一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法

摘要

本发明公开了一种清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法；本发明首先将含有cyp2e1基因的质粒载体转入发根农杆菌，利用发根农杆菌转基因法在活体植株上获得转cyp2e1基因的毛状不定根，进而获得含有cyp2e1基因毛状根的复合型转基因水蕹菜，利用这种复合型转基因植株对水体有机污染物进行吸收。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种水体有机污染物的去除方法，特别涉及一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法。

(二)背景技术

水蕹菜(Ipomoea aquatica Forsk)属旋花科草本植物，俗称竹叶菜，有水生和旱生两种生态类型。水蕹菜可以一次栽种、多次收割，从而把营养物质直接从污染水体中去除而不产生二次污染。

有学者研究了水蕹菜在水体净化方面的功能。李欲如等在苏州重污染河道上种植水蕹菜以控制水体水质污染。不仅进行了静态试验，而且在重污染河道苗家河上作了示范应用。静态试验结果表明在气温35℃、水温30℃以上的条件下，水蕹菜对重污染水体中利用高锰酸盐指数法测定的化学需养量浓度(COD_Mn)、总氮浓度(TN)、NH₄⁺-N、总磷浓度(TP)的去除率分别为37.0％、92.9％、93.9％、94.3％；苗家河示范工程水域中水质有明显改善，透明度可达90-130cm，认为水蕹菜是对苏州重污染河道净化处理的优良生物材料之一(李欲如,操家顺,徐峰,周金余.水蕹菜对苏州重污染水体净化功能的研究.环境污染与防治,2006,28(1):69-71)。操家顺等报道了水蕹菜对重污染河道净化及克藻功能，结果与李欲如等的报道相似(操家顺,李欲如,陈娟.水蕹菜对重污染河道净化及克藻功能.水资源保护,2006,22(2):36-41)。顾国平等采用浮床种植水蕹菜等6种陆生植物，初步研究了浮床种植植物对景观水体中主要养分氮、磷的去除动态及效率，结果表明，以水蕹菜去除效果最佳。水蕹菜能够大量吸收N、P营养提供自身生长所需，在试验进行的第6d及第10d可分别使试验水体的TN、TP去除率达到100％，对改善水质、修复水体具有重要作用(顾国平,周丽燕,王森.空心菜对景观水中氮磷的去除效果研究初报.安徽农学通报,2008,14(19):111-112)。黄婧等研究了浮床水培水蕹菜的生物学特性及水质净化效果，结果显示，水蕹菜以总氮计，1m²的水蕹菜可以把73.06m³的水由Ⅴ类净化到Ⅲ类；以总磷计，则可净化134.73m³的水，因此，水蕹菜与其他水培植物相比具有较强的N、P吸收力，是一种可用于富营养化水体水质净化的优良植物(黄婧,林惠凤,朱联东,李兆华.浮床水培蕹菜的生物学特征及水质净化效果.环境科学与管理,2008,33(12):92-94)。宋超等利用PVC管构建浮床，研究了浮床栽培水蕹菜对罗非鱼养殖池塘水体中N和P的控制效果。数据表明，在试验后期，池塘水体中总氮水平降至淡水养殖池塘废水排放二级标准，而总磷水平达到地表水环境质量二类标准，氨氮的水平控制在1mg/L以下，而亚硝酸盐氮水平则控制在0.1mg/L以下。从各处理组对污染物的去除情况来看，水蕹菜种植时间与种植面积均与N、P的去除效果呈现较好的正相关关系，种植时间越长(>60天)，种植面积与去除效果的正相关性越明显。结果表明，在集约化养殖池塘中采用浮床栽培水蕹菜能够对氮和磷实现有效的控制，并且，水蕹菜浮床覆盖率为20％时比10％和15％处理组更具有经济效益(宋超,陈家长,戈贤平,吴伟,范立民,孟顺龙,胡庚东.浮床栽培空心菜对罗非鱼养殖池塘水体中氮和磷的控制.中国农学通报,2011,27(23):70-75)。唐莹莹等报道在塑料水箱中水培水蕹菜，研究浮床水蕹菜对氮循环细菌数量、分布和氮素净化效果的影响。研究结果表明，浮床水蕹菜氮循环细菌总数、氨化菌、亚硝化菌、硝化菌数量极显著高于空白对照；而浮床水蕹菜反硝化菌数量与空白对照差异不显著；氨化菌在根内、根面、水体中的分布差异不大，亚硝化菌主要分布在根内和根面，硝化菌主要分布在根面，反硝化菌主要分布在水体中。试验结束时，浮床水蕹菜系统和空白对照对氨氮的去除率分别为91.8％和88.5％。浮床水蕹菜系统中氮素的去除是植物吸收、根系表面的氨化作用、以及水体中硝化和反硝化共同作用的结果，而空白对照系统中氮素的主要去除途径是微生物的硝化和反硝化作用以及氨挥发(唐莹莹,李秀珍,周元清,贾悦,辛在军,孙永光.浮床空心菜对氮循环细菌数量与分布和氮素净化效果的影响.生态学报,2012,32(9):2837-284)。杨文婕和刘更另分析了磷和硫对水蕹菜吸收砷的影响，结果显示，微量的砷有利于水蕹菜生长，而过量的磷和硫阻抑砷这种有益效应的发挥(杨文婕,刘更另.磷和硫对空心菜吸收砷的影响.环境化学,1995,15(4):374-379)。此外，任朋娟等研究两性表面活性剂BS-12和Cd²⁺共存对水蕹菜种子萌发、叶绿素含量及MDA含量等的影响。结果表明，BS-12为50mg/L时，能降低Cd²⁺对水蕹菜种子萌发的毒害作用(任朋娟,孟昭福,马云飞,袁进,郭彩虹,樊利,赵贤.BS-12与Cd²⁺复合污染对空心菜种子萌发及生长的影响.西北农业学报,2011,20(4):129-133)。

上述有关水蕹菜的修复作用仅限于对N、P和重金属的污染修复，未见其具有修复有机污染物的研究报道。

细胞色素P450酶是一类与重金属结合的血红蛋白，在代谢异源有机物方面起着重要作用；其中，P450酶家族成员之一P4502E1(CYP2E1，其编码基因简称为cyp2e1)，主要分布在哺乳动物肝细胞中，对有机污染物具有非常重要的解毒功能(Lee SS,Buters JT,Pineau T,Fernandez-Salguero P,Gonzalez FJ.Role of CYP2E1in the hepatotoxicity ofacetaminophen.J Biol Chem,1996,271(20):12063-12067)。

为此，本发明利用发根农杆菌转基因技术将cyp2e1基因转入水蕹菜中，有效提高水蕹菜对有机污染的修复能力，进一步提高水蕹菜对水体复合污染的综合修复能力。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，所述方法包括：(1)无菌苗的培养：将水蕹菜种子消毒后接种在1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含0.5-2.0mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA的MS培养基上，22±2℃，光照培养，获得无菌苗；(2)侵染菌液：将含有核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示cyp2e1基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌落；将抗性菌落活化后接种至含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮清洗3次，离心去除清洗液，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液(重复清洗3次)后，沉淀再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0.1-0.2菌悬液，作为侵染菌液；(3)转基因植株的获取：将步骤(1)培育的无菌苗转入1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至株高5.5-6cm时在植株的茎上刺出伤口，然后将步骤(2)制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，22±2℃，光照培养，获得转基因毛状不定根；(4)转基因植株：当步骤(3)获得的毛状不定根长达5-6cm时，将着生有毛状不定根的茎与原植株分离剪断并保留完整的毛状不定根的茎(即将原始的野生根系剪掉)，将着生有毛状不定根的茎(即将毛状不定根作为根系进行栽培)直接插入含琼脂0.6wt％的1/2MS(0)的培养基中，22±2℃，光照继续培养10-15天，然后打开瓶盖练苗2-3天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中生长，即获得转基因复合型水蕹菜(所述转基因复合型水蕹菜是指植株的毛状根含有cyp2e1基因，茎叶为侵染前的原始结构)。

进一步，步骤(1)所述水蕹菜种子消毒方法为：将水蕹菜种子进入体积浓度0.1％氯化汞水溶液中，消毒7.5min。

进一步，步骤(1)所述无菌苗培养所用培养基为含0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA的MS培养基。

进一步，本发明所述含有核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示cyp2e1基因的质粒可自行构建，本发明优选步骤(2)所述质粒为pSLD50-6。

进一步，步骤(2)所述发根农杆菌为发根农杆菌K599。发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。

进一步，步骤(2)抗性菌落按如下方法制备：在发根农杆菌K599感受态细胞中加入含cyp2e1基因的质粒，混匀后冰上放置10min，置于液氮速冻5min，28℃水浴热激5min，加入LB液体培养基于28℃振荡培养2h后，取菌液涂布于含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，离心，取湿菌体即获得重组发根农杆菌K599/pSLD50-6。

进一步，步骤(3)所述带有伤口的植株按如下步骤获取：在无菌苗茎高1-3cm处用无菌针尖刺入，形成伤口。

进一步，所述水体有机污染物为苯或三氯乙烯。

本发明所述水蕹菜为各种基因型的水蕹菜，优选农家水蕹菜、柳叶水蕹菜、宽叶水蕹菜、泰国水蕹菜，更优选柳叶水蕹菜。

本发明所用培养基的组成为：所述1/2MS(0)培养基组成为：即MS培养基不添加任何植物激素、且营养成分减半。所述MS培养基组成为：参见文献：Murashige T,Skoog F A.revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol Plant,1962,18:100-127。所述LB液体培养基组成为：5g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，溶剂为蒸馏水，pH值为7.5。所述1/2MS液体培养基组成为：MS液体培养基不添加任何植物激素、且营养成分减半的液体培养基。

本发明首先将含有cyp2e1基因的质粒转入发根农杆菌K599，利用农杆菌转基因法获得转cyp2e1基因毛状根的复合型转基因植株。当转基因毛状根长达5-6cm时，将着生有毛状根的茎的下部剪去，将着生有毛状根的茎直接插入含琼脂0.6wt％的1/2MS(0)的培养基中，继续培养10-15天，然后打开瓶盖练苗2-3天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中生长，即获得含转cyp2e1基因毛状根的复合型水蕹菜植株。经PCR和qRT-PCR进行cyp2e1基因表达分析，毛状根中cyp2e1基因能够继续正常的表达。测定转基因再生植株对水体有机污染物的吸收情况，将转基因再生植株置于含有苯或三氯乙酸的1/2MS培养基中，水培7天后培养液中剩余的苯和三氯乙烯的含量均近0，而对照水培非转基因植株的培养液中，苯和三氯乙烯的含量分别为6.20±0.015μg/mL和11.31±0.037μg/mL，表明含cyp2e1基因的水蕹菜提高了对水体有机污染物的抗性，并且能高效吸收水体中的有机污染物。

本发明的有益效果主要体现在：本发明方法获得的水蕹菜可有效清除水体中有机污染物，尤其是苯和三氯乙烯，有效提高水蕹菜对有机污染的修复能力，进一步提高水蕹菜对水体复合污染的综合修复能力。

(四)附图说明

图1为柳叶水蕹菜外植体组培苗发育情况。

图2为组培苗转基因毛状根的诱导情况。

图3为毛状根进行PCR扩增鉴定的凝胶电泳图，泳道1为DNA标准分子量(DS2000)，泳道2为-泳道6为毛状根根系平行实验，泳道7为野生型水蕹菜根系，泳道8为质粒pSLD50-6。

图4为普通根(非转基因根)和转基因毛状根中cyp2e1基因表达情况。

图5为转基因水蕹菜吸收水体有机污染物的情况，A为在含苯的培养液中培养，B为在含三氯乙烯的培养液中培养。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1水蕹菜组织培养快速繁殖无菌苗

(1)选择农家水蕹菜、柳叶水蕹菜、宽叶水蕹菜、泰国水蕹菜等不同的基因型的种子作为实验起始材料。

(2)选择不同的消毒方法对种子进行消毒，消毒后种子污染情况见表1，0.1％氯化汞是指质量浓度0.1％氯化汞水溶液，75％酒精为体积浓度75％乙醇水溶液，20％次氯酸钠为质量浓度20％次氯酸钠水溶液，结果表明：利用0.1％氯化汞消毒7.5min对种子的消毒效果最佳，无污染，而且柳叶水蕹菜的发芽率最高。

表1种子消毒

(3)选择不同的培养基，对不同的外植体进行组织培养。

选择柳叶水蕹菜，利用0.1％氯化汞消毒7.5min的种子，接种在1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养。培养7天萌发出的小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，分别转入不同植物激素组合的培养基上，22±2℃，光照培养30-40天，外植体再生为组培苗的情况见下表2。

表2外植体的培养

其中，在MS+0.5mg/L 6-BA(6苄氨基腺嘌呤)+0.25mg/L IAA(吲哚乙酸)培养基上再生组培苗的频率最高，达到95％(图1)，而在添加IAA的培养基上，外植体只长根；在添加NAA的培养基上，外植体全部愈伤化。

实施例2转cyp2e1基因水蕹菜的获取方法

(1)含cyp2e1基因发根农杆菌侵染菌液的准备

cyp2e1基因从兔肝细胞中通过RT-PCR克隆获得，cyp2e1基因的GenBank登录号为M15061，核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

含有cyp2e1基因的植物转基因表达载体pSLD50-6由美国华盛顿大学Doty教授提供。

利用冻融法将pSLD50-6导入感受态发根农杆菌K599细胞(购自theNational Collection of Plant Pathogenic Bacteria in U.K.)中，即构建获得重组发根农杆菌K599/pSLD50-6。

将重组发根农杆菌K599/pSLD50-6接种于含Km(卡那霉素)50mg/L+Str(链霉素)50mg/L的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液，重复清洗3次，取最后离心获得的沉淀再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0.1-0.2菌悬液，作为侵染的菌液。

(2)毛状根的诱导

将实施例1中在MS+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA培养基上再生的组培苗完整植株切割分株后，转入1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养10-15天后，株高在5.5-6cm时将解剖针在酒精灯上灼烧灭菌、冷却后，在植株不同部位用针尖分别刺入，形成创伤。用微量加样器吸取10μL左右(1滴)含重组型发根农杆菌K599/pSLD50-6菌悬液滴加在伤口处，继续在相同的培养基上培养，22±2℃，光照培养，获得毛状根的情况见表3。

表3组培苗转基因毛状根的诱导

在菌悬液接种后的5-7天之间，伤口处出现白色的愈伤组织，接种后的15天左右出现肉眼可见的不定根，接种后的20-25天不定根长可达3-5cm(图2)。

(3)毛状根的分子生物学鉴定：

1)根据cyp2e1基因序列设计引物，按照常规方法对获得的毛状根进行PCR扩增鉴定(参见李佩菡，向太和，谢军，冯婷，陆文怡.转哺乳动物cyp2e1基因烟草植株再生及其分析.生物工程学报,2012,28(10):1195-1204)。结果见图3，第1泳道：DNA标准分子量；第2-6泳道：步骤(2)在茎高4-5cm处获得的毛状根根系1-5的平行检验；第7泳道：普通根(非转基因根，野生型水蕹菜)；第8泳道：含cyp2e1基因的质粒pSLD50-6。结果：非转基因根未扩增出任何条带，而转基因毛状根均扩增出条带。

引物P1：5'-TGAAGGGTGTGCAGCCGATGACAA-3'

引物P2：5'-CATCGGGAATCTTCTCCAGTTGG-3'

2)根据同源序列，设计扩增actin基因的引物actin-P1：5′-TTGAACCACCACTGAGGACA-3′和actin-P2：5′-GGAGCTGAGAGATTCCGTTG-3′，扩增结果作为内参。根据cyp2e1基因序列设计引物，cyp2e1-P1：5′-ATTCCCAAGTCCTTTGGCAGG-3′和cyp2e1-P2：5′-TGTGGTTCAACAGCATCTCCC-3′，进行cyp2e1基因的荧光定量分析(qRT-PCR)(参见李佩菡，向太和，谢军，冯婷，陆文怡.转哺乳动物cyp2e1基因烟草植株再生及其分析.生物工程学报,2012,28(10):1195-1204)。参照Schmittgen和Livak的方法计算相对表达量＝2-^{(CT处理-CT内参)}。结果见图4，其中NT：普通根(非转基因根，野生型水蕹菜)、TL1-LT5分别为步骤(2)在茎高4-5cm处获得的毛状根根系1-5(平行验证)。结果非转基因根未检测到cyp2e1基因的表达信号，而转基因毛状根均检测到cyp2e1基因的大小不等的表达信号。

利用普通PCR和qRT-PCR进行cyp2e1基因表达的分析。鉴定结果显示：其中将菌液接种于茎高的位置4-5cm处，获得了转基因毛状根，未出现非转基因不定根，即获得的不定根全部为转基因不定根；而且，获得的转基因毛状根中cyp2e1基因能够继续正常的表达。

(4)转cyp2e1基因水蕹菜的获取

当转基因毛状根长达5-6cm时(在茎高的位置4-5cm处着生)，将着生有毛状根的茎的下部剪去(即剪掉原始的野生型根系)，将着生有毛状根的茎直接插入含琼脂0.6wt％的1/2MS(0)的培养基中，22±2℃继续培养10-15天，然后打开瓶盖练苗2-3天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中，22±2℃生长7-10天，即获得含cyp2e1基因的复合型水蕹菜植株。

实施例3含cyp2e1基因的水蕹菜对水体有机污染物的抗性和吸收情况分析

将实施例2制备的含cyp2e1基因的水蕹菜植株(在茎高的位置4-5cm处着生毛状根进行培育获得的转基因植株)和对照植株(野生型)分别于含10μg/mL苯的1/2MS培养基或含15μg/mL三氯乙烯的1/2MS培养液中培育，培养温度为18-25℃。结果显示：培养7天后，对照非转基因植株在含10μg/mL苯的1/2MS培养基或含15μg/mL三氯乙烯的1/2MS培养液中枯死，而含cyp2e1基因的水蕹菜植株依然正常生长(图5)。参考Doty等的方法(Doty SL,Shang QT,Wilson AM,Westergreen AD,NewmanLA,Strand SE,Gordon MP.Enhanced metabolism of halogenatedhydrocarbons in transgenic plants containing mammalian cytochrome P4502E1.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6287-6291)，测定水培7天后培养液中剩余的苯和三氯乙烯的含量，结果显示：在含cyp2e1基因的植株的培养液中，苯和三氯乙烯的含量均近0，而对照非转基因植株的培养液中，苯和三氯乙烯的含量分别为6.20±0.015μg/mL和11.31±0.037μg/mL。表明含cyp2e1基因的水蕹菜提高了对水体有机污染物的抗性，并且能高效吸收水体中的有机污染物。