，加入三苯甲基氯的二氯甲烷溶液，并且在室温下对得到 的反应混合液进行搅拌。用水对所述反应混合液进行洗涤，硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏， 得标题化合物。

分子式：C₄₂H₃₆C_l2N₆O₂；质谱分析(m/z)：726.23(100.0％),728.22(63.9％),727.23(45.9％)； 元素分析：C,69.32；H,4.99；Cl,9.74；N,11.55；O,4.40。

6.2-丁基-4-氯-1-((2'-(1-三苯甲基-1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-1H-咪唑-5-甲酰氯 (中间体6)的制备

步骤A：在0℃下，向四口瓶中加入水(100ml)、氢氧化钾(152.4mmol)，随后加入氯 沙坦(10.9mmol)，高碘酸钠(25.9mmol)以及一水合氯化钌(III)(0.5mmol)并且将所述 反应混合液在0℃下搅拌过夜。对所述反应混合液进行过滤。在搅拌状态下向所述滤液中加 入异丙醇，将所述溶液升温至25℃并且搅拌2.5小时，向其中加入磷酸，保持所述温度低于 30℃。将所述混合液搅拌30分钟并且过滤得到的产物，用水进行洗涤，残余物真空干燥，得 2-丁基-4-氯-1-((2'-(1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-1H-咪唑-5-甲酸。

步骤B：向步骤A产物的二氯甲烷溶液中加入三乙胺，随后加入三苯甲基氯的二氯甲烷 溶液，并且在室温下对得到的反应混合液进行搅拌。用水对所述反应混合液进行洗涤，硫酸 镁干燥，过滤，真空浓缩，加载于硅胶柱上，利用20-80％的丙酮/正己烷进行洗脱，获得2- 丁基-4-氯-1-{[2’-(2-三苯甲基-2H-四氮唑-5-)联苯基-4-]甲基}-1H-咪唑-5-羧酸。

步骤C：将步骤B产物的乙酸乙酯溶液加入到四口烧瓶中，室温搅拌下慢慢滴加等摩尔 量的二氯亚砜，滴加完成后升温至55℃，继续搅拌反应6h，减压蒸馏以回收溶剂，得产物中 间体2，不必进一步分离，可直接用于下一步反应。

分子式：C₄₁H₃₄Cl₂N₆O；质谱分析(m/z)：696.22(100.0％),698.21(63.9％),697.22(44.8％)； 元素分析：C,70.59；H,4.91；Cl,10.16；N,12.05；O,2.29。

式(III)化合物的制备

7.((S)-3-巯基-2-甲基丙酰基)-L-脯氨酸甲酯(中间体7)的制备

向四口烧瓶中加入L-脯氨酸(2.8mmol)、8％的NaOH溶液(2.8mmol)，搅拌溶解，温 度降低至0℃，开始滴加(S)-3-巯基-2-甲基丙酰氯(3.5mmol)，同时用8％的NaOH溶液维持 反应体系的pH在7.5-9，温度保持在0-5℃，酰氯滴加完后，继续滴加8％的NaOH溶液，调 节反应体系的pH为7，直至不变为止。室温搅拌反应3小时，然后低温下用盐酸中和，然后 用乙酸乙酯萃取反应液，合并有机相，用10％的NaCl溶液洗涤，无水MgSO₄干燥，过滤除 去干燥剂。回收溶剂得标题化合物。分子式：C₉H₁₅NO₃S；质谱分析(m/z)：217.08(100.0％)； 元素分析：C,49.75；H,6.96；N,6.45；O,22.09；S,14.75。

8.L-丙氨酰基-L-脯氨酸(中间体8)的制备

以L-丙氨酰氯代替(S)-3-巯基-2-甲基丙酰氯，实施制备中间体7的方法，获得L-丙氨酰 基-L-脯氨酸。分子式：C₈H₁₄N₂O₃；质谱分析(m/z)：186.20(100.0％)；元素分析：C,51.60； H,7.58；N,15.04；O,25.78。

9.L-丙氨酰基-L-脯氨酸2,3-二硝氧基甘油酯(中间体9)的制备

将中间体8的乙酸乙酯溶液加入到四口烧瓶中，室温搅拌下慢慢滴加等摩尔量的二氯亚 砜，滴加完成后升温至60℃，继续搅拌反应5h，减压蒸馏以回收溶剂。将产物溶于DMF中， 加入碳酸钾，搅拌溶解，然后加入(3aS,6aR)-6-羟基-六氢呋喃并[3,2-b]呋喃-3-硝酸酯，将混合 物在70℃下搅拌2小时。反应完成后，向其中加入水，用乙酸乙酯提取，硅胶柱层析分离， 得产物。分子式：C₁₄H₂₁N₃O₈质谱分析(m/z)：359.13(100.0％)；元素分析：C,46.80；H,5.89； N,11.69；O,35.62。

类似地，以不同的氨基酸衍生物与L-脯氨酸缩合，然后与相应的醇酯化，可以制备得到 中间体10-16(参见表1)。

表1

式(I)化合物的制备

实施例1

(3-((N-(4-(2-(1H-四氮唑-5-基)苯基)苯基)甲基)-N-戊酰基-L-缬氨酰基)硫)-2-甲基丙酰 基)-L-脯氨酸(化合物1)的制备

向四口烧瓶中加入中间体7(3.0mmol)、碳酸钾(3.0mmol)和DMF(100ml)，搅拌溶 解，温度降低至0℃，开始滴加中间体1(3.0mmol)，同时用碳酸钾溶液维持反应体系的pH 在7.0-8.0，温度保持在0℃，滴加完成后，继续滴加碳酸钾溶液，调节反应体系的pH为7， 直至不变为止。室温搅拌反应3小时，然后向其中加入水(40ml)，用乙酸乙酯抽提，回收 溶剂。剩余物用硅胶吸附，正己烷/丙酮洗脱，得标题化合物。

分子式：C₃₃H₄₂N₆O₅S，质谱分析(m/z)：634.29(100.0％),635.30(36.4％)。

元素分析：C,62.44；H,6.67；N,13.24；O,12.60；S,5.05。

1H NMR(6d-DMSO)：12.22(1H)，7.96(2H)，7.60(2H)，7.41-7.47(4H)，6.33(1H)，4.46(2H)， 4.33(1H)，4.26(1H)，3.41-3.51(1H)，2.96-3.21(2H)，2.65-2.73(2H)，2.02-2.33(6H)，1.53(2H)， 1.38(2H)，1.17(3H)，0.93-0.96(9H)

实施例2

(3aR,6aS)-3-(N-((2'-(1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-N-正戊酰基-L-亮氨酰基-L-丙 氨酰基-L-脯氨酰氧基)-6-(硝氧基)六氢呋喃并[3,2-b]呋喃(化合物2)的制备

以实施例1类似的方法，使中间体2与中间体9在碳酸钾等碱性试剂存在下反应，得标 题化合物。分子式：C₃₉H₅₀N₈O₁₀；质谱分析(m/z)：790.36(100.0％),791.37(43.1％)；元素 分析：C,59.23；H,6.37；N,14.17；O,20.23。

¹H-NMR(CDCl₃)：8.32(1H),7.96(2H),7.60(2H),7.41-7.47(4H),6.33(1H),5.22(1H), 4.64(1H),4.46(2H),4.44(1H),4.29(1H),4.14(4H),3.85(3H),3.46(2H),2.30(2H),1.97-2.05(4H), 1.76(2H),1.38-1.53(8H),0.93(9H)。

实施例3

(3aR,6aS)-3-(N-((2'-(1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-N-正戊酰基-L-丝氨酰基-L-丙 氨酰基-L-脯氨酰氧基)-6-(硝氧基)六氢呋喃并[3,2-b]呋喃(化合物3)的制备

以实施例1类似的方法，使中间体3与中间体9在碳酸钾等碱性试剂存在下反应，得标 题化合物。分子式：C₃₆H₄₄N₈O₁₁；质谱分析(m/z)：764.31(100.0％),765.32(39.9％)；元素分 析：C,56.54；H,5.80；N,14.65；O,23.01。

¹H-NMR(CDCl₃)：8.30(1H),7.95(2H),7.59(2H),7.41-7.47(4H),6.32(1H),5.21(1H), 4.95(1H),4.64(1H),4.54(1H),4.46(2H),4.29(1H),4.15(5H),3.85-3.99(4H),3.46(2H),2.32(1H), 2.20(1H),1.97-2.05(4H),1.38-1.53(7H),0.92(3H)。

实施例4

(3aR,6aS)-3-(N2-((2'-(1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-N2-正戊酰基-L-谷氨酰胺酰基 -L-丙氨酰基-L-脯氨酰氧基)-6-(硝氧基)六氢呋喃并[3,2-b]呋喃(化合物4)的制备

以实施例1类似的方法，使中间体4与中间体9在碳酸钾等碱性试剂存在下反应，得标 题化合物。分子式：C₃₈H₄₇N₉O₁₁；质谱分析(m/z)：805.34(100.0％),806.34(44.8％)；元素分 析：C,56.64；H,5.88；N,15.64；O,21.84。

¹H-NMR(CDCl₃)：8.32(1H),7.96(2H),7.60(2H),7.41-7.47(4H),7.03(2H),6.33(1H), 5.22(1H),4.64(1H),4.45(3H),4.29(1H),4.15(4H),3.85(3H),3.46(2H),2.30(1H),1.92-2.05(9H), 1.47-1.53(7H),0.93(3H)。

实施例5

(3aS,6aR)-6-(硝氧基)六氢呋喃并[3,2-b]呋喃-3-基(((1-((2'-(1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基) 甲基)-2-丁基-4-氯-1H-咪唑-5-基)甲氧基)羰基)-L-丙氨酰基-L-脯氨酸酯(化合物5)的制备

向四口烧瓶中加入中间体9(3.0mmol)、碳酸钾(3.0mmol)和DMF(100ml)，搅拌溶 解，温度降低至0℃，开始滴加中间体5(3.0mmol)，同时用碳酸钾溶液维持反应体系的pH 在7.0-8.0，温度保持在0℃，滴加完成后，继续滴加碳酸钾溶液，调节反应体系的pH为7， 直至不变为止。室温搅拌反应3小时，然后向其中加入水，用乙酸乙酯抽提，回收溶剂。剩 余物用硅胶吸附，正己烷/丙酮洗脱，得标题化合物。

分子式：C₃₇H₄₂ClN₉O₁₀，质谱分析：m/z:807.27(100.0％),808.28(40.9％),809.27(33.3％)； 元素分析：C,54.98；H,5.24；Cl,4.39；N,15.60；O,19.79；¹H NMR(CDCl₃)：7.96(2H),7.60(2H), 7.39(1H),7.34(4H),6.33(1H),5.46(2H),5.40(2H),5.22(1H),4.64(1H),4.29(1H),4.14(4H), 3.85(3H),3.46(2H),2.87(2H),2.44(1H),2.19(1H),1.97-2.09(2H),1.59(2H),1.47(3H),1.30(2H), 0.90(3H)。

实施例6

(3aS,6aR)-6-(硝氧基)六氢呋喃并[3,2-b]呋喃-3-基((1-((2'-(1H-四唑-5-基)-[1,1'-联苯]-4-基) 甲基)-2-丁基-4-氯-1H-咪唑-5-基)甲酰基)-L-丙氨酰基-L-脯氨酸酯(化合物6)的制备

向四口烧瓶中加入中间体9(3.0mmol)、碳酸钾(3.0mmol)和DMF(100ml)，搅拌溶 解，温度降低至0℃，开始滴加中间体6(3.0mmol)，同时用碳酸钾溶液维持反应体系的pH 在7.0-8.0，温度保持在0℃，滴加完成后，继续滴加碳酸钾溶液，调节反应体系的pH为7， 直至不变为止。室温搅拌反应2.5小时，然后向其中加入水，用乙酸乙酯抽提，回收溶剂。 剩余物用硅胶吸附，正己烷/丙酮洗脱，得标题化合物。

分子式：C₃₆H₄₀ClN₉O₉；质谱分析(m/z)：777.26(100.0％),778.27(39.5％),779.26(33.1％)； 元素分析：C,55.56；H,5.18；Cl,4.56；N,16.20；O,18.50。

¹H NMR(CDCl₃)：9.38(1H),7.93(2H),7.62(2H),7.36(4H),6.35(1H),5.46(2H),5.22(1H), 4.64(1H),4.29(1H),4.01-4.15(4H),3.87(3H),3.45(2H),2.87(2H),2.45(1H),2.18(1H), 1.90-2.03(2H),1.59(2H),1.47(3H),1.30(2H),0.90(3H)。

类似地，以中间体7-16分别与中间体1-6在碱性试剂碳酸钾存在下反应，可以制备得到 以下化合物(参见表2)：

表2

应用实施例

1.血管紧张素II受体拮抗活性的测试

根据王孝伟等(血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂的活性测定，《北京医科大学学报》1998年底 30卷第4期，第370页)公开的方法进行测试。

在0.35ml大鼠肝细胞膜受体反应液中加入约100μg肝膜蛋白、固定量的¹²⁵I-血管紧张 素Ⅱ受体(约5,000计数率/min)与0.045ng到30ng不等的非标记的血管紧张素Ⅱ受体， 非特异管加1μg血管紧张素Ⅱ受体，在25℃下反应70min，水浴终止反应，多头收集器将结 合的¹²⁵I-血管紧张素Ⅱ受体收集在玻璃纤维滤纸上(已用1mg/L血管紧张素Ⅱ受体预饱和)， 每次每管用5ml冲洗液，共洗3～4次。γ计数器测量放射性，计算IC₅₀值。

实验结果表明，本发明上述实施例化合物1-16的IC₅₀≤2μmol。

2.血管紧张素转换酶I抑制试验

根据沈要林等(血管紧张素转化酶抑制剂抑制率的测定方法，《食品科技》2007年第3 期第212-216页)公开的HPLC-ESI-MS法进行测试。结果显示，本发明上述实施例化合物 1-16的IC₅₀≤1μmol。

3.活性氮自由基(RNS)检测(二氨基萘检测)

依照Kostka以及Park提出的方法(参见Methods Enzymol.《酶学方法》1999年，301， 227-235)，利用高效液相色谱(HPLC)荧光检测法，在经过乙二胺四乙酸(EDTA)处理的 大鼠的血浆中探测S-亚硝基硫醇形式的活性氮自由基(RNS)。所述方法以荧光性2,3-萘酚三 唑(NAT)的探测为基础，所述的荧光性2,3-萘酚三唑是通过酸化的2,3-二氨基萘(DAN) 以及所述亚硝基硫醇(RSNOs)的亚硝半族之间发生的反应而产生的，其中所述的亚硝基硫 醇的亚硝半族是由氯化汞介导的S-NO键的断裂而释放出的。利用反相高效液相色谱对所述 反应混合液进行色谱化，并且对解析出的萘酚三唑(NAT)峰的荧光信号进行量化。

首先在未经处理的黑聚丙烯微滴定板中以1:1的比例用水(20微升)对血浆(20微升) 进行稀释。加入二氨基萘(DAN)试剂(每孔100微升，存在于0.1N盐酸、4毫摩氯化汞中 的100微摩二氨基萘)，并且立即使用不透明的垫板对所述微滴定板进行密封，旋转，并且在 黑暗中培养10分钟。对所述板进行离心(2000x g，5分钟)并且冷却至4℃，之后进行高效 液相色谱(HPLC)分析。在Agilent 1200系统中利用冷却的自动进样器(4℃)进行高效液 相色谱(HPLC)。样本在C8柱(Zorbax Eclipse XDB-C8，4.6x 150毫米，5微米)中进行色 谱反应，利用67％的甲醇、0.1％的醋酸铵作为流动相，以2毫升/分钟的流速进行无梯度洗 脱。利用360纳米的激发波长在450纳米处监测萘酚三唑的荧光性。在对照血浆中利用亚硝 酸钠制备校准曲线。

本发明上述实施例化合物1-16的活性氮自由基水平在大约1小时内达到高峰，通常为0.1 至30微摩，从而证实本发明的硝氧基化合物在体内生成一氧化氮，从而对所施用的受试化合 物产生应答。