山奈酚在抑制受体对器官移植排斥反应药物中的应用

摘要

本发明公开了山奈酚在抑制受体对器官移植排斥反应药物中的应用。本发明首次公开了山奈酚在受体体内抑制器官移植排斥反应的药理作用，而且其与低剂量环孢素短期联合使用时效果最佳，可以诱导胰岛移植物在受体内的长期存活，这样可以避免因长期使用全量环孢素而导致的各种副作用，也减轻了患者长期抗排斥治疗的经济负担，并更有利于器官移植患者的长期高质量生活。本发明还发现了山奈酚的免疫调节作用机制，山奈酚可显著上调小鼠受体体内调节性T淋巴细胞数量，并下调受体体内胰岛移植物IL-6的基因表达，从而起到抗炎抗排斥反应的作用。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及山奈酚在抑制受体对器官移植排斥反应药物中的应用。

背景技术

器官移植被广泛地应用于临床治疗，以挽救患各种终端性器官疾病的病人，例如终末期心、肾、肝、肺等疾病。我国目前已成为世界第二大器官移植大国，每年仅有9000多例器官移植手术，但每年需要移植的器官衰竭病人已达30多万，因此，器官移植在我国的需求和发展潜力巨大。然而，移植后往往出现严重排斥反应，病人需要持续使用免疫抑制性药物以抑制受体对移植物的排斥反应。环孢素是最常用的免疫抑制剂之一，但是长期使用免疫抑制性药物如全量环孢素易引起许多副作用，例如诱发病毒感染或导致肿瘤发生等。 这是当前移植免疫学领域面临的重大问题之一。为解决这个问题，目前国内外研究学者的主要研究方向是短期使用免疫调节性淋巴细胞治疗（CD4⁺ CD25⁺ Treg) 或其他作用温和的免疫抑制剂等方法以诱导移植物的长期存活或耐受。

山奈酚是存在蔬菜水果中的一种很重要的活性单体，有研究表明它在体外细胞培养实验中可抑制淋巴细胞的增殖，也有研究证实山奈酚能抑制骨髓或血细胞移植物对宿主（受体）的排斥反应，但是尚未知道山奈酚是否能抑制受体对供体移植物的排斥反应。

目前针对器官移植排斥反应主要是长期使用免疫抑制剂抗排斥。长期服用免疫抑制剂不仅所需费用昂贵，也易产生许多副作用，如感染、肿瘤、消化系统、泌尿系统等副作用。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明通过研究发现在胰岛移植物的排斥反应中短期使用山奈酚联合少量环孢素可以诱导长期的胰岛移植物存活以及免疫耐受，且山奈酚本身也具有一定的抗排斥作用，从而减少全量环孢素单独使用的治疗副作用以及长期抗排斥治疗的经济负担，因此更有利于器官移植患者的长期高质量生活。

本发明的目的在于提供山奈酚在抑制受体对器官移植排斥反应药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明通过研究山奈酚或/和环孢素对小鼠胰岛移植模型的治疗，通过检测相应的胰岛存活时间，调节性T淋巴细胞的数量，及IL-6基因表达的水平，发现山奈酚可抑制受体对移植器官的排斥反应，并在环孢素的协同作用下诱导了胰岛移植物的长期存活或免疫耐受；证明了山奈酚在抑制受体对移植器官排斥反应药物制备中的应用。

一种抑制受体对移植器官排斥反应的药物组合物，该药物组合物中含有山奈酚和环孢素。

进一步的，上述药物组合物中山奈酚和环孢素的质量比为1:（2～4）。

进一步的，上述药物组合物中山奈酚和环孢素的质量比为1：3

本发明的有益效果是：

1）本发明首次利用山奈酚抑制移植受体对供体移植物的排斥反应，从而延长移植物的存活时间；

2）本发明首次将山奈酚和低剂量环孢素联合使用，诱导移植物长期存活或免疫耐受，该联合方法为最佳的治疗方案。

3）本发明第一次从动物实验证明山奈酚能抑制小鼠受体对胰岛移植物的排斥，并在环孢素的协同作用下诱导了胰岛移植物的长期存活或免疫耐受；而且，山奈酚与环孢素短期联合使用，不仅产生协同作用，也减少了环孢素的使用剂量和期限，从而明显减少长期单独使用全剂量环孢素的许多副作用，也减轻了患者长期抗排斥治疗的经济负担，并更有利于器官移植患者的长期高质量生活。

4）以往研究只证明山奈酚能抑制移植物（供体的骨髓或血细胞）对宿主（受体）的排斥反应，该发现只局限于骨髓或血细胞移植。然而，本发明发现山奈酚能抑制受体对供体器官移植物的排斥，该发明适用范围广泛，包括各种器官移植例如心肺肾肝肠以及胰岛等。 另外，本发明还发现了山奈酚的免疫调节作用机制，山奈酚可显著上调小鼠受体体内调节性T淋巴细胞数量，并下调受体体内胰岛移植物IL-6的基因表达，从而起到抗炎抗排斥反应的作用。 以往的有关机制研究只表明山奈酚在体外细胞培养中能抑制淋巴细胞的增殖，缺乏体内动物实验数据的支撑，而本发明具体发现山奈酚可显著上调小鼠受体体内调节性T淋巴细胞数，此体内实验的数据更具有临床意义。

附图说明

图1为山奈酚本身或与环孢素联合使用促进胰岛移植物在小鼠受体体内存活的情况；

图2为流式细胞仪定量分析山奈酚诱导上调受体小鼠肾脏和淋巴结中调节性T淋巴细胞（CD4⁺ FoxP3⁺ Tregs）数量的情况；

图3为山奈酚本身或与环孢素联合使用下调IL-6 (白介素-6) 基因表达的情况。

具体实施方式

本发明采用小鼠胰岛移植模型以观察山奈酚和环孢素是否抑制小鼠受体对胰岛移植物的排斥反应。

1. 实验动物模型

采用BALB/c小鼠为胰岛移植供体，C57BL/6小鼠为胰岛移植受体。

胰岛移植方法：从供体小鼠取出胰腺，体外采用胶原酶消化后，在显微镜下挑选出胰岛置于冰上，然后将400个供体胰岛注射在受体的肾脏包膜下。

2. 药物治疗剂量

山奈酚（Kaempferol）：每只受体小鼠隔天腹腔注射一次，每次0.1mg（约2mg/kg/day）；

环孢素（CsA）：低剂量为6mg/kg/day皮下注射，全剂量为12mg/kg/day皮下注射。

3.分组及药物处理

将经胰岛移植后的C57BL/6小鼠分成以下六组：第1组为对照组（PBS注射一次）、第2组为单独全剂量环孢素组（12mg/kg/d皮下注射一次 ）、第3组为低剂量环孢素组（6mg/kg/d皮下注射一次）、第4组为山奈酚组（每次0.1mg，2天腹腔注射一次）、第5组为山奈酚+低剂量环孢素组（处理方法为第3和第4组的结合）、第6组为山奈酚+全剂量环孢素组（处理方法为第2和第4组的结合）。药物治疗期限为连续三周。

经移植和上述药物处理后的C57BL/6小鼠，饲养至相应的时间后，进行以下实施例1～3中各指标的检测。

实施例1 山奈酚显著延长胰岛移植物的存活时间

将上述经过不同处理的6组小鼠进行胰岛移植物存活时间的检测，检测结果如图1和表1所示。

表1 山奈酚本身或与环孢素联合使用促进胰岛移植物在小鼠受体体内存活的平均时间

从图1和表1中可以看出：

山奈酚组（Kaempferol）小鼠胰岛平均存活时间（27天）显著长于对照组存活时间（14天），n=7-8，P=0.011；说明山奈酚可以显著延长胰岛移植物的存活时间，降低了受体小鼠体内器官移植的排斥反应；

低剂量环孢素组（CsA 6mg）小鼠胰岛平均存活时间（35天）显著长于对照组存活时间（ 14天），n=7-8，P=0.008；

全剂量环孢素组（CsA 12mg）小鼠胰岛平均存活时间（45天）显著长于对照组存活时间（ 14天），n=7-8，P=0.006；

山奈酚+低剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 6mg）小鼠胰岛平均存活时间（100天以上）显著长于山奈酚+全剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 12mg）存活时间（58天），n=8-9，P=0.006。

上述结果说明，山奈酚本身可以延长小鼠胰岛移植物在受体体内的存活时间，并且联合低剂量（6mg）的环孢素治疗效果最佳，山奈酚与低剂量（6mg）环孢素的联合处理的小鼠胰岛平均存活时间在100天以上，显著长于其他所有组的存活时间，可见山奈酚与低剂量（6mg）环孢素的联合使用，发生了预期之外的协同作用，产生了显著的治疗效果。

实施例2山奈酚增加体内调节性T淋巴细胞（CD4⁺FoxP3⁺Tregs）的数量

将经过移植和不同处理的6组小鼠饲养4周后，利用流式细胞仪定量分析小鼠肾脏（含胰岛移植物）和淋巴结中调节性T淋巴细胞数量，分析结果如图2所示，从图2中可以看出：

山奈酚组（Kaempferol）小鼠肾脏和淋巴结中CD4⁺ FoxP3⁺Tregs数量分别为(6.4±0.6)×10⁴个、(3.4±0.4)×10⁴个，分别高于对照组中的(4.7±0.4)×10⁴个（P=0.024）、(2.2±0.2)×10⁴个（P=0.022）；说明山奈酚可显著诱导上调小鼠肾脏和淋巴结中调节性T淋巴细胞数量，降低了小鼠受体对器官移植物的排斥反应；

低剂量环孢素组（CsA 6mg）小鼠肾脏和淋巴结中CD4⁺ FoxP3⁺Tregs数量分别为(2.3±0.3)×10⁴个、(1.2±0.2)×10⁴个，分别低于对照组中的(4.7±0.4)×10⁴个（P=0.006）、(2.2±0.2)×10⁴个（P=0.005）；高剂量环孢素组（CsA 12mg）相对于（CsA 6mg）组进一步诱导下调小鼠肾脏和淋巴结中调节性T淋巴细胞数量（肾脏: P=0.008，淋巴结: P=0.009）；

山奈酚加低剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 6mg）与低剂量环孢素组（CsA 6mg组）比较增加了CD4⁺ FoxP3⁺Tregs数量 (肾脏: P=0.007，淋巴结 P=0.008)；而山奈酚加高剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 12mg）与高剂量环孢素组比较无统计学意义，不存在明显的差异；

山奈酚加低剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 6mg）与山奈酚加高剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 12mg）比较也增加了CD4⁺ FoxP3⁺Tregs数量，“Kaempferol + CsA 6mg”组小鼠肾脏和淋巴结中CD4⁺ FoxP3⁺Tregs数量分别为(4.4 ±0.5)×10⁴个、(2.1 ±0.2)×10⁴个，分别高于“Kaempferol + CsA 12mg”组中的(1.5 ±0.3)×10⁴个（P=0.003）、(0.7 ±0.1)×10⁴个（P=0.002）；

上述结果说明，山奈酚可显著诱导上调受体小鼠体内调节性T淋巴细胞数量，进而抑制了小鼠受体对器官移植物的排斥反应。但山奈酚与高剂量环孢素合用反而作用不明显。

实施例3山奈酚抑制胰岛移植物内IL-6基因表达

将移植后经过不同处理的6组小鼠饲养4周后，对受体小鼠的胰岛移植物中IL-6基因表达情况进行检测，检测结果如图3所示，从图3中可以看出：

山奈酚组中IL-6 mRNA的相对表达水平为1.7 ±0.2，而对照组中IL-6相对表达量为5.0 ±0.6，山奈酚显著下调IL-6 mRNA的表达水平（P=0.006）；

山奈酚+低剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 6mg）中IL-6 mRNA的相对表达量为1.0 ±0.2，低剂量环孢素组（CsA 6mg）中IL-6相对表达量为4.5 ±0.4，山奈酚+低剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 6mg）相对低剂量环孢素组（CsA 6mg）显著下调IL-6的mRNA的表达水平（P=0.005)；山奈酚+低剂量环孢素组（Kaempferol + CsA 6mg）相对于山奈酚的单独使用也进一步降低了胰岛移植物内IL-6基因的表达水平（P=0.025）。

从上述结果分析中可获知，山奈酚可以显著抑制在受体内的胰岛移植物 IL-6基因表达；另外，山奈酚和低剂量环孢素（CsA 6mg）联合使用抑制IL-6基因表达的效果高于山奈酚和低剂量环孢素单独使用的效果，说明山奈酚和低剂量环孢素的联合使用产生了不可预期的协同作用。该结果表明山奈酚可以降低受体免疫介导的炎症或排斥反应。

实施例4一种抑制受体器官移植排斥反应的药剂

1. 实验动物模型

采用BALB/c小鼠为胰岛移植供体，C57BL/6小鼠为胰岛移植受体。

胰岛移植方法：从供体小鼠取出胰腺，体外采用胶原酶消化后，在显微镜下挑选出胰岛置于冰上，然后将400个胰岛注射在受体的肾脏包膜下。

2. 药物组合物：为抑制受体器官移植排斥反应的药物组合物，该药物组合物含有分开存在的山奈酚和环孢素，其中山奈酚和环孢素按质量比1：3。

3.分组及药物处理

将经胰岛移植后的C57BL/6小鼠分成以下2组：对照组和治疗组，对照组注射PBS, 治疗组每只受体小鼠每天皮下注射一次上述2中所述的药物组合物，每次注射山奈酚 2 mg/kg计和环孢素 6 mg/kg计，共注射21天。

将上述经过不同处理的2组小鼠进行胰岛移植物存活时间的检测，检测结果显示，治疗组小鼠胰岛平均存活时间在100天以上，对照组的平均存活时间为14天。 

综上所述，山奈酚通过增加受体体内调节性T淋巴细胞的数量，抑制受体体内胰岛移植物IL-6的基因表达，从而显著延长小鼠胰岛移植物存活时间，并且与低剂量环孢素联合使用能诱导胰岛移植物的长期存活。

本发明第一次从动物实验证明山奈酚能抑制小鼠受体对胰岛移植物的排斥，并在环孢素的协同作用下诱导了胰岛移植物的长期存活或免疫耐受。而且，山奈酚与环孢素联合使用，不仅产生协同作用，也减少了环孢素的使用剂量从而明显减少单独使用全剂量环孢素的许多副作用。以往研究只证明山奈酚能抑制移植物（骨髓）对宿主或受体的排斥反应，该发现只局限于骨髓移植。然而，本发明发现山奈酚能抑制受体对供体器官移植物的排斥，该发明适用范围广泛，包括各种器官移植例如心肺肾肝肠以及胰岛等。 另外，本发明还发现了山奈酚的免疫调节作用机制，山奈酚可显著上调小鼠受体体内调节性T淋巴细胞数量，并下调受体体内胰岛移植物IL-6的基因表达，从而起到抗炎抗排斥反应的作用。 以往的有关机制研究只表明山奈酚在体外细胞培养中能抑制淋巴细胞的增殖，缺乏体内动物实验数据的支撑，而本发明具体发现山奈酚可显著上调小鼠受体体内调节性T淋巴细胞数，此体内实验的数据更具有临床意义。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均在本发明要求的保护范围之内。