具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株制备得到的疫苗

摘要

本发明公开了具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株制备得到的疫苗，本发明的一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名HRV-LZ-2013，基因分型为G10P8，所述疫苗株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9452。实验证明本发明中的轮状病毒减毒株保持了对动物的低致病性。在动物上，特别是在轮状病毒腹泻模型兔子和猪上的免疫保护实验表明，由本发明制备的减毒活疫苗或灭活疫苗在动物试验中均显示了良好的免疫保护性，对牛、羊的免疫保护实验更说明本发明的疫苗免疫保护范围广，可用于预防牛、猪、马、羊、犬等由轮状病毒所引起的腹泻。

说明书

技术领域

本发明涉及一种轮状病毒减毒株及由该减毒株制备得到的疫苗，特别涉及一种 安全且具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株、由该减毒株制备得到的疫苗及其 制备方法，本发明属于轮状病毒感染的防治技术领域。

背景技术

轮状病毒(RV)引起腹泻在发展中国家是一种严重的传染性疾病，每年引起约 5万5岁以下儿童死亡。轮状病毒属于呼肠孤病毒科，分A、B、C 3个群，在人和 动物中都有感染。轮状病毒三层外壳蛋白内有11个不分节的双链RNA，外壳蛋白 VP7、VP4是病毒诱导中和抗体产生的主要免疫原，内膜蛋白VP6是亚群的分类依 据。目前根据VP7和VP4基因分型发现有27G和35P血清型轮状病毒。人的轮状 病毒的流行病学研究中发现，普遍流行以G1、G2、G3、G4和P[4]、P[6]、P[8]单 独或混合感染为主，也流行G9P[8]，中国主要流行G1P[8]、G3P[8]、G2P[8]、G4[8]， 少有P2、P4流行。

采用单价人、动物和人-动物重配减毒疫苗口服免疫是预防轮状病毒引起的腹 泻、引起死亡和减少住院、腹泻症状的主要手段。

轮状病毒感染在人和动物中非常普遍，是发展中国家的严重经济负担，也是威 胁人类健康的公共卫生问题。为预防轮状病毒感染，全球已经开发了口服多价或单 价的轮状病毒疫苗，临床效果显示安全和有效，但动物和人轮状病毒的多样性以及 轮状病毒的流行性和自身特点，使得减毒活疫苗的使用仍存在安全隐患，如动物和 人轮状病毒的变异、重组，人和动物病毒的跨种属传播等，因此开发一种安全广谱 的疫苗显得更加迫切。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株。

本发明的目的之二在于提供一种用于预防轮状病毒感染所引起的疾病的减毒 活疫苗或灭活疫苗及其制备方法。

为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人于2011年在国内某医院收集儿童急性轮状腹泻病粪便样本10例， 用20％PBS(pH＝7.3)重悬无菌过滤，3000g离心20分钟，吸取0.1ml上清液加入胰 酶(20ug/ml)混合30分钟，接种经PBS洗涤3次单层MA-104细胞(T-25细胞培 养液含MEM、双抗(100U庆大霉素和100ug链霉素)和8-10％胎牛血清)，37℃孵育 1小时，加入病毒维持液(含MEN和0.5ug/ml胰酶)在37℃培养10-15天，冻融3次 再以2000g离心20分钟，取上清液和胰酶(20ug/ml)混合30分钟后用MEM稀释 20倍接种MA104细胞在37℃培养8-9天，重复传代8-10代至病毒潜伏期至2-3天。 分离得到的病毒经Vero细胞分离传代15代，分离的病毒能够在猴肾细胞上稳定增 值且具有细胞病变效应。

经基因分型鉴定，由本发明分离得到的轮状病毒(命名为HRV-LZ-2013)的基 因型为G10P8。与其它报道的人轮状病毒G10型核苷酸序列不一致，与动物轮状病 毒LLR株G核苷酸同源性＜90％。该株P型核苷酸序列与轮状病毒同源性﹥90％。 RNA-SDS PAGE试验表明其11节RNA属于长型。

本发明的一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名为HRV-LZ-2013， 基因分型为G10P8，分类命名为人轮状病毒，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9452， 保藏时间是:2014年7月8日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国 科学院微生物研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心。

经本发明分离得到一种轮状病毒减毒株HRV-LZ-2013，其在细胞上病毒滴度高， 传代稳定，用该毒株制备减毒活疫苗，对动物低致病性或无致病性，安全、广谱。 制备灭活疫苗，经灭活和纯化，病毒结构仍能够保持完整并可诱导多种动物产生中 和抗体，从而对异型病毒的攻击产生保护。

因此，进一步的，本发明还提出了一种轮状病毒疫苗，其特征在于其有效成分 为本发明所述的具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株或其传代株，抑或是所述 具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株的灭活抗原。

其中，优选的，所述的传代株是HRV-LZ-2013减毒株在Vero细胞上连续传代 20-100代所获得的减毒株。

更进一步的，本发明还提供了一种制备轮状病毒减毒活疫苗以及灭活疫苗的方 法。

其中，一种制备轮状病毒减毒活疫苗的方法，其特征包括以下步骤：

(1)病毒的增殖培养

Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37℃培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 或其传代株按MOI 0.01-0.1接种，37℃培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持 液，所述病毒维持液为含0.1％的牛血清的MEM，pH 7.2，32℃培养3-5天，反复 冻融3次，离心除去细胞碎片，采用MA104细胞测定病毒滴度，滴度 ≥5.5logCCID₅₀/ml且无菌为合格疫苗原液；

(2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化

采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60％蔗糖的TNE缓冲液中120000g离 心10小时，取出浮力密度为1.36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到 PH＝7.0含10％山梨糖的Hanks平衡液中；

(3)加入适宜抗动物胃酸的轮状病毒保护剂，制成液体或冻干口服剂型。

其中，一种制备轮状病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)病毒的增殖培养

Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37℃培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 按MOI 0.01-0.1接种，37℃培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所述病 毒维持液为含0.1％的牛血清的MEM，pH 7.2.32℃培养3-5天，反复冻融3次，离 心除去细胞碎片，采用MA104细胞测定病毒滴度，滴度≥5.5logCCID₅₀/ml且无菌为 合格疫苗原液；

(2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化

采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60％蔗糖的TNE缓冲液中120000g离 心10小时，取出浮力密度为1.36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到 PH＝7.0含10％山梨糖的Hanks平衡液中；

(3)病毒的灭活

轮状病毒HRV-LZ-2013分别经1/4000甲醛在室温灭活7天，1/4000β-丙内脂室 温灭活16小时，37℃水解1小时，55℃水浴灭活2小时，取样进行电镜观察和残 余活病毒培养检测；

(4)合格灭活的轮状病毒抗原经0.45μM的膜除菌过滤并检测热原后加入贮存 于-80℃备用；

(5)制备灭活疫苗

纯化灭活后的病毒抗原采用水包油或油包水佐剂乳化制成含50-100μg/ml病毒 抗原的疫苗。

其中，优选的，步骤(4)中所述的合格灭活的轮状病毒抗原是指三层外壳蛋 白完整的轮状病毒≥90％且无残余病毒活性的抗原，轮状病毒残余毒力试验采用Vero 细胞连续培养3个代次无任何细胞病变，经热灭活的轮状病毒结构完整，在SDS PAGE电泳上有5种蛋白VP1、VP2、VP4、VP6、VP7显示。

其中，优选的，所述的佐剂包括MF59、AS04、AL(OH)3佐剂。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明中的轮状病毒减毒株保持了轮状病毒对动物的低致病性。在动物上， 特别是在轮状病毒腹泻模型兔子和猪上的免疫保护实验表明，由本发明制备的减毒 活疫苗或灭活疫苗在动物试验中均显示了良好的免疫保护性，对牛、羊的免疫保护 实验更说明本发明的疫苗免疫保护范围广，可用于预防牛、猪、马、羊、犬等由轮 状病毒所引起的腹泻。

2、在发明中纯化、灭活后轮状病毒3层外壳结构的完整是疫苗保持免疫作用 的前提，热灭活与化学灭活结合的方法相比单纯化学灭活方法来说最大限度的保持 了轮状病毒结构的完整性。安全有效的佐剂可以增强免疫作用，减少疫苗成本，人 用疫苗的佐剂和兽用疫苗佐剂均可使用以便制成人或动物疫苗。

3、由于本发明疫苗为单价疫苗，因此利用本发明的轮状病毒减毒株制备减毒 活疫苗或灭活疫苗，其制备方法简单，且生产成本低、因而成品价格低廉。

4、本发明的减毒活疫苗或灭活疫苗虽是单价疫苗，但具有广谱免疫原性，可 通过口服免疫，效果好，且使用方便。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、人源轮状病毒的分离、传代和筛选

2011年在国内某医院收集儿童急性轮状腹泻病粪便样本10例，用20％ PBS(pH＝7.3)重悬无菌过滤，3000g离心20分钟，吸取0.1ml上清液加入胰酶 (20ug/ml)混合30分钟，接种经PBS洗涤3次单层MA-104细胞(T-25细胞培养 液含MEM、双抗(100U庆大霉素和100ug链霉素)和8-10％胎牛血清)，37℃孵育1 小时，加入病毒维持液(含MEN和0.5ug/ml胰酶)在37℃培养10-15天，冻融3次 再以2000g离心20分钟，取上清和胰酶(20ug/ml)混合30分钟后用MEM稀释20 倍接种MA104细胞在37℃培养8-9天，重复传代8-10代至病毒潜伏期为2-3天。 分离的病毒经Vero细胞分离传代15代，毒株在不同细胞中分离适应的结果如表1。 从表1结果可以看出分离病毒的能够在猴肾细胞(Vero)上稳定增殖且具有细胞病 变效应。

表1轮状病毒的分离和细胞适应

上述方法分离得到的轮状病毒，命名HRV-LZ-2013，保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9452，保藏时间是2014年7月 8日。

实施例2病毒的鉴定和分型

富集的病毒HRV-LZ-2013按RT-PCR分型，再用尸斑减少中和试验确证。45-50 CCID₅₀的病毒用1.5ug的胰酶在37℃1小时激活，用不同稀释度G1-G10，P2-P8单 抗或超免血清混合接种长成单层的MA-104细胞6孔板，覆盖含5ug/ml的胰酶， 37℃，5％CO₂孵箱孵育4天，甲醛固定后染色计数，形成60％噬斑抗体最高稀释度 表示。

轮状病毒在36000rpm×3小时条件下离心后去除上清，38000rpm×3小时，30％ 蔗糖密度离心获得纯化轮状病毒HRV-LZ-2013，加入福氏完全佐剂和不完全佐剂分 别对兔子进行初免和加强制备HRV-LZ-2013超免血清。

纯化的HRV-LZ-2013提取全基因RNA，按表2合成轮状病毒11基因片段引物 进行RT-PCR，克隆至载体或直接测序。

表2轮状病毒基因片段引物

分离病毒是否有其它肠道病毒感染，也涉及了如甲肝、脊髓灰质炎、EV71病 毒等病毒的特异性引物进行克隆测序。分离的HRV-LZ-2013轮状病毒基因分型为 G10P8。与其它报道的人轮状病毒G3型核苷酸序列不一致，与动物轮状病毒LLR 株G核苷酸同源性＜90％。该株P型核苷酸序列与轮状病毒同源性﹥90％。RNA-SDS PAGE试验表明其11节RNA属于长型，也无其它病毒混合感染。分离的轮状病毒 HRV-LZ-2013株的中和能力如表3所示。

表3分离的轮状病毒HRV-LZ-2013株中和能力

毒株 来源 G P 单抗稀释度 HRV-LZ-2013 人 G10 P8 102400 LLR 羊 G10 P12 3200 UK 牛 G6 P2 1600 Wa 人 G1 P4 800 Gottifried 猪 G4 P2A 800

实施例3人轮状病毒减毒活疫苗的制备

包括以下步骤：

(1)病毒的增殖培养

Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37℃培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 或其20-100代Vero细胞传代株按MOI 0.01-0.1接种，37℃培养1小时后，生理盐 水洗后加入病毒维持液，所述病毒维持液为含0.1％的牛血清的MEM，pH 7.2，32℃ 培养3-5天，反复冻融3次，离心除去细胞碎片，采用MA104细胞测定病毒滴度， 滴度≥5.5logCCID₅₀/ml且无菌为合格疫苗原液；

(2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化

采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60％蔗糖的TNE缓冲液中120000g离 心10小时，取出浮力密度为1.36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到 PH＝7.0含10％山梨糖的Hanks平衡液中；

(3)加入适宜抗动物胃酸的轮状病毒保护剂，制成液体或冻干口服剂型。

实施例4人轮状病毒灭活疫苗的制备

包括以下步骤：

(1)病毒的增殖培养

Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37℃培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 按MOI 0.01-0.1接种，37℃培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所述病 毒维持液为含0.1％的牛血清的MEM，pH 7.2，32℃培养3-5天，反复冻融3次， 离心除去细胞碎片，采用MA104细胞测定病毒滴度，滴度≥5.5logCCID₅₀/ml且无菌 为合格疫苗原液；

(2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化

采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60％蔗糖的TNE缓冲液中120000g离 心10小时，取出浮力密度为1.36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到 PH＝7.0含10％山梨糖的Hanks平衡液中；

(3)病毒的灭活

轮状病毒HRV-LZ-2013分别经1/4000甲醛在室温灭活7天，1/4000β-丙内脂室 温灭活16小时，37℃水解1小时，55℃水浴灭活2小时，取样进行电镜观察和残 余活病毒培养检测；

(4)合格灭活的轮状病毒抗原经0.45μM的膜除菌过滤并检测热原后加入贮存 于-80℃备用；

(5)制备灭活疫苗

纯化灭活后的病毒抗原采用水包油或油包水佐剂乳化制成含50-100μg/ml病毒 抗原的疫苗。

其中，步骤(4)中所述的合格灭活的轮状病毒抗原是指三层外壳蛋白完整的 轮状病毒≥90％且无残余病毒活性的抗原，轮状病毒残余毒力试验采用Vero细胞连 续培养3个代次无任何细胞病变，经热灭活的轮状病毒结构完整，在SDS PAGE电 泳上有5种蛋白VP1、VP2、VP4、VP6、VP7显示。

其中，所述的佐剂为MF59、AS04或Al(OH)₃佐剂。

实施例5灭活后的轮状病毒HRV-LZ-2013对小鼠抗体反应

采用商用EIA试剂盒筛选雌性成年育龄BALB/C小鼠，轮状病毒IgA、IgG抗 体阴性的小鼠后腿肌肉免疫3-20μg/ml疫苗100μl，三周后加强免疫，用疫苗稀释液 100μl免疫对照组，分别取0、21、35、50天血清测定抗体。按0.6-0.5mg/ml配制 佐剂疫苗，采用同样的免疫剂量和程序对比小鼠的抗体反应。血清样本20倍稀释 后2倍系列稀释加入等体积的600ICCD₅₀的胰酶激活病毒在37℃孵育1小时，接种 96孔单层MA104细胞板37℃孵育5％CO₂孵箱24小时，用兔抗轮状病毒血清和羊 抗兔标记抗体测定OD₄₅₀，OD₄₅₀值和阳性对照比较减小60％孔的血清稀释度为中和 指数。经过第一次免疫小鼠血清较对照组IgG抗体升高，佐剂疫苗组的抗体效价高 于无佐剂疫苗组。加强免疫后，无佐剂疫苗组抗体低于有佐剂抗体组，2组抗体均 升高见表4，20μg和3μg规格的疫苗均能诱导小鼠的抗体生成，佐剂疫苗含0.3μg 轮状病毒HRV-LZ-2013抗原2剂免疫可产生高水平的血清抗体和中和抗体。结果见 表5。

表4轮状病毒抗原诱导小鼠血清抗体

表5不同抗原含量和佐剂诱导轮状病毒的中和抗体

发明实施中证实灭活的轮状病毒抗原和佐剂混合吸附可在小鼠产生保护性抗 体，抗原含量在0.3μg，推断人体用量在20-100ug/剂。

实施例6灭活后的轮状病毒HRV-LZ-2013在兔子上的免疫保护研究

轮状病毒在机体的免疫和致病机制仍有许多不清楚，如免疫保护抗体水平和保 护期等，轮状病毒疫苗诱导了肠道和体液的分泌IgA和血清IgM、IgG水平升高， 但对于人体不能模拟轮状病毒感染和免疫，兔子模型的感染和免疫试验可模拟人体 了解发明疫苗的特性。

Ala轮状病毒来源于美国NIH，扩增并3次噬斑纯化用做攻击毒，病毒滴度采 用噬斑形成单位。兔子采用清洁级新西兰幼年大白兔，年龄40-50天，成年兔100-140 天，分为2组。各种抗体采用ELISA检测。成年兔子接种10⁷PFU灭活后的轮状病 毒HRV-LZ-2013(实施例4制备)，幼年兔接种10⁵PFU灭活后的轮状病毒 HRV-LZ-2013(实施例4制备)，分别在35和28天攻毒，其中有12/30幼年兔子表 现轻微腹泻，3-4/30幼年兔表现中度腹泻，成年兔子无腹泻症状，因此选择年龄40-50 天清洁级的新西兰兔作为该发明实施的模型，疫苗免疫剂量为5-10ug/ml的疫苗 100ul(实施例4制备)，间隔2周加强免疫，35天后攻毒。通过兔子粪便的病毒分 离培养显示该疫苗对免疫组保护，7-9天产生轮状病毒特异性抗体，加强后35天特 异性轮状病毒抗体达到最大3×10³GMT可持续到180天。表6结果表明该疫苗能诱 导兔子产生征对各类病毒的中和抗体，并能对各种动物轮状病毒口服感染产生保 护，无免疫组兔子有1只轻微腹泻，2只中度腹泻，分别来自对照组的Ala、HK病 毒攻击组。

表6疫苗诱导的人和动物轮状病毒中和抗体(60天)

实施例7灭活后的轮状病毒HRV-LZ-2013在牛体上的免疫保护研究

纯化灭活抗原50-100μg(实施例4制备)采用水包油或油包水佐剂乳化制成含 50、70、100μg抗原的疫苗注射牛场犊牛10只，21天加强免疫，并设对照组4-6 只注射生理盐水，42天通过口服感染轮状病毒，180天隔离饲养观察疫苗保护力和 检查血清中和抗体。牛经2针免疫后35天抗体均升高且维持约6月，疫苗剂量在 100ug轮状病毒抗原可对牛产生100％保护。表7列举免疫牛的抗体生成和动物保护 情况。

表7疫苗诱导牛的轮状病毒中和抗体和疫苗保护力

实施例8轮状病毒HRV-LZ-2013减毒株在猪体上的免疫保护研究

轮状病毒HRV-LZ-2013Vero细胞适应株20代(减毒株)，HRV-LZ-2013-V20,在 Vero细胞上传代20代，滴度log 8×10⁷TCID₅₀/毫升，每只猪仔最少接种1×10⁵TCID₅₀病毒。攻击毒WaHRV，购买于美国ATCC,感染有效剂量为10⁶ID₅₀。

2-4天龄猪经猪体病原微生物抗体试剂盒检测，如轮状病毒、腹泻病毒、猪圆 环病毒、大肠杆菌等肠道病原、呼吸道病原检测阴性，隔离饲养。进行剂量依赖的 免疫程序和方式研究。分3组，1组免疫1×10³TCID₅₀病毒，2组接种1×10⁴TCID₅₀病毒，3组接种1×10⁵TCID₅₀病毒，在2周后加强免疫1次同剂量疫苗。免疫后28 天用Wa HRV毒株攻毒，每日观察仔猪腹泻和病毒排放情况。根据仔猪最高保护率 和分泌抗体肠道细胞个数，设置组包括1：3剂口服疫苗组，3剂鼻内免疫疫苗组， 3剂空白对照组，每剂间隔10天。

单核细胞分离和ELISPOT:在攻毒后0天、7天麻醉各组仔猪，收集小肠、脾 脏mesenteric淋巴结(MLN)、血液。采用人轮状病毒感染MA-104细胞ELISAPOT 法定量轮状病毒特异抗体分泌细胞，以5×10⁵MNC为个数点。0-10天取口腔、肛 门拭子，评估初免减毒活疫苗后口腔和粪便中的病毒排放，攻击6天后取肛门拭子 评估攻击后粪便中的病毒和腹泻。粪便分级0为正常，1为粘稀，2为半细，3为 液体。用抗原捕获ELISA和细胞培养免疫荧光法检测病毒排泄。

统计分析：病毒排泄和腹泻猪个数分析用Fisher’s exact test，累计腹泻程度、 排毒时间、排毒病毒滴度用单向方差分析，攻毒0、7天的特异性抗体分泌细胞个 数用秩和检验(非参数)，P＜0.05为显著差异。

结果：鼻内免疫和加强2剂减毒疫苗研究表明，3剂量的减毒疫苗鼻内免疫对 腹泻产生保护，见表8及表9，3剂量的排毒时间、排毒开始时间、腹泻程度、均 无显著差异，P＞0.05，但腹泻时间随免疫剂量增加而减小，差异显著，P＜0.05， 各组和对照组的排毒、腹泻指标比较，差异显著，P＜0.05。

表8.轮状病毒HRV-LZ-2013–V20株口服免疫对猪体腹泻和排毒的剂量效应的免疫 保护

表9强毒WaHRV攻击后对猪排毒和腹泻的保护率

各组加强免疫诱导的局部小肠淋巴结和系统的脾脏、外周血抗体分泌细胞在攻 击0到7天有剂量依赖关系，小肠分泌IgA、IgG抗体分泌细胞随各组加强免疫剂 量升高增加，脾脏中IgA分泌细胞增加。无论口服或鼻内接种HRV-LZ-2013-V20 没有观察到任何轮状病毒腹泻症状，但在鼻腔和肛门有95％和5％排毒，口服免疫 后猪在鼻腔和肛门有79％和17％的排毒，对照组初免和加强免疫没有观察到临床副 反应。攻毒后免疫高剂量2剂免疫对排毒和腹泻保护率最高，见表11，攻毒后，口 服免疫低剂量减毒轮状病毒组对排毒和腹泻的保护率为79％和80％，口服高剂量组 对排毒和腹泻的保护率为75％和78％，鼻腔免疫高剂量组对排毒和腹泻保护率为 77％和82％，各组对排毒和腹泻的保护率无显著差异，但各组的病毒排放比率、起 始时间、排毒时间、腹泻比例、腹泻起始时间、腹泻程度和对照组比较都有明显差 异，P＜0.05。尽管各组对排毒、腹泻保护率无差异，表明该细胞减毒株安全、有 效可预防猪轮状病毒的腹泻和减小排毒、缩短腹泻时间。也表明该毒株可以口服或 鼻内免疫猪。

实施例9HRV-LZ-2013-V20在牛犊上的免疫反应

材料和方法:轮状病毒HRV-LZ-2013-V20,轮状病毒HRV-LZ-2013-V50为轮状 病毒HRV-LZ-2013在Vero细胞上传代20、50代次的轮状病毒减毒株，并进行了克 隆纯化。轮状病毒17/4来源于动物疾病研究院，在MA-104细胞上传代并克隆,命名 为CP-1。

5-15天的新生牛犊5头口服10⁵-10^7.0log10 TCID₅₀HRV-LZ-2013-V20，5-21天 新生牛犊5头口服10³-10^5.5log10 TCID₅₀轮状病毒HRV-LZ-2013-V50，21天用 10^8.0log10TCID₅₀的强毒CP-1。选取5头未免疫的牛为对照。每天取粪便观察，在 免疫的0、21、42天采取血液。

病毒检测：细胞液和粪便滤过液的病毒感染性用MA-104细胞病变效应法检测， 以log10TCID₅₀/毫升或克表示。

血清或粪便抗体：用间接免疫荧光法，细胞MA-104,牛轮状病毒UK株，异硫 氰酸酯结合兔抗牛IgG。每个样品分开测定2次。血清和粪便悬液56℃灭活30 分钟，用Eagle MEM按1：5倍比稀释。中和滴度以荧关灶减少50％的稀释度倒数 表示。每一样品单独检测2次取平均值。

ELISA测定轮状病毒特异抗体：轮状病毒UK株，滴度为106.5TCID₅₀/ml，加 入等体积2M-NaSCN室温反应15分钟解离病毒，以3个体积的包被液0.05M碳 酸盐缓冲液(pH 9.6)混合，96孔板每孔加入0.1ml，4℃过夜,用洗液 (phosphate-buffered saline,0.05％Tween 20)洗涤3次,晾干并复孔加入0.1ml样品和 标准品，室温孵育3小时，洗涤3次，加入0.1ml第一抗体，加入兔抗牛辣根过氧 化物酶IgG或IgM或IgA(根据测定目的，每次加入一种)，37℃1小时反应，洗液 洗涤3次，加入0.1ml底物(邻苯二胺340μg/ml溶于3.9mM过氧化氢和磷酸缓冲液， pH 5.0)，每孔加入2M-H2SO4(0.1ml/well)终止反应，在自动读板机(日本公司 Titertek Multiskan产品)492nm读取吸收值。

结果：

口服HRV-LZ-2013-V20、HRV-LZ-2013-V50的10头牛犊在0天的粪便检测到 轮状病毒，但无任何临床症状，粪便颜色为深棕或绿色，排便也没有增加、无厌食 现象，见表10。

表10.轮状病毒减毒株HRV-LZ-2013-V20、HRV-LZ-2013-V50在牛犊上的排毒和临 床

2组牛犊在口服减毒轮状病毒的21天，粪便和血清中可检测到IgG、IgA、IgM 抗体(表11-15)，

表11.口服免疫牛犊血清和粪便中轮状病毒特异性抗体和中和抗体(21天用强毒攻 击)

表12.21天攻毒时牛犊的各类抗体(ELISA法检测)

表13.口服免疫牛犊21天后血清中和抗体滴度

表14.口服免疫牛犊21天后强毒攻击的效果

表15口服轮状病毒减毒株牛犊21天强毒攻击保护的抗体水平

2减毒株诱导的抗体水平和对照组攻击后的抗体水平类似，用免疫荧光法、 ELISA法检测的血清、粪便，粪便的抗体水平低于血清抗体8-40倍，但IgA却高于 血清的水平，高于6倍。在21天攻毒，对攻击毒CP-1中和抗体见表11，表12， 表15，表明减毒株和强毒株之间抗原性的交叉，减毒株HRV-LZ-2013和强毒株CP-1 不属于同一血清型。所有口服免疫减毒株HRV-LZ-2013-V20\HRV-LZ-2013-V50对 强毒CP-1产生保护，而对照组则有腹泻和排毒，见表14，口服免疫组牛犊的排便 量、粪便颜色在攻毒后几乎无变化，排毒量平均为1.5-1.6，对照组牛有3-7天排便 量增大，平均达1770克/天，有3-5天粪便颜色异常，排毒峰值平均为6.7。免疫后 42天，对照组的牛犊的轮状病毒抗体全部阳转。

实施例10狗口服轮状病毒减毒株HRV-LZ-2013-V100粘膜免疫

材料和方法

轮状病毒I321，由美国NIH提供,轮状病毒毒株P、R2、W161、69M、Ito、K8、 DS-1、St.Thomas,均购自美国ATCC,用于制备狗抗轮状病毒抗血清。所有用于噬斑 减少中和试验、ELISA的轮状病毒需噬斑3次纯化。

所用的犬只单独饲养，分为2个年龄组，7只4-5天龄的犬只口腔接种、并在35 天后用HRV-LZ-2013-V100(轮状病毒HRV-LZ-2013在Vero细胞上传代100代次的轮 状病毒减毒株)口腔攻毒，攻毒和接种剂量10⁴TCID₅₀，5只11-14天龄的幼犬口腔 接种、并在28天后用10⁶TCID₅₀攻毒。口服接种后观察临床症状，如腹泻和排毒，检 测肠道内含物。

肠道内含物检测方法,麻醉剂按0.7ml/kg使用，麻醉剂配制：含1毫升乙酰丙嗪 (10mg/ml)、3ml氯胺酮(100mg/ml),和3ml甲苯噻嗪(20mg/ml)混合而成。 犬只麻醉后，用婴幼儿饲管从口插入胃注入4剂量的灌肠液溶液，灌肠溶液含0.025M 氯化钠、0.04M硫酸钠、0.01M氯化钾、0.02M碳酸氢钠、0.0485M甘油聚乙 醇(分子量3,350)，每隔10分钟一次，1.5小时内完成注入。腹腔内按4mg/kg注射皮 鲁卡平(购自Sigma公司)收集灌肠液，用无菌纱布过滤后-20℃放置备用，37℃融 化使用前加入蛋白酶抑制剂,苯甲基磺酰氟[终浓度,0.001M]和绿豆胰酶抑制剂 [80mg/ml，溶于50mM EDTA])。灌肠液56℃灭活30分钟，在冰上冷却，用含 0.1％Tween-20、0.1mg/ml绿豆蛋白抑制剂、0.1mg/ml硫柳汞PBS按1:5系列稀释， 蜗旋后600x g离心10分钟，上清分装并冻于--70℃以备分析。在接种和攻毒的时 间不收集灌肠液。

噬斑减少中和试验,血清、肠道的血清中和抗体滴度采用系列稀释测定。轮状 病毒稀释含50-100PFU/0.1毫升病毒和测试样品混合，37℃孵化1小时，加入单层 MA-104细胞吸附1小时，洗涤后，用含DEAE-葡聚糖和胰腺素的琼脂糖铺盖。用噬 斑减少60％的血清最高稀释度倒数表示同源病毒中和抗体滴度。异源病毒中和抗体 血清测定时，血清按1:50开始倍比稀释,1:100\1:200,以减少60％噬斑血清最高稀释度 倒数表示抗异源病毒中和滴度。

ELISA法,按实施例4，最后加入底物ABTS，，在A414读取光吸收值，A414 值和对照组值≥0.1且为阴性对照光吸收标准误差的2倍为阳性。抗体4倍升高为回忆 反应。轮状病毒总抗体测定的二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgA、IgM、IgG (美国Cappel公司)。粘膜IgM、粘膜IgA测定均按试剂盒说明进行。美国Cappel公司 产品。

结果

2组犬对同源病毒HRV-LZ-2013-V100的IgG、gM、IgA抗体反应：年龄小组犬 在接种减毒轮状病毒5天后，抗体开始出现，9天全部抗体阳转，14和21天抗体高峰。 同样的抗体反应在年长犬中出现，所有犬7天后抗体阳转，16-21天为抗体高峰期。攻 毒后2组犬抗体并未出现4倍升高。

对同源病毒HRV-LZ-2013-V100的血清中和抗体反应：一组犬免疫后29天攻毒， 一组犬口服免疫后35天攻毒，所有犬产生了病毒排泄的完全保护，免疫后7-9天产生 保护，2组所有犬在16-21天产生了轮状病毒HRV-LZ-2013-V100的中和抗体，年幼犬 在9-21天可测到中和抗体，而年长犬在免疫7天后就可测出中和抗体。在攻毒的29 天，幼犬的中和抗体滴度分布在1：530-1：2150；在攻毒的35天，年长犬抗体滴度 在1:780-1：2300，年长组犬抗体滴度比较P＞0.05,无显著差异。攻毒后所有犬产生 保护并无临床症状，也无回忆性中和抗体反应。年长组犬在免疫后204天仍有中和 抗体，由于再次暴露于轮状病毒，中和抗体滴度维持在高峰。

对同血清型和异血清型轮状病毒的中和性：幼年组口服免疫 HRV-LZ-2013-V100血清中和同血清型G10轮状病毒I321、异血清型G1、G2、G3、 G4,G8、G9、轮状病毒的结果见表16，对同血清型病毒I321的中和活性低于 HRV-LZ-2013-V100，而高于血清型1、2、4，表明初次免疫是同血清型免疫。12 血清中有3犬血清有G1、G4中和抗体检出，所有的犬抗体有G8、G9的中和活性。年 长犬在口服免疫、攻击感染、再感染的抗体反应见表17，血清对G3病毒的中和活性 较低，无G1、G2、G4病毒的中和活性检出。2/5犬攻毒后血清能中和69M病毒，4/5 犬在免疫、攻毒后均由W161中和抗体产生。2组犬只血清对同型病毒 HRV-LZ-2013-V100均能发生中和反应，有11/12犬只对G10其他轮状病毒产生中和 抗体，2/12(17％)对G1产生中和抗体，0/12(0％)犬只对G2不产生中和抗体，1/12 (8％)犬只对G4轮状病毒产生中和抗体，犬只对同血清型和不同血清型轮状病毒 中和抗体反应，P<0.001有显著差异。在年长组，对轮状病毒69M、W161中和 抗体的反应的个体略有变化，在免疫后分别为0/5()％)、4/5(80％)。2组犬只 在攻毒后对分别对轮状病毒69M、W161中和抗体的反应的个体为11/12(92％)、 12/12(100％)。

肠道中和抗体反应：幼年组犬只在免疫后0.75和7DPI麻醉灌肠观察中和抗体出 现的时间见表18，免疫后5天有同型病毒抗体检出，免疫后32-43天或攻毒后3-7天所 有犬只产生HRV-LZ-2013-V100中和抗体。年长组犬肠腔抗体在免疫后7-25天出现， 攻毒后有3犬只发生抗体回忆反应，所有5只犬对同血清型病毒产生中和抗体。

同型和异型肠道中和抗体：幼年组中4/7和6/7的犬只产生对Sail、Ito轮状病毒的 中和抗体，但滴度低于HRV-LZ-2013-V100，见表19，2/7的犬只产生对异型轮状病 毒中和抗体，抗体滴度低于同型轮状病毒，69M肠道中和抗体检出率远低于血清中 和抗体检出率(P＝0.02,Fisher's精确检验t).无肠道W161中和抗体检出，尽管有3犬 只产生了W161特异性血清抗体(P<0.001,Fisher's exact test)。幼年组犬只血清、肠 道中和抗体比较表明：HRV-LZ-2013-V100诱导的粘膜和系统免疫反应无差别。对 其他G10血清型的病毒的免疫反应则无规律，4/14(29％)产生对其他G10血清型轮状 病毒的中和抗体，但无粘膜中和抗体产生，又1/14(7％)犬产生对G10其他轮状病 毒中和抗体，但无血清中和抗体。对异型病毒1、2、4、8、9，16of35(46％)产 生肠道中和抗体，其中15/35(43％)即产生血清中和抗体，1/35(3％)没有血清反应 时产生中和抗体。这些结果表明每只犬的免疫反应的不同。犬血清轮状病毒异型中 和抗体检出率(14-100％)高于肠道异型病毒抗体检出率(0-30％).。

肠道分泌型IgM和sIgA抗体：幼年组犬只肠道轮状病毒IgM在免疫后3-7天检出， 攻毒后3-7天有3/7犬IgM阳性，见表19，成年组7天IgM阳性，16天后未能检测到IgM, 后续攻毒7、16、25、39、53后(DPC)也未有IgM。sIgA在免疫后7天能检 测到，攻毒后全部动物sIgA抗体阳性。年长组犬只免疫后7天，sIgA出现，可持续 到免疫后25天，攻毒后sIgA持续出现到免疫后204天，但无显著增长。

表16.幼犬口服和用HRV-LZ-2013-V100攻毒感染血清对同型、异型轮状病毒血清中 和抗体滴度

表17同型和异型轮状病毒中和抗体

表18年长组犬只感染轮状病毒HRV-LZ-2013-V100和攻毒后肠道中和抗体

表19幼犬对HRV-LZ-2013-V100的口服感染和攻毒的粘膜免疫反应

实施例11人轮状病毒分离株HRV-LZ-2013-V60和HRV-LZ-2013-V 90在羔羊 交叉保护

材料和方法：人轮状病毒HRV-LZ-2013-V60和HRV-LZ-2013-V90为人轮状病毒 在Vero细胞上的第60和90代次减毒株，滴度分别为3×10⁷log TCID₅₀/ml，5×10⁷log TCID₅₀/ml，经G/P分型鉴定为G10P8，基因电泳表型为长型。分装为每剂1毫升，内 含抗酸保护剂，1×10⁵log TCID₅₀/ml，-80℃保存备用。羔羊轮状病毒LR-QH-84,来源 于青海腹泻羔羊，感染羔羊传代从羔羊粪便和肠子分离物提取，制成10％病毒悬液， 高速10000g离心30分钟，取上清液0.45um、0.22um膜过滤，分装1毫升贮存-70℃备 用。用MA-104细胞传代后滴定1×10⁸log TCID₅₀/ml。

超免血清制备：断奶新西兰大白兔，纯化轮状病毒液和弗氏完全佐剂混合乳化， 内含10⁸个病毒颗粒抗原，皮下免疫兔子，2周后用不完全弗氏佐剂乳化的轮状病毒 纯化液加强免疫，2周用PBS的轮状病毒纯化液免疫，7-10天后取血制成血清，并用 饱和硫酸铵法、G蛋白层析、轮状病毒亲和层析纯化。

荧光灶减少中和试验滴定中和抗体：血清倍比稀释和100PFU的轮状病毒混合后 接种单层MA-104细胞，37℃、5％CO₂孵箱过夜培养，固定，中和滴度以减少50％ 细胞荧光的最高稀释度倒数表示。

交叉保护试验：15只羔羊在无菌条件下饲养和试验，其中12只在产下2-3天口服 1毫升人轮状病毒HRV-LZ-2013-V60或HRV-LZ-2013-90，3只作为对照。10-16天 后，感染1毫升轮状病毒强毒株(ATM76)，每天收集粪便，通过ELISA和电镜检测 病毒，记录轮状病毒腹泻症状如厌食、呕吐、抑郁、脱水、消瘦。根据临床症状攻 毒4天后处死羔羊采血。攻毒前1天羔羊取血。处死的所有羔羊观察肠道和其他器官 病理变化，如小肠、盲肠、结肠，以中性福尔马林溶液固定、切片后用苏木紫染色 或辣根过氧化物酶染色，以超免亲和层析兔抗血清粪便粘膜细胞的病毒颗粒。

肠道内含物轮状病毒检测：PBS加入粪便或内含物，用研磨器研磨粪便或肠道 内含物，600xg离心10分钟，聚乙二醇PEG6000浓缩上清以便电镜观察。部分上清 用于ELISA检测。

结果：

15只羔羊中12只的结果见表20，一只羔羊免疫4天后因为肠阻塞处死，一只免 疫2天后处死观察肠上皮细胞的轮状病毒颗粒。10只口服免疫的羔羊有7只排放轮状 病毒，排放时间不等，在免疫后4-7天可检测到病毒、病毒滴度也不等，排放的时间 为1-3天。对照组攻毒后每天排泄病毒，排泄的病毒滴度高。免疫组的羔羊在10-12 天后攻毒无轮状病毒临床症状观察到，但有8只羔羊在攻毒后有稀的粪便，以后恢 复正常，一只在攻毒后4天有厌食现象，一只呕吐，5天后恢复正常。对照组羔羊在 攻击1-2天后出现水样腹泻、抑郁、厌食、消瘦、脱水。

表20羔羊口服减毒轮状病毒和攻击后病毒排放和临床症状

病理解剖：羔羊口服减毒轮状病毒后小肠、大肠粘膜并未发现异常，肠道20处 切片染色显示肠道细胞无病毒抗原，羔羊小肠病理变化与临床症状对应，免疫的7 只羔羊小肠有轻微回肠下部绒毛萎缩而近端小肠保持完整。其他3只羔羊临床症状 不明显，但在回肠中部末端有较严重的绒毛萎缩，相反有严重临床症状的羔羊在整 个小肠中遍布大量绒毛黏膜，肥大及腺体隐窝细胞。

血清抗体：8只免疫羔羊血清中有6个样品检测到中和HRV-LZ-2013-V60抗体， 抗体滴度1：100到1：380,也检测到LR-QH-84中和抗体，抗体滴度为1:20-1:160.其 他2只羔羊HRV-LZ-2013-V60和LR-QH-84中和抗体滴度非常低。4份血清来源于攻毒 后4天的羔羊，另外4份血清来源于羔羊1、2、5、6攻毒前的血液，攻毒后提高了 HRV-LZ-2013-V60中和抗体水平，2只羔羊(3和4)攻毒后HRV-LZ-2013中和抗体 滴度分别为1:550和1:150。对照组攻毒后3天处死，LR-QH-84中和抗体滴度非常低， 没有检测到HRV-LZ-2013-V60中和抗体。所有排泄可检测到HRV-LZ-2013-V60的羔 羊产生了HRV-LZ-2013-V60和LR-QH-84中和抗体，中和抗体滴度因为LR-QH-84的 感染而提高。3只羔羊(4\7\10)未排泄轮状病毒，中和抗体滴度低，其中一只攻毒后 发生了轮状病毒腹泻症状，见表21。

表21羔羊口服轮状病毒和强毒攻击后轮状病毒中和抗体滴度