一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物、试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物、试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。本发明针对鸡青胫性状特有的一个SNP位点，在其附近的DNA片段设计引物对P，PCR扩增后对扩增产物进行BamHI酶切，若该突变位点为G，存在BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为263bp；若该突变位点为T，不存在BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为317bp。与SSCP和直接测序法相比，该检测方法操作简便，成本低、周期短，能大大提高SNP位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。试验表明该方法能有效判定鸡青胫性状SNP位点的基因型，可用于鸡青胫性状分子标记辅助选择，为青胫鸡群的建立提供有效的分子标记。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物，以及包含该引 物的试剂盒，同时还涉及检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，属于生物检测技术 领域。

背景技术

随着城市卫生的规范管理和环境控制要求的严格，大中城市农贸市场活禽销售量将逐 渐减少，白条鸡和分割鸡形式上市的肉鸡产品份额将不断增加。对于冷鲜鸡市场来说，优 质鸡区别于快大肉鸡的显著标识显得异常重要。我国的地方鸡常具有青胫的特征，因此人 们常常以白条鸡胫色来进行判定，所以青胫鸡在品种的培育中具有重要意义。

对于鸡青胫基因位点，青胫鸡分为纯合型和杂合型两种类型。我们在青胫鸡的育种中 需要选育出纯合青胫基因型，来满足的育种需求。因此利用分子生物手段来诊断某个体在 青胫位点的基因型，这对我们育种来说是非常重要和必要的。

近年来，人们发展了多种用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有限制性内切酶片 段长度多态性分析（PCR-RFLP）、单链构象多态技术（SSCP）和直接测序技术等，但SSCP 操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术的成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物。

同时，本发明还提供一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒。

最后，本发明还提供一种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物，包括引物对P：

上游引物P-F：5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’（如SEQ ID NO.1所示），

下游引物P-R：5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’（如SEQ ID NO.2所示）。

一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，主要包括引物对P：

上游引物P-F：5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’，

下游引物P-R：5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。

具体的，用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，还可以包括2×Taq PCR Master Mix（含Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺及缓冲液）、内切酶BamHI、1×NEBuffer3.1 （含NaCl、Mg²⁺、BSA及缓冲液）、超纯水及DNA Marker等。

更具体的，用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，包括：引物对P20μL、 2×Taq PCR Master Mix（含22mM Tris-HCl(pH8.4)，55mM KCl，1.65mM MgCl₂，220μM dGTP，220μM dATP，220μM dTTP，220μM dCTP，22U重组Taq DNA聚合酶/ml）1mL、 10U/μL内切酶BamHI50μL、1×NEBuffer3.1（100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂， 100μg/ml BSA）200μL、灭菌超纯水500μL及DNA Marker（600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp和100bp）30μL。

一种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法，包括以下步骤：

（1）以待检测鸡全基因组DNA为模板，采用引物对P进行PCR扩增，得到扩增片 段；

（2）取扩增片段进行BamHI酶切，酶切产物电泳后根据电泳结果判定鸡青胫基因型；

所述步骤（1）中引物对P为：

上游引物P-F：5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’，

下游引物P-R：5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。

所述步骤（1）中待检测鸡全基因组DNA可采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。

所述步骤（1）中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix6.25μL，ddH₂O4.25μL， P-F0.5μL，P-R0.5μL，DNA模板1.0μL。

所述的2×Taq PCR Master Mix的组分为：22mM Tris-HCl(pH8.4)、55mM KCl、1.65mM MgCl₂、220μM dGTP、220μM dATP、220μM dTTP、220μM dCTP、22U重组Taq DNA聚 合酶/ml。

所述步骤（1）中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退 火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

所述步骤（2）中BamHI酶切的反应体系为：步骤（1）的扩增片段10μL，1×NEBuffer 3.11.5μL，10U/μL BamHI0.5μL，ddH₂O3.0μL。

所述的1×NEBuffer3.1的组分为：100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、 100μg/ml BSA。

所述步骤（2）中BamHI酶切的反应条件为：温度37℃，酶切时间15min。

所述步骤（2）中电泳采用质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶。

所述步骤（2）中电泳的条件为：电压120V，电泳时间40min。

所述步骤（2）中判定鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法为：TT基因型表现为 317bp条带；TG基因型表现为317bp和264bp条带；GG基因型表现为264bp。

本发明的有益效果：

本发明针对鸡青胫性状特有的一个SNP位点，在其附近的DNA片段设计引物对P， PCR扩增后对扩增产物进行BamHI酶切，若该突变位点为G（如SEQ ID NO.3所示），存 在BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为263bp；若该突变位点为T（如 SEQ ID NO.4所示），不存在BamHI酶切序列GGATCC，则PCR产物酶切后片段为317bp。

本发明用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒使用方便，便于携带，可根 据PCR产物酶切后片段的电泳结果判定鸡青胫性状的基因型。对于鸡青胫性状连锁SNP 位点为TT的个体，PCR产物酶切前后，片段为317bp；鸡青胫性状连锁SNP位点为TG 的个体，PCR产物酶切前后，片段为317bp和263bp；SNP位点为GG的个体，PCR产物 酶切前后，片段为263bp。

本发明通过对待测鸡进行翅静脉采血，提取基因组DNA，采用引物对P进行PCR扩 增，对扩增产物进行BamHI37℃酶切15min，酶切产物电泳后根据电泳结果判定SNP位 点的基因型。与SSCP和直接测法相比，本发明建立的分子生物学方法操作更加简便，成 本低、周期短，能大大提高SNP位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普 及。试验表明该方法能有效判定鸡青胫性状，可用于鸡青胫性状分子标记辅助选择，为青 胫鸡群的建立提供有效的分子标记。

附图说明

图1为本发明实施例3中检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的技术流程示意图；

图2为实施例3中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点的PCR引物位置和扩增产物中 突变位点位置的示意图；

图3为实施例3中各样本在鸡青胫性状连锁SNP位点的酶切电泳图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物，包括引物对P：

上游引物P-F：5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’，

下游引物P-R：5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。

实施例2

本实施例中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒，包括：引物对P20μL、 2×Taq PCR Master Mix（含22mM Tris-HCl(pH8.4)，55mM KCl，1.65mM MgCl₂，220μM dGTP，220μM dATP，220μM dTTP，220μM dCTP，22U重组Taq DNA聚合酶/ml）1mL、 10U/μL内切酶BamHI50μL、1×NEBuffer3.1（100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂， 100μg/ml BSA）200μL、灭菌超纯水500μL及DNA Marker（600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp和100bp）30μL；

所述的引物对P为：

上游引物P-F：5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’，

下游引物P-R：5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。

实施例3

本实施例中检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的技术流程示意图如图1所示，具体 方法包括以下步骤：

（1）试样的制备与保存

河南农业大学种鸡场固始鸡24只、丝羽乌骨鸡24只、海赛克斯A系24只、丝羽乌 骨鸡与海赛克斯A系正交F1代24只和反交F1代24只，翅静脉采血，加1/3抗凝剂，用 蛋白酶K法提取血液DNA，将DNA样品保存于4℃冰箱保存备用；

（2）以待检测鸡全基因组DNA为模板，采用引物对P进行PCR扩增，得到扩增片 段；

引物对P为：

上游引物P-F：5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’，

下游引物P-R：5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’；

PCR扩增的反应体系为：12.5μL体系，2×Taq PCR Master Mix（含22mM Tris-HCl(pH 8.4)，55mM KCl，1.65mM MgCl2，220μM dGTP，220μM dATP，220μM dTTP，220μM dCTP， 22U重组Taq DNA聚合酶/ml）6.25μL，ddH₂O4.25μL，P-F0.5μL，P-R0.5μL，DNA模 板1.0μL；

PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸 20s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

（3）取扩增片段进行BamHI酶切，酶切反应体系为：步骤（2）的扩增片段10μL， 1×NEBuffer3.1（100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，100μg/ml BSA）1.5μL， 10U/μL BamHI0.5μL，ddH₂O3.0μL；酶切反应条件为：温度37℃，酶切时间15min；

（4）取8μL PCR扩增后的酶切产物，1.5%的琼脂糖凝胶电泳（电泳条件为：电压120V， 电泳时间40min）点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱详见图3（图中编号说明如下：2～ 5、7为TT基因型，1、6为TG基因型，8为GG基因型，M为DNA Marker）；

（5）根据电泳图谱中出现的条带的大小判定鸡青胫基因位点的基因型：若只有263bp 的片段，则为黄（白）胫纯合子（表型为黄（白）胫）；若只有317bp的片段，则为青胫 纯合子（表型为青胫）；若既有263bp又有317bp的片段，则为青胫杂合子（表型为青黄 （白）胫）；试验结果如下表1所示。

表1待测鸡在青胫位点的判型结果

注：S×A正交为丝羽乌骨鸡与海赛克斯A系正交F1代；A×S反交为丝羽乌骨鸡与海赛克斯A系反交 F1代。