Ⅰ.1型糖尿病患儿NK细胞受体及其配体基因的初步研究;Ⅱ.A20转基因抑制胰岛移植排斥反应作用的初步探讨

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分、1型糖尿病患儿NK细胞受体及其配体基因的初步研究
　　 目的及意义：目前已知自然杀伤(nature kill，NK)细胞在1型糖尿病(type1diabetes，T1D)的发生机制中发挥重要作用，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(the killercell immunoglobulin-like receptor，KIR)是NK细胞受体中极为重要的一类受体。某些KIR激活性基因和抑制性基因，可以单独的或联合它们的HLA-C配体，影响T1D的发生。本研究拟通过发现与T1D发病的相关基因型，研究KIR在T1D中的作用，进一步阐明T1D的发病机理，为NK细胞在临床上的应用奠定理论基础并提供新的策略和方式。
　　 方法：本文在中国汉族人群中，采用T1D和对照组年龄、性别一对一匹配对照，研究KIR基因及其配体HLA-C基因与1型糖尿病发病的相互关系。选取明确诊断的1型糖尿病患者259例，平均发病年龄6.94±3.64岁，其中男性123名，女性136名，所有患者均是汉族。所有患者均符合2010年美国糖尿病协会糖尿病诊断标准，并除外2型糖尿病、特殊类型糖尿病等其他类型糖尿病。收集T1D患者性别、发病年龄、糖化血红蛋白、C肽、是否合并糖尿病酮症酸中毒、是否合并自身免疫性疾病，自身抗体检测结果等临床资料。在T1D组中，谷氨酸脱羧酶65片段(glutamic acid decarboxylase65，GAD65)抗体资料齐全者128例，其中79例阳性。蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，IA2)抗体资料齐全者88例，其中59例阳性。
　　 选取正常对照262例，也均为汉族，与T1D患者组为年龄、性别一对一匹配对照。所有对照组成员进行健康体检，无糖尿病、肝肾疾病、自身免疫性疾病等慢性疾病史，与T1D组无血缘关系。
　　 采取以上患者和对照者血样，行KIR基因及其相应配体HLA-C基因检测。
　　 结果：在1型糖尿病和正常对照中，KIR的基因型在两组中没有明显的差异。但在1型糖尿病组中，HLA-C1基因和HLA-C2基因(边缘相关)发生的频率较高。组合基因型2DL2-/HLA-C1+、2DL3+/HLA-C1+和2DS2-/HLAC1+与1型糖尿病呈正性相关。组合基因型2DL1+/HLA-C2-、2DL2-/HLA-C1-、2DL3+/HLA-C1-和2DS2-/HLAC1-与1型糖尿病呈负性相关。在我们检测的基因中，HLA-C1和C2的组合与1型糖尿病有非常明显的相关性，比HLA-C1单独出现的相关性更强。在GAD抗体阳性患者中，KIRs2DL1、2DL2和2DL3以及HLA-C1的频率较高；在IA-2抗体阳性的患者中，KIRs2DS4出现的频率较高。但KIR/HLA-C和抗体的相关性经Bonferroni校正后，无统计学差异。
　　 结论：在我们的研究中，1型糖尿病与KIR基因型无直接的相关性，但是在1型糖尿病中KIR基因型与不同的HLA-C1和C2组合却显示出明显的差异，各种KIR基因及其配体HLA-C的类型与1型糖尿病之间有不同的正性或负性的相关性。提示1型糖尿病的发生可能与KIR及其HLA-C失衡有关。
　　 第二部分、A20转基因抑制胰岛移植排斥反应作用的初步探讨
　　 目的及意义：通过在体内重建内源性胰岛素分泌系统，从根本上治愈糖尿病已逐渐成为共识。胰岛移植是在体内重建内源性胰岛素分泌系统最安全、有效的方法之一。异种胰岛移植可提供更丰富的供体胰岛来源，但同时面临的重大问题就是免疫排斥反应。随着基因工程技术的不断发展，基因治疗技术的出现为最终解决移植免疫排斥问题提供了可能性。由于A20具有抑制TNF诱导的细胞凋亡和抑制NF-κB活性的双重功能，本研究通过携带A20基因的重组慢病毒转染小鼠胰岛细胞，并植入糖尿病大鼠肾包膜下，建立鼠类异种胰岛移植模型。研究A20基因在抑制鼠类异种胰岛移植排斥反应和保护胰腺β细胞免受细胞因子诱导的凋亡中的作用，为基因转染胰岛细胞移植的临床应用奠定基础。
　　 方法：分离培养胰岛细胞采用胶原酶消化法，消化分离C57BL/6J小鼠的胰腺组织，用“两次过筛法”纯化出胰岛细胞。纯化的胰岛细胞悬浮于含胎牛血清的DMEM培养基中，培养28 h后的细胞转染人A20慢病毒(lenti-A20)重组质粒。用AO/PI荧光染色法鉴定胰岛细胞的活性，双硫踪( dithizone，DTZ)染色法鉴定纯化胰岛的纯度。同时，用腹腔一次注射STZ给药的方法建立糖尿病SD大鼠模型，然后建立鼠类异种基因胰岛细胞移植模型(C57BL/6J小鼠→患病的SD大鼠)，以肾包膜下注射的方法实施胰岛移植，分别将己制备的A20基因修饰的胰岛细胞、未经处理的胰岛细胞和PBS移植给T1D大鼠，监测移植后受体鼠血糖的浓度变化，同时测定胰岛素分泌情况。在第3d取胰岛细胞移植后受体鼠肾脏做免疫组化染色检查。
　　 结果：采用胶原酶灌注和两次过筛获得的胰岛纯度为90-100％，分离纯化后的胰岛细胞活率>95％。胰岛细胞具有良好的形态，在倒置显微镜下呈圆形或卵圆形，大小不一，散在分布或成簇。基因转染后胰岛细胞的形态及活性无明显变化。与对照组相比，A20基因修饰的胰岛细胞移植组鼠在移植后糖尿病症状缓解;血糖水平于移植后第2天开始下降至正常水平，并持续时间较长;胰岛移植物存活时间(6±3d)较对照组((3±1d)有明显延长(P<0.05 )。移植后测定胰岛素水平，数据显示转染A20基因胰岛细胞的移植组受体鼠的胰岛素分泌水平升高，说明该胰岛细胞因成功诱导受体鼠的免疫耐受而得以存活。而A20移植组受体鼠的胰岛素水平下降较早，说明移植胰岛已被免疫排斥而破坏。
　　 结论：A20基因的重组质粒转染能显著延长移植胰岛的存活期，明显改善受体鼠糖尿病症状，有效控制血糖水平，为改善1型糖尿病的胰岛移植治疗效果提供了新的途径。A20基因抑制免疫排斥反应和抗β细胞凋亡的双重功效使之在胰岛细胞移植，尤其是异种胰岛移植领域中，将发挥着重要的免疫调节作用。