高山卵叶韭快速繁殖方法

摘要

本发明公开了高山卵叶韭快速繁殖方法，步骤：A、选取高山卵叶韭鳞茎盘为外植体；B、用灭菌的手术刀将鳞茎盘剥离至直径0.3~0.5cm按极性方向竖插于诱导培养基中；C、光照恒温培养，长出丛芽；D、将丛芽切割成数个小丛芽，转入增殖培养基中进行继代增殖培养；E、继代培养过程中的健壮小苗转生根培养基中，待长出根时开瓶炼苗，清洗后移栽到基质中，保温保湿，组培苗成活后移栽。获得的卵叶韭遗传稳定性好，繁殖占用空间小，繁殖速度快，一年一个鳞茎盘可繁殖上百万棵卵叶韭苗。有效解决卵叶韭种植中优质卵叶韭种苗的供应问题。所建立的生产体系稳定、周期较短，能满足规模化种植种苗需求。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，更具体涉及利用高山卵叶韭鳞茎盘为外植体，在基本培养基中附加不同成份对卵叶韭的快速繁殖方法。

背景技术

卵叶韭(Allium ovali folium Hand.-Mzt.)，又名鹿耳韭，在湖北长阳五峰等地俗称“天蒜”，四川汉源等地俗称“山片”，多年生草本。分布于中国的湖北、四川、湖南等地，生长于海拔1800～2100m的地区，多生于阴湿山坡及沟边林下。卵叶韭营养价值高，菜质柔嫩鲜美，口味辛香，又因其生长环境为原生态，为有机蔬菜，当地百姓采食嫩叶。卵叶韭全草是一味中药，性味辛，温，有散瘀，镇痛，祛风，止血等药效，主治跌打损伤、瘀血肿痛、衄血、漆疮等。

卵叶韭居群自然条件下具有性和无性两种繁殖方式，以无性繁殖方式为主。地上部分逐年更新，而每个更新芽生活的全过程在正常条件下为3年。第1年奠基腋芽原基，第2年分化形成更新芽，第3年3月下旬萌发出土，5～6月抽墓消苗，7～8月开花，10月种子成熟，完成生活史。卵叶韭植株开花结实正常，但因种子休眠期在半年左右，所以实生苗占居群中的比例极少。由于卵叶韭天然无害、营养价值高、具有药用价值，近年来深受消费者的喜爱，一些村民受利益驱使，频繁地采挖也使得本来有限的卵叶韭野生资源正逐渐减少。由于种苗制约，目前还无人工大规模种植的相关报道。利用组织培养技术，不但可以快速繁殖，而且可以提供大量优质无病种苗。

发明内容

本发明的目的在于针对现有卵叶韭野生资源大量采挖，而自然状态下以无性繁殖为主的特征，利用组织培养技术，提供高山卵叶韭种苗快速繁殖的方法，采用该方法可有效解决卵叶韭种苗问题，为卵叶韭的人工规模化种植提供保障。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

高山卵叶韭快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)取卵叶韭鳞茎盘清洗后，剥除最外一层鳞茎，消毒；

2)剥除卵叶韭鳞茎盘至直径为0.3～0.5cm，以此鳞茎盘直接按极性方向竖插于配制好的诱导培养基中，诱导培养基的配方为：MS+6-BA 1.5～2.5mg/L+NAA 0.15～0.25mg/L+琼脂4000～6000mg/L+白糖25000～35000mg/L；

3)光照培养，温度为18～22℃，光强1500～2000Lx，每天光照10～12h，培养30～60d，长出丛芽；

4)将丛芽切割成数个0.4cm～0.6cm小丛芽转入继代增殖培养基中，增殖培养基的配方为：MS+6-BA0.5～1.5mg/L+NAA 0.15～0.25mg/L+琼脂4000～6000mg/L+白糖25000～35000mg/L；以后每隔25～35d继代1次，继代培养过程中将苗高3～5cm的小苗转生根培养基中，生根培养基的配方为：MS+NAA 0.05～0.15mg/L+琼脂4000～6000mg/L+白糖30000～60000mg/L；

5)卵叶韭试管苗接种于生根培养基中30～40d，待长3～5条根时开瓶炼苗5～7d，将瓶内苗取出，将组培苗移栽到基质进行常规培养。

以上所述的方法，具体的，步骤1)为取4～5月上旬卵叶韭植株消苗后，未形成花葶前，健康、饱满鳞茎盘，剥净灰褐色至黑褐色网状鳞茎盘外皮和根，用1％质量比洗衣粉水浸泡4～6min，用自来水冲洗干净；剥除最外一层鳞茎，用1％质量比洗衣粉水浸泡4～6min，用自来水冲洗干净；在超净工作台上用75％体积比的酒精溶液浸泡10～30s，用0.1％重量比升汞溶液消毒3～5min，无菌水冲3～5次；

步骤2)为无菌纸吸干外植体表面水分，用灭菌的手术刀剥除卵叶韭鳞茎盘至直径为0.3～0.5cm，按极性方向竖插于配制好的诱导培养基中，诱导培养基的配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L。

步骤4)中增殖培养基的配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；生根培养基的配方为：MS+NAA 0.1mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；

步骤5)为卵叶韭试管苗接种于生根培养基中30～40d，待长3～5条根时开瓶炼苗5～7d，将瓶内苗取出，用0.003％～0.005％重量比NAA溶液浸苗根基部10～15min，将组培苗移栽到基质(草炭/珍珠岩/蛭石＝2/1/1，体积比)中，浇足定根水，盖上小拱棚膜保温保湿，前期温度保持在15～20℃，湿度80～90％，7～15d后揭膜，逐步延长揭膜时间，直至不覆膜，每隔2～3周浇施0.1％～0.3％重量比尿素和0.1％～0.3％重量比KH₂PO₄或稀薄粪水，注意进行病虫害防治，组培苗成活率达95％以上，将成活苗移栽。

所述的MS培养基的成份(单位：mg/L)：

本发明与常规种植技术相比，具有以下优点和效果：

本发明应用卵叶韭4～5月份鳞茎盘为外植体，此时鳞茎盘饱满，鳞茎盘直接分化成丛苗率很高达到95％以上；利用鳞茎盘最里面一层为外植体，使外植体污染率为0。且本发明用鳞茎盘为外植体，直接分化成丛芽，不经过愈伤组织诱导阶段，省去了从愈伤组织阶段进入分化阶段的培养时间30-40天，同时免去了分化培养基的筛选过程。本发明外植体直接形成分化组织，节约了大量时间、人力和物力。

高山卵叶韭快速繁殖体系的建立，为卵叶韭的大规模种植提供一种遗传稳定性好、繁殖占用空间小、周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。可以有效解决卵叶韭种植中的优质卵叶韭种苗供应问题。该方法培养基中用白糖代替蔗糖、用自来水代替蒸馏水，使成本有效降低，不受季节限制。25～35d的繁殖系数达到6～10倍，一年一个鳞茎盘可繁殖百万棵以上卵叶韭种苗，繁殖速度快。以一个鳞茎盘40d继代一次，每次的繁殖倍数为8计算。

具体实施方式

本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，均为市售；所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

高山卵叶韭快速繁殖方法，其步骤是：

1、取4～5月上旬卵叶韭植株消苗后，未形成花葶前，健康、饱满鳞茎盘，剥净灰褐色至黑褐色网状鳞茎外皮和根，用1％质量比洗衣粉水浸泡4min或5min或6min，用自来水冲洗干净；剥除最外一层鳞茎，用1％质量比洗衣粉水浸泡4min或5min或6min，用自来水冲洗干净；在超净工作台上用75％体积比的酒精溶液浸泡10s或15s或20s或25s或30s，用0.1％重量比升汞溶液消毒3min或4min或5min，无菌水冲3次或4次或5次；

2、无菌纸吸干外植体表面水分，用灭菌的手术刀剥除卵叶韭鳞茎盘至直径为0.3cm或0.4cm或0.5cm，按极性方向竖插于配制好的诱导培养基中，诱导培养基的配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；

3、光照培养，温度为18℃或19℃或20℃或21℃或22℃，光强1500Lx或1800Lx或2000Lx，每天光照10h或11h或12h，培养30d或40d或50d或60d，长出丛芽；

4、将丛芽切割成数个0.4cm或0.5cm或0.6cm小丛芽转入继代增殖培养基中，增殖培养基的配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；以后每隔25d或30d或35d继代1次，继代培养过程中将苗高3cm或4cm或5cm的小苗转生根培养基中，生根培养基的配方为：MS+NAA 0.1mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；

5、卵叶韭试管苗接种于生根培养基中30d或35d或40d，待长3条或4条或5条根时开瓶炼苗5d或6d或7d，将瓶内苗取出，用0.004％重量比NAA溶液浸苗根基部10min或12min或15min，将组培苗移栽到基质(草炭/珍珠岩/蛭石＝2/1/1，体积比)中，浇足定根水，盖上小拱棚膜保温保湿，前期温度保持在15℃或16℃或17℃或18℃或19℃或20℃，湿度80％或85％或90％以上，7d或9d或11d或13d或15d后揭膜，第一天中午揭膜时间为1h或2h，后逐渐延长揭膜时间，直至不覆膜，揭膜期间平均温度保持15℃～20℃，湿度保持80％～90％，每隔2～3周浇施0.2％尿素和0.1％KH₂PO₄或稀薄粪水，保证棚内生长期肥水管理条件相一致，注意进行病虫害防治，组培苗成活率达95％以上，繁殖系数是6-10，鳞茎盘直接分化成丛苗率95％以上，外植体污染率是0。

实施例2：

高山卵叶韭快速繁殖方法，其步骤是：

1、取4～5月上旬卵叶韭植株消苗后，未形成花葶前，健康、饱满鳞茎盘，剥净灰褐色至黑褐色网状鳞茎外皮和根，用1％质量比洗衣粉水浸泡5min，用自来水冲洗干净；剥除最外一层鳞茎，用1％质量比洗衣粉水浸泡5min，用自来水冲洗干净；在超净工作台上用75％体积比的酒精溶液浸泡30s，用0.1％重量比升汞溶液消毒4min，无菌水冲5次；

2、无菌纸吸干外植体表面水分，用灭菌的手术刀剥除卵叶韭鳞茎盘至直径为0.3cm或0.4cm或0.5cm，按极性方向竖插于配制好的诱导培养基中，诱导培养基的配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；

3、光照培养，温度为20℃，光强1800Lx，每天光照10h，培养30d，长出丛芽；

4、将丛芽切割成数个0.5cm小丛芽转入继代增殖培养基中，增殖培养基的配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；以后每隔30d继代1次，继代培养过程中将苗高4cm或5cm的小苗转生根培养基中，生根培养基的配方为：MS+NAA 0.1mg/L+琼脂5000mg/L+白糖30000mg/L；

5、卵叶韭试管苗接种于生根培养基中30d，待长3条或4条或5条根时开瓶炼苗6d，将瓶内苗取出，用0.004％重量比NAA溶液浸苗根基部部12min，将组培苗移栽到基质(草炭/珍珠岩/蛭石＝2/1/1，体积比)中，浇足定根水，用量以湿遍苗床基质为度，盖上小拱棚膜保温保湿，前期温度保持在18℃，湿度85％，7d后揭膜，第一天中午揭膜时间为2h，后逐渐延长揭膜时间，直至不覆膜。在整个揭膜过程中，苗床湿度保持在85％，平均温度保持18℃～20℃。每隔2～3周浇施0.2％尿素和0.1％KH₂PO₄，保证棚内生长期肥水管理条件相一致，注意进行病虫害防治，组培苗成活率达98％，繁殖倍数为10，鳞茎盘直接分化成丛苗率98％，污染率是0。