一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法，能够实现同时检测出待测标本中是否含禽流感病毒H4亚型和禽流感病毒H6亚型两种病原体，并能够实时精确检测并对病毒进行定量，应用极为方便。由于引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级动物卫生监督所、动物疫病预防控制中心动物医院和各种动物疾病研究机构等大规模筛查的推广应用，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型病毒(AIV)引起的一种禽类感染或疾病综合征。禽流感的发病情况取决于病毒的致病性及一级宿主的易感性，也受环境因素、饲养管理条件及并发疾病等因素的影响，可表现为无症状感染、轻度上呼吸道症状、产蛋量下降及急性的致病性死亡。

2008年我国南方活禽市场监测到一株鸭源H4亚型禽流感病毒（H4N2），而从2009年起在中国南方禽流感疫情监测中分离到多株H4亚型禽流感病毒（AIV），目前发现的禽流感H4亚型尚未形成对哺乳动物的全身性感染，但病毒来源复杂，抗原和基因型差异大，若H4亚型禽流感与高致病禽流感发生重组有可能构成巨大的危害。

H6亚型禽流感，在家禽中广泛存在，致病性和传播力都比较低。2013年6月，台湾出现全球首例H6N1患者，虽然只是个案，但表明H6亚型禽流感有潜在的传染人的能力。

由于H4、H6禽流感不具备高致病性，且未出现规模性的哺乳动物感染，目前常规的H4和H6检测方法，还是血清学诊断方法，其中最常用的为血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验，市场上鲜有相应的PCR试剂盒检测产品。血清学诊断方法建立在已发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且由于禽流感病毒具备高度变异性和重组性，很容易出现假阳性和假阴性。使用病毒分离培养的方法进行检测，操作繁琐，耗时长，难以大规模推广。用普通PCR的方法，相比前面所说的方法灵敏度和可操作性都有提升，然而后续的琼脂糖凝胶电泳仍然不够简便，且容易出现非特异扩增和产物污染。

实时RT-PCR（real time RT-PCR，RRT-PCR）又称TaqMan PCR。RRT-PCR检测禽流感快速、敏感、特异，由于其不仅采用了特异性引物，而且采用了特异性探针，使该方法的特异性高于传统PCR，大大减少了非特异性扩增造成的假阳性结果。全封闭反应的荧光RT-PCR技术是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现了对PCR扩增过程实时监测，无需电泳检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。应用一步法RT-PCR和荧光水解探针，用于检测A型禽流感，其敏感度很高，可达10 fg（约100个）的靶RNA分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含：

用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针，其序列如下：

H4-F：5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’（SEQ ID NO.1），

H4-R：5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’（SEQ ID NO.2），

H4-P：5’- TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’（SEQ ID NO.3）；

和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针，其序列如下：

H6-F：5’- TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’（SEQ ID NO.4），

H6-R：5’- CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’（SEQ ID NO.5），

H6-P：5’- TGATCATGGCAATAGG –MGB-3’（SEQ ID NO.6）；

其中，荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同。

优选的，所述试剂盒还包含10×双色荧光定量PCR buffer，其含有以下成分：500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl₂、250mM KCl以及15v/v%的DMSO。

优选的，所述试剂盒还包含病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B；病毒提取液A每1000ml中含有：异硫氰酸胍480g，0.1M Tris-HCl（pH 6.4）500ml，0.2M EDTA（pH8.0）120ml；病毒提取液B为异丙醇。

一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

1）提取待测样品中的总RNA；

2）以得到的总RNA为模板，使用用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针

H4-F：5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’（SEQ ID NO.1），

H4-R：5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’（SEQ ID NO.2），

H4-P：5’- TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’（SEQ ID NO.3），

和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针

H6-F：5’- TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’（SEQ ID NO.4），

H6-R：5’- CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’（SEQ ID NO.5），

H6-P：5’- TGATCATGGCAATAGG -MGB -3’（SEQ ID NO.6）；

进行双色荧光定量PCR检测，其中，荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同；

3）结果分析：反应结束后，根据荧光Ct值判断待测样品是否为禽流感病毒H4亚型、禽流感病毒H6亚型阳性。

优选的，双色荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其组成如下：双色荧光定量PCR Mix 20μl，反转录酶、Taq酶混合液1μl，以及提取的待测样品中的总RNA或者阳性质控品或者阴性质控品4μl；其中，双色荧光定量PCR Mix中含有H4-F、H4-R、H4-P、H6-F、H6-R、H6-P以及10×双色荧光定量PCR buffer、dNTPS。

优选的，所述10×双色荧光定量PCR buffe含有以下成分：500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl₂、250mM KCl以及15v/v%的DMSO。

双色荧光定量PCR Mix的组成为：

10×双色荧光定量PCR buffer             2.5μl

H4-F（10μM）                          1μl

H4-R（10μM）                          1μl

H6-F（10μM）                          1μl

H6-R（10μM）                          1μl

H4-P（10μM）                          0.5μl

H6-P（10μM）                         0.5μl

dNTPS (10mM)                         1μl

ddH₂O（Rnase free）                    11.5μl 

总体积                                 20.0μl。

优选的，双色荧光定量PCR反应条件为： 93℃ 2分钟，93℃ 5～30秒，55～58℃ 45秒，40个循环。

优选的，步骤3）结果分析的条件设定如下：

1）设置基线：对ABI 7000、7500、7700仪器设为6～15个循环，对PE5700设为3～15个循环，对MJ Research Option2仪器设为6～12个循环；

2）  设置阈值：以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为原则。

优选的，步骤3）结果分析判断方法如下：

1）阳性：Ct值小于等于35.0，且曲线有指数增长期；

2）可疑：Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有指数增长期，为阳性，否则为阴性；

3）阴性：检测不到样品Ct值或Ct值为40。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法，能够实现同时检测出待测标本中是否含禽流感病毒H4亚型和禽流感病毒H6亚型两种病原体，并能够实时精确检测并对病毒进行定量，应用极为方便。由于引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级动物卫生监督所、动物疫病预防控制中心动物医院和各种动物疾病研究机构等大规模筛查的推广应用，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对禽流感病毒H4亚型（AIV-H4）检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μl的标准品的扩增结果。

图2 为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对禽流感病毒H6亚型（AIV-H6）检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×104、1×10³、1×10²拷贝/μl的标准品的扩增结果。

图3为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对AIV-H4检测的特异性实验结果。

图4为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对AIV-H6检测的特异性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明内容。

特异性引物及探针的设计：

根据从Genbank上检索到的禽流感病毒（Avian influenza virus）H1～H16的核酸序列，设计用于检测禽流感病毒H4亚型和禽流感病毒H6亚型的引物和探针，其序列如下：

禽流感病毒H4亚型（AIV-H4）的

上游引物：H4-F：5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’（SEQ ID NO.1），

下游引物：H4-R：5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’（SEQ ID NO.2），

荧光探针：H4-P：5’- TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’（SEQ ID NO.3），扩增片段长度为75bp；

和

禽流感病毒H6亚型（AIV-H6）的

上游引物：H6-F：5’- TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’（SEQ ID NO.4），

下游引物：H6-R：5’- CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’（SEQ ID NO.5），

荧光探针：H6-P：5’- TGATCATGGCAATAGG -MGB -3’（SEQ ID NO.6），扩增片段长度为136bp。

进行双色荧光定量PCR检测，其中，禽流感病毒H4亚型报告基团为Fam，禽流感病毒H6亚型的荧光探针报告基团为Vic。

标本采集和预处理：

本方法及试剂盒适用标本类型包括禽类的组织、血清、咽拭子、分泌排泄物等。

组织标本：无菌条件下取组织约100～200mg，置入1.5ml洁净EP管中，保存待检。

血清：用一次性无菌注射器抽取受检鸟静脉血3-5ml，留取血清，保存待检。

咽及泄殖腔等拭子：用棉拭子取咽或泄殖腔分泌物，将拭子放入盛有1.0ml PBS的离心管中，立即送检。

分泌排泄物：无菌条件下采集，保存待检。采集的标本应该尽快送检，或者保存于-20℃。

阳性质控品的制备：

分别以禽流感病毒H4亚型（AIV-H4）和禽流感病毒H6亚型（AIV-H6）RNA标准品为模板，进行PCR扩增，步骤如下：

反转录体系：

Oligo dT Primer (50μM) 1μl、dNTP Mixture (10mM ) 1μl以及总RNA 2μg，65℃ 5min，激冷，然后加入5×PrimeScript Buffer 4μl（TAKARA公司）、RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl、PrimeScript RTase (200 U/μl) 1μl和RNase free H₂O 4.5μl。

反转录条件：

30℃ 10min，然后42℃，30min，进行逆转录和成cDNA。

PCR体系：

10×PCR Buffer 5μl、TaKaRa Taq（5U/μl） 1μl 、dNTP Mixture（各2.5mM） 4μl、 上述H4和H6上下游引物（10μM）各0.5μl、上述cDNA 0.5μl和RNase free H₂O 39.25μl。

PCR条件：

按照94℃ 3分钟预变性，94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 45秒，共35个循环，72℃延伸10分钟。

反应后取5μl PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测，将切胶纯化的PCR产物与pMD-18T载体连接，重组质粒pMD-18T-H4或pMD-18T-H6涂布于培养皿上，转化感受态DH5α细胞，挑取阳性菌落抽提质粒，取品5μl稀释测其A260nm和A280nm吸光度值，计算其浓度并换算成绝对拷贝数，稀释成1.0×10⁷拷贝/μl，作为双色荧光定量PCR的阳性质控品。 

RNA的提取：

1)        固体组织：取0.5g左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml的EP管中，10000rpm离心2min，取上清100μl于1.5ml的EP管中，加入200μl RNA提取液A充分震荡，静置3min；

2)        血清或病毒液：取100μl血清加入200μl RNA提取液A充分震荡，静置3min，然后加入200μl RNA提取液B，用力震荡15s，4℃ 13,000rpm离心5min；

3)        弃上清，加入1ml 75%乙醇，充分混匀，13,000rpm离心5min，小心吸去大部分残留液体；

4)        将提取管敞口在室温空气中干燥10min，使液体挥发干净，用20μl  DEPC处理水溶解沉淀即为待检测的病毒RNA。

双色荧光定量PCR扩增：

每个测试反应体系配制如下，双色PCR Mix 20μl、反转录酶系0.5μl、Taq酶系0.5μl，瞬时离心，然后加入待检测的RNA 4μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl进行扩增。

将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类（检测AIV-H4的报告基团选择FAM，检测AIV-H6的报告基团选择VIC，淬灭基团选择TAMRA)，设定循环条件：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等仪器循环条件为93℃ 2分钟，93℃ 30秒，55℃ 45秒，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器循环条件为93℃ 2分钟，93℃ 5秒，58℃ 45秒，共40个循环。

结果分析和判定：

1、结果分析条件设定

1)        设置基线（baseline）：对ABI 7000、7500、7700等仪器设为6-15cycle，对PE5700设为3-15cycle，对MJ Research Option2设为6-12cycle。特殊情况可对基线适当调整。

2)        设置阈值（threshold）：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点。

2、结果判断

(1) 阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；

(2) 可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

(3) 阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。

灵敏度实验：

上述阳性质控品（10⁷拷贝/μl），依次稀释为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷贝/μl，进行灵敏度实验。

双色荧光定量PCR体系中AIV-H4检测的敏感性实验见图1，双色荧光定量PCR体系中AIV-H6检测的敏感性实见图2。图1为双色荧光PCR体系中AIV-H4检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μl的标准品的扩增结果。图2 为双色荧光PCR体系中AIV-H6检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μl的标准品的扩增结果。

结果证实本试剂盒检测灵敏度为：1.0×10²μl^-1，该双色荧光定量PCR的方法敏感度为普通PCR的200倍，精确性优于普通PCR方法。

特异性实验：

根据上述的双色荧光定量PCR检测方法，用禽流感病毒H4亚型、禽流感病毒H6亚型、二者双阳性以及其它病毒如猪流感H1N1(SIV-H1N1)、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒H5N1亚型（AIV-H5N1）、禽流感病毒H7N9亚型（AIV-H7N9）、禽流感病毒H9N2（AIV-H9N2）、阴性对照进行验证实验并对产物进行测序验证，结果证实，本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性，吻合度为100%，实验结果见图3和图4。

图3为双色方法PCR体系中禽流感病毒H4亚型（AIV-H4）的特异性实验结果，AIV-H4为阳性、SIV-H1N1、AIV-H6N1、AIV-H5N1、AIV-H7N9、AIV-H9N2、NDV及阴性质控品均为阴性。

图4为双色方法PCR体系中禽流感病毒H6亚型（AIV-H6）的特异性实验结果，AIV-H6为阳性、SIV-H1N1、AIV-H4N2、AIV-H5N1、AIV-H7N9、AIV-H9N2、NDV及阴性质控品均为阴性。

<110>  广州维伯鑫生物科技有限公司

 

<120>  一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gatttcgttc tccatatcat gcttt                                             25

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ccattctgac aagcccacaa                                                   20

 

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tgcttgtagc actgcttttg gccttca                                           27

 

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tcgagcagtc tagttttggt agga                                              24

 

 

<210>  5

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cactgcattg aaccatttga aca                                               23

 

 

<210>  6

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

tgatcatggc aatagg                                                       16