获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白，为如下（a）或（b）或（c）或（d）或（e）：（a）由序列表的序列1自N端第24至99位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）由序列表的序列4自N端第20至98位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）由序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（e）将（a）或（b）或（c）或（d）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。本发明进一步证实，AaDEF蛋白可以有效降低登革热病毒的感染能力。本发明具有广阔应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用。

背景技术

防御素(antimicrobial peptide)是一类大自然界广泛存在的活性小肽，也称为宿 主防御肽（host defense peptide）。生物体在受到刺激时就会诱导产生防御素。防御 素通常是由10-50多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，含有4个或多于4个带正电荷 的氨基酸（如赖氨酸或精氨酸），N端亲水C端疏水，具有双亲的性质。防御素水溶性好， 大部分防御素具有热稳定性（在100℃加热10-15min仍能保持其活性）。多数防御素的 等电点大于7，表现出较强的阳离子特性，对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具 有较强的抗性，此外部分防御素具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。

防御素根据其来源分类，可以分成六大类：（1）昆虫防御素；（2）哺乳动物防御 素；（3）两栖动物防御素；（4）鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的防御素；（5）植 物防御素；（6）细菌防御素。昆虫的免疫系统缺乏获得性免疫系统，只有天然免疫系 统，防御素是其天然免疫系统的一个重要组成部分。昆虫防御素具有分子小，抗菌谱 广，来源丰富，且仅作用于原核细胞及病变的真核细胞的特点，为替代抗生素提供了 新的途径。

除此之外，人们还发现，某些防御素对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭 作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程，而且不破坏人体的正常细胞的特性。 如能很好地开发利用，有望给临床医学、临床药学、食品加工、动物和植物转基因技 术等领域带来革命性的进展，有着非常广阔的开发利用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用。

本发明提供了一种获自埃及伊蚊的防御素，将其命名为AaDEF蛋白，为如下（a） 或（b）或（c）或（d）或（e）：（a）由序列表的序列1自N端第24至99位氨基酸残 基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）由序 列表的序列4自N端第20至98位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）由序列表的序列4 所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（e）将（a）或（b）或（c）或（d）经过一个或几 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。

编码所述AaDEF蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述AaDEF蛋白的基因可为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6） 或（7）或（8）所述的DNA分子：（1）序列表的序列2自5’末端第70至297位核苷 酸所示的DNA分子；（2）序列表的序列2所示的DNA分子；（3）序列表的序列3所示 的DNA分子；（4）序列表的序列5自5’末端第58至294位核苷酸所示的DNA分子； （5）序列表的序列5所示的DNA分子；（6）序列表的序列6所示的DNA分子；（7）在 严格条件下与（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）限定的DNA序列杂交且编 码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；（8）与（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或 （6）或（5）或（6）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有抗菌肽功能 的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂 交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有编码所述AaDEF蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均 属于本发明的保护范围。

具有所述AaDEF蛋白的融合蛋白（简称AaDEF融合蛋白）也属于本发明的保护范 围。

所述AaDEF融合蛋白可为如下（f）或（g）或（h）或（i）或（j）：（f）由序列 表的序列9自N端第19至127位氨基酸残基组成的蛋白质；（g）由序列表的序列9 所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（h）由序列表的序列11自N端第19至130位氨基 酸残基组成的蛋白质；（i）由序列表的序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（j） 将（f）或（g）或（h）或（i）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。

编码所述AaDEF融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述AaDEF融合蛋白的基因可为如下（9）或（10）或（11）或（12）或（13） 或（14）所述的DNA分子：（9）序列表的序列10自5’末端第55至381位核苷酸所 示的DNA分子；（10）序列表的序列10所示的DNA分子；（11）序列表的序列12自5’ 末端第55至390位核苷酸所示的DNA分子；（12）序列表的序列12所示的DNA分子； （13）在严格条件下与（9）或（10）或（11）或（12）限定的DNA序列杂交且编码具 有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；（14）与（9）或（10）或（11）或（12）限定的DNA 序列至少具有90%以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条 件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和 1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有编码所述AaDEF融合蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组 菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种抑制微生物增殖和/或复制和/或感染的产品，包括所述AaDEF 蛋白或所述AaDEF融合蛋白。所述微生物可为病毒，具体可为登革热病毒，更具体可 为登革热2型病毒，如New Guinea C株。

本发明还保护所述AaDEF蛋白或所述AaDEF融合蛋白载制备试剂盒中的应用；所 述试剂盒的功能为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体 可为登革热病毒，更具体可为登革热2型病毒，如New Guinea C株。

本发明还保护所述AaDEF蛋白或所述AaDEF融合蛋白的应用；所述应用为抑制微 生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体可为登革热病毒，更具体 可为登革热2型病毒，如New Guinea C株。

本发明在埃及伊蚊中鉴定两种新的防御素（AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白，因同源 性很高，统称为AaDEF蛋白），实验结果显示该两种防御素可以有效降低病原体增殖的 能力。防御素是生物体内可诱导的一类小分子，一般含有29～34个氨基酸残基，其中 6个保守的半胱氨酸形成3个分子内二硫键。防御素通过结合到病原微生物的膜上发 挥作用，属于抗菌肽家族。本发明发现，AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白均被登革热病毒 感染诱导表达，在埃及伊蚊体内沉默AaDEFC基因或AaDEFD基因可以显著降低埃及伊 蚊免疫系统对登革热病毒感染的阻抑作用，AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白可以有效降低 登革热病毒的感染能力。本发明具有广阔应用前景。

附图说明

图1为实施例1的结果。

图2为实施例2和实施例3的结果。

图3为实施例4和实施例5中的Westernblot图谱。

图4为实施例4和实施例5中，Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

埃及伊蚊（Aedes aegypti）：参考文献：Colpitts TM,Cox J,Vanlandingham DL, Feitosa FM,Cheng G,et al.(2011)Alterations in the Aedes aegypti  Transcriptome during Infection with West Nile,Dengue and Yellow Fever Viruses. PLoS Pathog7(9):e1002189.doi:10.1371/journal.ppat.1002189.。

实施例中所用的登革热2型病毒（dengue virus type-2，DENV-2）均为登革热2 型病毒New Guinea C株；参考文献：Chao Y C,Huang C S,Lee C N,et al.Higher  infection of dengue virus serotype2in human monocytes of patients with G6PD  deficiency[J].PloS one,2008,3(2):e1557.。

质粒pMT/BiP/V5-HisA：Invitrogen公司，产品目录号V4130-20。S2细胞（果蝇 S2细胞）：invitation，产品目录号R690-07。Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）： CCL-81^TM。

MID₅₀(50%mosquito Infectious dose)即半数蚊子感染剂量；MID₅₀的数值含义为 通过胸腔注射病毒稀释液300nL使半数埃及伊蚊感染病毒的稀释倍数；1MID₅₀为将病毒 原液稀释其MID₅₀数值倍数后，胸腔注射300nL可使半数埃及伊蚊感染。

发明人从埃及伊蚊中发现两种高同源性的多肽，属于防御素，分别命名为AaDEFC 蛋白和AaDEFD蛋白。AaDEFC蛋白如序列表的序列1所示（自N末端第1至23位氨基酸残基 组成信号肽，第24至99位氨基酸残基组成AaDEFC成熟肽），其编码基因命名为AaDEFC 基因，如序列表的序列3所示（其中开放阅读框如序列表的序列2所示）。AaDEFD蛋白如 序列表的序列4所示（自N末端第1至19位氨基酸残基组成信号肽，第20至98位氨基酸残 基组成AaDEFD成熟肽），其编码基因命名为AaDEFD基因，如序列表的序列6所示（其中 开放阅读框如序列表的序列5所示）。AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白具有抗菌肽的功能，可 以抑制登革热病毒的增殖和/或复制和/感染。

实施例1、DENV-2诱导埃及伊蚊体内AaDEFC基因和AaDEFD基因的表达

1、分组处理

实验组（20只）：给埃及伊蚊接种登革热2型病毒（每只埃及伊蚊通过胸腔注射 剂量为10MID₅₀的DENV-2，注射体积为300nL）；

对照组（22只）：每只埃及伊蚊通过胸腔注射300nL PBS缓冲液。

2、完成步骤1的接种6h后，提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，利用荧光 定量PCR（SYBR Green）检测埃及伊蚊体内AaDEFC基因和AaDEFD基因的表达情况（采 用Actin基因为内参）。

用于鉴定AaDEFC基因的引物如下：

上游引物：5’-CTTTGTTTGATGAACTTCCGGAG-3’；

下游引物：5’-GAACCCACTCAGCAGATCGC-3’。

用于鉴定AaDEFD基因的引物如下：

上游引物：5’-GGCGTTGGTGATAGTGCTTG-3’；

下游引物：5’-CACACCTTCTTGGAGTTGCAG-3’。

用于鉴定Actin基因的引物如下：

上游引物：5’-GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3’；

下游引物：5’-TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3’。

结果见图1(A为AaDEFC基因的相对表达量，B为AaDEFD基因的相对表达量）。 结果表明，注射登革热病毒后，埃及伊蚊体内AaDEFC基因和AaDEFD基因的表达明显 上升。

实施例2、抑制AaDEFC基因表达的物质在促进登革热病毒复制中的应用

一、制备dsRNA

1、设计用于制备抑制AaDEFC基因表达的dsRNA的编码DNA的引物如下：

AaDEFC-F：5’-GCACGTACGATCGCCTGTC-3’；

AaDEFC-R：5’-CGAGAAACTCAAAATAAACCGATAC-3’。

上述引物中，方框标注的区域为T7启动子序列。

2、提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，用AaDEFC-F和AaDEFC-R 组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，采用Ambion MEGAscriptT7High Yield  Transcription Kit（产品目录号为AM1334）并按试剂盒说明书进行体外转录，由于 AaDEFC-F和AaDEFC-R都具有T7启动子，体外转录形成两条反向互补的单链RNA分子，该 两条反向互补的单链RNA分子自发形成序列表的序列7所示的双链RNA分子（dsRNA-1）。

4、设计用于制备抑制GFP基因表达的dsRNA的编码DNA的引物如下：

GFP-F:5’-GTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’；

GFP-R:5’-CATGATATAGACGTTGTGGCTGTT-3’；

上述引物中，方框标注的区域为T7启动子序列。

5、合成序列表的序列13所示的双链DNA分子，以合成的双链DNA分子为模板，用 GFP-F和GFP-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

6、取步骤5得到的PCR扩增产物，采用Ambion MEGAscriptT7High Yield  Transcription Kit（产品目录号为AM1334）并按试剂盒说明书进行体外转录，由于 GFP-F和GFP-R都具有T7启动子，体外转录形成两条反向互补的单链RNA分子，该两条反 向互补的单链RNA分子自发形成双链RNA分子（dsRNA-2）。

二、抑制AaDEFC基因表达的物质在促进登革热病毒复制中的应用

1、将埃及伊蚊分成两组，分别进行如下处理：

实验组：每只埃及伊蚊通过胸腔注射2微克dsRNA-1；

对照组：每只埃及伊蚊通过胸腔注射2微克dsRNA-2；

2、完成步骤1的注射3天后，给埃及伊蚊接种登革热2型病毒（每只埃及伊蚊通 过胸腔注射剂量为10MID₅₀的DENV-2，注射体积为300nL）。

3、完成步骤2的接种6天后，提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，利用Taqman  RT-QPCR检测埃及伊蚊体内的登革热2型病毒量（采用Actin基因为内参）。

用于检测登革热2型病毒的引物对如下：

上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；

下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。

用于检测登革热2型病毒的探针如下：

5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。

用于检测Actin基因的引物对如下：

上游引物：5’-GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3’；

下游引物：5’-TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3’。

用于检测Actin基因的探针如下：

5’-FAM-AGGCCCCGCTCAACCCGAAG-TRAMA-3’。

埃及伊蚊体内的登革热2型病毒的病毒量见图2（每个实心圆点代表一只埃及伊 蚊）。

结果表明，导入用于抑制AaDEFC基因表达的dsRNA-1后，埃及伊蚊体内的登革热 2型病毒的病毒量出现明显上升，即抑制AaDEFC基因表达可以促进登革热2型病毒在 埃及伊蚊体内的复制，即AaDEFC基因可以抑制登革热2型病毒在埃及伊蚊体内的复制。

实施例3、抑制AaDEFD基因表达的物质在促进登革热病毒复制中的应用

一、制备dsRNA

1、设计用于制备抑制AaDEFD基因表达的dsRNA的编码DNA的引物如下：

AaDEFD-F：5’-CATCATTCAATTCCACAAGCTC-3’；

AaDEFD-R：5’-GATCATAATAACAATGCGGC-3’。

上述引物中，方框标注的区域为T7启动子序列。

2、提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，用AaDEFD-F和AaDEFD-R 组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，采用Ambion MEGAscriptT7High Yield  Transcription Kit（产品目录号为AM1334）并按试剂盒说明书进行体外转录，由于 AaDEFD-F和AaDEFD-R都具有T7启动子，体外转录形成两条反向互补的单链RNA分子，该 两条反向互补的单链RNA分子自发形成序列表的序列8所示的双链RNA分子（dsRNA-3）。

二、抑制AaDEFD基因表达的物质在促进登革热病毒复制中的应用

1、将埃及伊蚊分成两组，分别进行如下处理：

实验组：每只埃及伊蚊通过胸腔注射2微克dsRNA-3；

对照组：每只埃及伊蚊通过胸腔注射2微克实施例2的步骤一制备的dsRNA-2；

2、完成步骤1的注射3天后，给埃及伊蚊接种登革热2型病毒（每只埃及伊蚊通 过胸腔注射剂量为10MID₅₀的DENV-2，注射体积为300nL）。

3、完成步骤2的接种6天后，提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，利用Taqman  RT-QPCR检测埃及伊蚊体内的登革热2型病毒量（采用Actin基因为内参）。

用于检测登革热2型病毒的引物对如下：

上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；

下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。

用于检测登革热2型病毒的探针如下：

5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。

用于检测Actin基因的引物对如下：

上游引物：5’-GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3’；

下游引物：5’-TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3’。

用于检测Actin基因的探针如下：

5’-FAM-AGGCCCCGCTCAACCCGAAG-TRAMA-3’。

埃及伊蚊体内的登革热2型病毒的病毒量见图2（每个实心圆点代表一只埃及伊 蚊）。

结果表明，导入用于抑制AaDEFD基因表达的dsRNA-3后，埃及伊蚊体内的登革热 2型病毒的病毒量出现明显上升，即抑制AaDEFD基因表达可以促进登革热2型病毒在 埃及伊蚊体内的复制，即AaDEFD基因可以抑制登革热2型病毒在埃及伊蚊体内的复制。

实施例4、AaDEFC蛋白在抑制病毒复制过程中的应用

一、重组质粒pMT-AaDEFC-V5-HisA的构建

1、提取埃及伊蚊的总RNA并反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。

F1：5’-CGAAGATCTCTCCCAGAGGAACTGGCCG-3’；

R1：5’-CAGACTCGAGATTTCGACAAACGCAAACCTTTTTC-3’。

3、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切质粒pMT/BiP/V5-HisA，回收约5000bp 的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒 pMT-AaDEFC-V5-HisA。根据测序结果，对重组质粒pMT-AaDEFC-V5-HisA进行结构描述 如下：在质粒pMT/BiP/V5-HisA的BglII和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2 自5’末端第70至297位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒中，插入的双链DNA 分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列10所示的融合基因，表达序列表的序 列9所示的融合蛋白。

序列表的序列9中，自N末端第1至18位氨基酸残基为信号肽（成熟后被切除）， 第21至96位氨基酸残基为AaDEFC成熟肽，第105至118位氨基酸残基组成V5标签， 第122至127位氨基酸残基为6×His标签。序列表的序列9中，自N末端第19至127 位氨基酸残基组成融合蛋白的成熟肽（由109个氨基酸残基组成，分子量约11.81KD）。

6、借助转染试剂（Effectene Transfection Reagent,购自Qiagen,产品目录号 为301425）并按说明书进行操作，将重组质粒pMT-AaDEFC-V5-HisA转入S2细胞，转 染24h后用500mM浓度的Cu²⁺（以CuSO₄的形式加入）诱导48h（即28℃静置培养）， 收集上清液并采用Anti-V5鼠单克隆抗体（Anti-V5-tag mAb，购自MBL公司，产品目 录号为M167-3）作为一抗进行Westernblot，图谱见图3（发生了修饰，所以每个泳 道显示两条带），可以观察到检测到特异的阳性条带。

二、AaDEFC蛋白在抑制病毒复制中的应用

1、实验组的处理

（1）借助转染试剂（Effectene Transfection Reagent,购自Qiagen，产品目录 号为301425）并按说明书进行操作，将重组质粒pMT-AaDEFC-V5-HisA转入S2细胞， 转染24h后用500mM浓度的Cu²⁺（以CuSO₄的形式加入）诱导48h（即28℃静置培养）， 收集上清液。

（2）在步骤（1）得到的上清液中加入登革热2型病毒的病毒液，使登革热2型 病毒的浓度为10⁴Pfu/mL，28℃静置孵育2h。

（3）将2×10⁶个细胞/ml的Vero细胞的细胞液铺6孔板，每孔2ml。

（4）将步骤（2）得到的溶液加入步骤（3）得到的6孔板，每孔1ml，37℃静置 培养3h，然后更换DMEM完全培养基（购自Life Technology,产品目录号为11965-084） 培养24h。

（5）完成步骤（4）后，吸弃上清，用pH7.4的PBS缓冲液清洗细胞一次，然后 采用RNA抽提试剂盒（AxyPrep总RNA小量制备试剂盒，购自Axygen,产品目录号为 AP-MN-MS-RNA-250）提取总RNA，然后采用逆转录试剂盒（iScript cDNA Synthesis Kit, 购自Bio-Rad，产品目录号为170-8890）进行逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，利 用Taqman RT-QPCR检测Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量（采用GADPH基因为内 参）。

用于检测登革热2型病毒的引物对如下：

上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；

下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。

用于检测登革热2型病毒的探针如下：

5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。

用于检测GADPH基因的引物对如下：

上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’；

下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

用于检测GADPH基因的探针如下：

5’-FAM-CCGACTCTTGCCCTTCGA AC-TRAMA-3’。

2、对照组的处理

用质粒pMT/BiP/V5-HisA代替重组质粒pMT-AaDEFC-V5-HisA，其它同步骤1。

3、结果分析

实验组和对照组中，Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量见图4（进行三次重复 实验，每次重复实验中设置5个重复处理，结果取平均值）。结果表明，加入AaDEFC 蛋白后，Vero细胞内的登革热2型病毒的病毒量出现明显下降，即AaDEFC蛋白可以 抑制登革热2型病毒在Vero细胞中的复制。

实施例5、AaDEFD蛋白在抑制病毒复制过程中的应用

一、重组质粒pMT-AaDEFD-V5-HisA的构建

1、提取埃及伊蚊的总RNA并反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。

F2：5’-CGAAGATCTGCCTACCCACAGGAACCGG-3’；

R2：5’-CAGACTCGAGATTCCGGCAGACGCACACC-3’。

3、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切质粒pMT/BiP/V5-HisA，回收约5000bp 的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒 pMT-AaDEFD-V5-HisA。根据测序结果，对重组质粒pMT-AaDEFD-V5-HisA进行结构描述 如下：在质粒pMT/BiP/V5-HisA的BglII和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列4 自5’末端第58至294位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒中，插入的双链DNA 分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列12所示的融合基因，表达序列表的序 列11所示的融合蛋白。

序列表的序列11中，自N末端第1至18位氨基酸残基为信号肽（成熟后被切除）， 第21至99位氨基酸残基为AaDEFD成熟肽，第108至121位氨基酸残基组成V5标签， 第125至130位氨基酸残基为6×His标签。序列表的序列11中，自N末端第19至 130位氨基酸残基组成融合蛋白的成熟肽（由112个氨基酸残基组成，分子量约 12.14KD）。

6、借助转染试剂（Effectene Transfection Reagent,购自Qiagen,产品目录号 为301425）并按说明书进行操作，将重组质粒pMT-AaDEFD-V5-HisA转入S2细胞，转 染24h后用500mM浓度的CU²⁺（以CuSO₄的形式加入）诱导48h（即28℃静置培养）， 收集上清液并采用Anti-V5鼠单克隆抗体（Anti-V5-tag mAb，购自MBL公司，产品目 录号为M167-3）作为一抗进行Westernblot，图谱见图3（发生了糖基化修饰，所以 每个泳道显示两条带），可以观察到检测到特异的阳性条带。

二、AaDEFD蛋白在抑制病毒复制中的应用

1、实验组的处理

（1）借助转染试剂（Effectene Transfection Reagent,购自Qiagen，产品目录 号为301425）并按说明书进行操作，将重组质粒pMT-AaDEFD-V5-HisA转入S2细胞， 转染24h后用500mM浓度的Cu²⁺（以CuSO₄的形式加入）诱导48h（即28℃静置培养）， 收集上清液。

（2）在步骤（1）得到的上清液中加入登革热2型病毒的病毒液，使登革热2型 病毒的浓度为10⁴Pfu/mL，28℃静置孵育2h。

（3）将2×10⁶个细胞/ml的Vero细胞的细胞液铺6孔板，每孔2ml。

（4）将步骤（2）得到的溶液加入步骤（3）得到的6孔板，每孔1ml，37℃静置 培养3h，然后更换DMEM完全培养基（购自Life Technology,产品目录号为11965-084） 培养24h。

（5）完成步骤（4）后，吸弃上清，用pH7.4的PBS缓冲液清洗细胞一次，然后 采用RNA抽提试剂盒（AxyPrep总RNA小量制备试剂盒，购自Axygen,产品目录号为 AP-MN-MS-RNA-250）提取总RNA，然后采用逆转录试剂盒（iScript cDNA Synthesis Kit, 购自Bio-Rad，产品目录号为170-8890）进行逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，利 用Taqman RT-QPCR检测Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量（采用GADPH基因为内 参）。

用于检测登革热2型病毒的引物对如下：

上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；

下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。

用于检测登革热2型病毒的探针如下：

5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。

用于检测GADPH基因的引物对如下：

上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’；

下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

用于检测GADPH基因的探针如下：

5’-FAM-CCGACTCTTGCCCTTCGA AC-TRAMA-3’。

2、对照组的处理

用质粒pMT/BiP/V5-HisA代替重组质粒pMT-AaDEFD-V5-HisA，其它同步骤1。

3、结果分析

实验组和对照组中，Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量见图4（进行三次重复 实验，每次重复实验中设置5个重复处理，结果取平均值）。结果表明，加入AaDEFD 蛋白后，Vero细胞内的登革热2型病毒的病毒量出现明显下降，即AaDEFD蛋白可以 抑制登革热2型病毒在Vero细胞中的复制。