细胞团块收集器及收集体液标本中细胞的方法

摘要

一种细胞团块收集器及收集体液标本中细胞的方法，收集器包括第一离心管，第一离心管内设有筒形的支撑管，支撑管内设有下端伸入第一离心管锥形部分内的第二离心管，第二离心管的锥形部分设有多个出液孔，使用时，第二离心管的锥形部分内放入滤纸，使滤纸与该锥形部分的内壁贴合。体液标本中加入福尔马林，得沉淀物，离心，加入乙醇和蛋白螯合剂，混匀，加注到滤纸上，离心，在滤纸上形成细胞团块，按现有方法包埋、脱水、透明和浸蜡后包埋，制成细胞块石蜡切片，HE染色后，即可进行观察。该收集器能把送检标本固定后的组织进行全部包埋切片，连续切片，提高阳性检出率，克服涂片中细胞重叠堆积、薄厚不均、结构不清的现象，提供更准确的信息。

说明书

技术领域

本发明属于基础医学研究技术领域，涉及一种收集体液标本中细胞的装置，特别涉及一种细胞团块收集器；本发明还涉及一种用该收集器收集体液标本中细胞的方法。 

背景技术

传统的脱落细胞检查，就是取少量胸、腹水、尿液等体液标本进行标本涂片或离心沉淀，取少量涂片，从中查找肿瘤细胞，具有方法简单、经济、且痛苦少等优点为临床所应用。但其缺点是：胸、腹水、尿液离心后，只取其少许沉淀物进行涂片，不能将样本全部制成涂片进行观察，易造成漏诊和误诊，同时细胞涂片较厚，观察者缺乏经验时，易误诊，特别是易导致假阳性。 

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞团块收集器，能收集少量体液标本中的全部细胞，不易造成漏诊和误诊。 

本发明的另一个目的提供一种用上述收集器收集少量体液标本中细胞的方法。 

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种细胞团块收集器，包括第一离心管，第一离心管内设有筒形的支撑管，支撑管内设有第二离心管，第二离心管上的锥形部分穿过支撑管伸入第一离心管的锥形部分内，第二离心管锥形部分的侧壁上设有多个出液孔，使用时，将滤纸放入第二离心管的锥形部分内，并使滤纸与该锥形部分的内壁贴合。 

本发明所采用的另一个技术方案是：一种利用上述细胞团块收集器收集体液标本中细胞的方法，具体按以下步骤进行： 

步骤1：按体积比1︰9，将福尔马林加入体液标本中，使标本固定，自然沉降后，弃去上清液，留沉淀物； 

步骤2：将沉淀物注入离心管，离心，弃去上清液，取沉淀物1～2滴进行常规涂片，在剩余的沉淀物中加入乙醇，混匀后，加入1滴蛋白螯合剂，混匀，得悬浊液；

步骤3：将悬浊液加注到滤纸上，离心，悬浊液中的清液透过滤纸，通过出液孔进入第一离心管内，悬浊液中的固体小颗粒滞留在滤纸上，形成细胞团块；

步骤4：将细胞团块按现有方法进行包埋、脱水、透明和浸蜡后包埋，制成细胞块石蜡切片，进行HE染色后，即可进行观察。

用本发明收集器收集脱落细胞制作石蜡包埋切片具有以下优点： 

1）可以把送检的胸、腹水、尿液等脱落细胞标本固定后的组织进行全部包埋切片，并且可连续切片，减少漏诊，提高了脱落细胞的阳性检出率。

2）克服了涂片中细胞重叠堆积、薄厚不均、结构不清的现象，提供更准确的信息。

3）制作的石蜡包埋切片可长期保存，反复重切，并能做多种特殊染色或免疫组化，对恶性肿瘤的分类有很大的帮助，减少误诊，为临床治疗提供了依据和方便。 

4）不受细胞学检查防冻、防腐、时间长短的限制，可随时留入带有固定液的瓶内，标本的留取量也可适当增多。 

附图说明

图1是本发明收集器的结构示意图。 

用现有的细胞涂片方法对胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色，40×10），见图2和图3。用本发明方法对该胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色，10×10），见图4～图7。 

用本发明方法对上述胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色，10×10），见图8～图11。用现有的细胞涂片方法对该胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色），见图12～图15。 

图1中：1.第一离心管，2.第二工作管，3.支撑管，4.出液孔。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。 

如图1所示，本发明收集器，包括第一离心管1，第一离心管1内设有筒形的支撑管3，支撑管3的下端与第一离心管1的筒形管和锥形部分的结合部相接触，支撑管3内设有第二离心管2，第二离心管2上的锥形部分穿过支撑管3伸入第一离心管1的锥形部分内，第二离心管2锥形部分的侧壁上设有多个出液孔4。 

使用本发明收集器时，将滤纸放入第二离心管2的锥形部分内，并使滤纸与该锥形部分的内壁贴合。 

本发明还提供了一种利用上述收集器收集少量体液标本中细胞的方法，具体按以下步骤进行： 

步骤1：按体积比1︰9，将质量分数35～40%的甲醛溶液20～80mL加入200～800mL体液标本中，使标本固定，然后自然沉降30～60min，弃去上清液，留沉淀物； 

将滤纸放入第二离心管2的锥形部分内，并使滤纸与该锥形部分的内壁贴合；

步骤2：将沉淀物30～50mL注入离心管，以1500～2000r/min 的转速离心10min，弃去上清液，取沉淀物1～2滴进行常规涂片，在剩余的沉淀物中加入1mL质量分数95%的乙醇，混匀后，加入1滴蛋白螯合剂，混匀，得悬浊液；

该蛋白螯合剂为鸡蛋清，用量1滴，约50μL，其用量不能过多，否则影响细胞团块中细胞数量。通过乙醇使蛋清变性、凝固成团块状。

步骤3：将悬浊液加注到第二离心管内的滤纸上，以1500～2000r/min 的转速离心10min，悬浊液中的清液透过滤纸，通过出液孔4进入第一离心管1内，悬浊液中的固体小颗粒滞留在滤纸上，形成细胞团块； 

步骤4：将细胞团块按现有方法进行包埋、脱水、透明和浸蜡后包埋，制成厚度4μm的细胞块石蜡切片，进行HE染色后，即可进行观察。

本发明收集方法中使用的离心机和传统细胞涂片所用离心机一致。 

本发明中，利用福尔马林对标本及时固定，使体液中细胞蛋白质变性，保持细胞原有形态，防止细胞进一步退变、核肿胀，避免在形态学上难以与肿瘤细胞鉴别。利用蛋白螯合剂使散落、单个的细胞凝聚成团块状，便于包埋，切片；且该蛋白螯合剂在免疫组化染色结果判断中，无背景显色。 

对75例标本进行对比观察研究：

1、材料与方法

1.1. 材料：选取白银市第一人民医院2014年1月至09月送检的胸水、腹水标本75例，所有标本均利用细胞团块收集器制作细胞团块。

1.2.方法：送检的标本，一般以200～800mL适宜。将胸水、腹水标本测量体积，并按照体积比1︰9将福尔马林加入标本中，使标本以10%福尔马林（纯的甲醛溶液浓度为35～40%，而临床常用固定标本的固定液是10%福尔马林，即1份甲醛溶液+9份蒸馏水）固定。自然沉降30～60min，弃去上清液，留沉淀物30～50mL，置入50mL离心管中，以2000r/min 离心10min。弃去上清液，取沉淀物1～2滴进行常规涂片，并在剩余沉淀物中加入1mL95%的乙醇，混匀沉淀物，加入1滴鸡蛋清，混匀；将混合液全部置入细胞团块收集仪中，以2000r/min 离心10min，直接取出细胞团块，进行包埋，常规全自动标本脱水处理机脱水、 透明、 浸蜡后包埋， 制成 4μm 厚的细胞块石蜡切片，进行HE染色，免疫组化检测CK、MC、Calretinin、TTF-1、Napsin、CEA、Ki-67免疫标记物的表达，细胞切片和常规的细胞涂片对比观察，进一步鉴别胸腹水的良恶性。 

1.3.试剂：免疫组化染色过程单克隆抗体:CK、MC、Calretinin、TTF-1、Napsin、CEA、Ki-67鼠抗人单克隆抗体及试剂盒UltraSensitive SP购自福州迈新生物技术开发有限公司按试剂盒说明书进行操作，PBS 代替一抗作阴性对照。 

1.4. 结果：细胞学诊断标准按照《细胞病理学诊断图谱及实验技术》，曹跃华等主编，北京科学技术出版社出版。所有涂片需2位有经验的病理副主任医师阅片；免疫组化染色中，CK、MC、Calretinin、Napsin、CEA蛋白表达于细胞膜，Ki-67、TTF-1蛋白表达于细胞核，均呈棕黄色颗粒;阳性细胞>10%为阳性。 

1.5. 统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，定性资料采用χ² 检验。 

 2、结果

2.1.该实验室对2009～2014年1～9月份同期胸、腹水标本癌细胞检出率进行统计研究，其结果如表1。

表1    2009-2014年同期胸、腹水标本癌细胞检出率% 

统计结果显示，2009～2013年1～9月份同期胸腹水癌细胞检测阳性率是27%，2014同期胸腹水癌细胞检测阳性率是67%，是以往普通涂片胸腹水癌细胞检测阳性率的2倍多，二者具有统计学意义（p<0.05），分析其原因，主要是普通涂片的细胞制作程序不规范，不能对送检胸、腹水所有细胞进行检测是关键原因，其次，细胞涂片免疫组化效果没有细胞切片免疫组化效果好。

2.2. 75例胸、腹水脱落细胞免疫表达特点（表2）。 

表2    75例胸、腹水脱落细胞免疫表达特点 

研究结果显示，在恶性胸水中，癌细胞Ki-67核增殖指数是5%～70%，平均在35%左右，CEA阳性率75%～95%，平均93%，CK阳性率100%，Calretinin阳性率10% ，MC阳性率16% ，TTF-1阳性率77%， NapsinA阳性率67%，以上各种免疫表型主要表达在异型性细胞中；在良性胸水中， Ki-67核增殖指数是1%～10%，平均在5%左右，CEA阳性率5%～15%，平均11%，CK阳性率100%，Calretinin阳性率96% ，MC阳性率88%，TTF-1阳性率4.4%，NapsinA阳性率2.2%，以上各种免疫表型主要表达在需要与恶性肿瘤细胞鉴别的异型性细胞中，示增生的间皮细胞。在癌细胞和间皮细胞中Ki-67、CEA、Calretinin、MC、TTF-1、NapsinA的阳性表达率有显著性差异（p<0.05）。在30例癌细胞阳性胸腹水中，胸水25例可见恶性肿瘤细胞，其中腺癌15例，恶性间皮瘤5例，鳞状细胞癌2例，1例T细胞淋巴瘤，其余2例为神经内分泌癌。

结论：利用本发明细胞团块收集器收集胸腹水脱落细胞，进行病理切片、细胞涂片观察细胞形态，极大提高了胸腹水癌细胞检出率；细胞团块收集仪收集胸腹水脱落细胞，进行病理切片，便于免疫组化染色，对肿瘤分类提提供了极大帮助。 

实施例1

按体积比1︰9，将质量分数35%的福尔马林加入200mL体液标本中，使标本固定，然后自然沉降30min，弃去上清液，留沉淀物；将滤纸放入第二离心管的锥形部分内，并使滤纸与该锥形部分的内壁贴合；将沉淀物30mL注入离心管，以2000r/min 的转速离心10min，弃去上清液，取沉淀物1～2滴进行常规涂片，在剩余的沉淀物中加入1mL质量分数95%的乙醇，混匀后，加入1滴蛋白螯合剂，混匀，得悬浊液；将悬浊液加注到第二离心管内的滤纸上，以1500r/min 的转速离心10min，悬浊液中的清液透过滤纸，通过出液孔进入第一离心管内，悬浊液中的固体小颗粒滞留在滤纸上，形成细胞团块；将细胞团块按现有方法进行包埋、脱水、透明和浸蜡后包埋，制成厚度4μm的细胞块石蜡切片，进行HE染色后，即可进行观察。

用现有的细胞涂片方法对胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色，40×10），见图2和图3。用本发明方法对该胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色，10×10），见图4～图7。从图2和图3可以看出：大量红细胞、多量淋巴细胞及少许中性粒细胞单个瘤细胞，核大、深染、核浆比例失调，核形不规则，染色质较深。说明用现有的细胞涂片方法制得的涂片厚，瘤细胞呈单个，无结构，不易与肿瘤细胞区别。图4～图7显示：见腺样、乳头状、桑葚样排列的瘤细胞，核大、深染、核浆比例失调，核形不规则，染色质较深。说明用本发明细胞收集器收集的细胞团块的细胞切片较薄，瘤细胞排列特有方式（桑葚样、乳头状、周围能有完整连线。 

实施例2

按体积比1︰9，将质量分数40%的福尔马林加入800mL体液标本中，使标本固定，然后自然沉降60min，弃去上清液，留沉淀物；将滤纸放入第二离心管的锥形部分内，并使滤纸与该锥形部分的内壁贴合；将沉淀物50mL注入离心管，以1500r/min 的转速离心10min，弃去上清液，取沉淀物1～2滴进行常规涂片，在剩余的沉淀物中加入1mL质量分数95%的乙醇，混匀后，加入1滴鸡蛋清，混匀，得悬浊液；将悬浊液加注到第二离心管内的滤纸上，以2000r/min 的转速离心10min，悬浊液中的清液透过滤纸，通过出液孔进入第一离心管内，悬浊液中的固体小颗粒滞留在滤纸上，形成细胞团块；将细胞团块按现有方法进行包埋、脱水、透明和浸蜡后包埋，制成厚度4μm的细胞块石蜡切片，进行HE染色后，即可进行观察。

用本发明方法对上述胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色，10×10），见图8～图11。用现有的细胞涂片方法对该胸水脱落细胞进行检测的显微镜图（HE 染色），见图12～图15。图8～图11显示，能见腺管、超团状、桑葚样排列的瘤细胞，核大小不一、极向紊乱，深染、核浆比例失调，核形不规则，染色质较深。说明用本发明细胞收集器收集的细胞团块的细胞切片较薄，瘤细胞排列特有方式（腺管状排列，周围能有完整连线）。图12～图15显示，大量红细胞，少量淋巴细胞及少许中性粒细胞，部分细胞核大、深染、核浆比例失调，核形不规则，染色质较深，呈簇状、乳头状、桑葚样排列。用现有的细胞涂片方法制得的涂片厚，瘤细胞团块状或散在单个，细胞结构不清，不易与肿瘤细胞区别。 

实施例3

按体积比1︰9，将质量分数38%的福尔马林加入500mL体液标本中，使标本固定，然后自然沉降45min，弃去上清液，留沉淀物；将滤纸放入第二离心管的锥形部分内，并使滤纸与该锥形部分的内壁贴合；将沉淀物40mL注入离心管，以1750r/min 的转速离心10min，弃去上清液，取沉淀物1～2滴进行常规涂片，在剩余的沉淀物中加入1mL质量分数95%的乙醇，混匀后，加入1滴鸡蛋清，混匀，得悬浊液；将悬浊液加注到第二离心管内的滤纸上，以1750r/min 的转速离心10min，悬浊液中的清液透过滤纸，通过出液孔进入第一离心管内，悬浊液中的固体小颗粒滞留在滤纸上，形成细胞团块；将细胞团块按现有方法进行包埋、脱水、透明和浸蜡后包埋，制成厚度4μm的细胞块石蜡切片，进行HE染色后，即可进行观察。