一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法

摘要

本发明公开了一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法，通过马尾松GGPPS基因特异性上、下游引物：P-GGPPS-F:5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'；P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'，采用实时定量荧光RT-PCR技术检测样本中GGPPS基因相对表达量。本发明建立的检测马尾松GGPPS相对表达量的方法，可以特异性的检测分析马尾松针叶、茎、根系等类型组织样本中的GGPPS基因相对表达量，重复性好，可为选育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过逆转录mRNA样品得到cDNA(RT)，再设计特异 引物结合实时定量荧光PCR检测技术检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法。

背景技术

针叶树可分泌大量以萜烯类化合物为主要成分的有特定气味的树脂，也称之为松脂，是 重要的工业原料，长期以来为人们所研究和开发利用。马尾松是我国最主要的采脂树种，我 国有90％以上的松脂是采自马尾松。

萜烯类的生物合成途径有两条。一条为甲羟戊酸途径，另一条途径为甲基–D–赤藓醇 –4–磷酸途径。其中牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)是萜烯类物质合成的一个重要分 支酶，催化GPP与2个IPP缩合成GGPP，GGPP为二萜、类胡萝卜素、赤霉素及叶绿素侧链等 的形成提供C20骨架。在松脂成分中，松香含量占70％-75％，而松香的主要成分树脂酸正是 一类二萜化合物，GGPP是树脂酸的直接前体。在松脂合成部位的显微观察中发现，松脂的主 要合成部位是质体，结合萜类合成途径分析，细胞质、线粒体、质体中分别侧重不同的萜类 合成，其中质体中特有的萜类合成途径包括GGPP的合成以及GGPP下游的二萜合成，这与松 脂的主要成分为二萜树脂酸相符。此外，萜类的合成为次级代谢，在植物代谢旺盛时次级代 谢才会相应的增强，叶绿素是植物光合作用的主要功能基团，并且有研究发现松树针叶中叶 绿素的含量与松树产脂力存在着密切的关系，与普通马尾松类型相比较，马尾松高产脂无性 系的叶绿素含量极显著提高，而GGPP是叶绿素的骨架，直接影响叶绿素和合成。综合以上研 究结果，GGPPS基因的表达丰度在一定程度上反映了植物二萜合成链的活跃程度，GGPPS基因 表达水平相对较高的马尾松植株，其体内的二萜化合物合成相对较多，产脂力可能相对较高 GGPPS很可能与产脂力具有相关性。本发明建立的检测马尾松GGPPS相对表达量的方法，可 为选育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。

荧光定量PCR利用荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过荧 光信号和反应循环数计算比较样品模板的初始浓度。荧光定量PCR对扩增过程中的应该信号 进行全程实时检测，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰，是一种便捷可 靠的新定量检测技术。

发明内容

本发明的目的提供一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法。 该方法针对目的基因序列设计特异引物，并采用实时定量荧光RT-PCR方法检测，具有灵敏度 高，特异型强、快速准确易于标准化等优点。

本发明是这样实现的：

一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法，包括引物的设计、 总RNA的提取与纯化、cDNA第一链的合成、实时荧光定量PCR和相对表达量的计算，得到马 尾松GGPPS基因相对表达量，具体操作步骤如下：

(1)引物的设计：针对马尾松GGPPS基因(KF278944.1)设计用于检测的目的基因特异 性引物序列如下：

P-GGPPS-F:5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'；

P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'。

根据马尾松actin基因(KF910086.1)设计用于检测的内参基因特异性引物，序列如下：

P-actin-F:5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3'；

P-actin-R:5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3'。

(2)总RNA的提取与纯化：采用常规的RNA提取和纯化的方法，从马尾松的植物组织样 本中提取得到纯化的总RNA。

(3)cDNA第一链的合成：以马尾松的组织样品的总RNA为模板，采用常规方法合成cDNA 第一链。

(4)实时荧光定量PCR：采用ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)试剂盒按常规方法 进行，以上述步骤(3)合成的cDNA第一链为模板，采用步骤(1)中的P-GGPPS-F、P-GGPPS-R、 P-actin-F、P-actin-R为引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个样品设3个平行重复。

实时荧光定量PCR扩增体系参数详见表1。

表1：实时荧光定量PCR扩增体系参数

组分 浓度 体积(μl) SybrGreenQpcr Master Mix 2X 10 引物F(10Um) 10μM 1 引物R(10Um) 10μM 1 ddH20 6 模板(Cdna) 2 Total 20

实时荧光定量PCR反应操作参数设置如下：

95℃3min；

95℃15sec，60℃40sec(共40个循环)。

(5)相对表达量的计算：

实时荧光定量PCR完成后，根据获得Ct值计算不同马尾松的组织样本中GGPPS的ΔCt和 值，计算方法如下：

ΔCt＝Ct(GGPPS)-Ct(actin)；

ΔΔCt＝ΔCt(样本A)-ΔCt(样本B)；

以上所述的值表示马尾松的组织样本A中GGPPS相对于马尾松的组织样本B中 GGPPS基因的表达量。

本发明与现有技术相比，具有以下的优点和积极效果：

(1)本发明方法根据马尾松GGPPS基因序列，经过分析设计得到一对特异引物，引物特 异性强，扩增效果和重复性好，荧光定量RT-PCR检测其扩增曲线和溶解曲线表现好，适用于 马尾松针叶、茎、根等各种类型的组织样本，而此前针对马尾松GGPPS基因的表达量分析并 未有相关研究报道和专利公布。

(2)常规半定量RT-PCR技术在PCR扩增之后还需要需要通过PCR产物电泳、图像扫描 处理后根据条带亮度来分析计因表达量，这些PCR后处理步骤操作繁琐，并且其中操作的不 稳定性会对最终结果带来很大影响。本发明方法采用的实时定量RT-PCR技术，通过仪器在扩 增过程中实时测读荧光信号，不需PCR后处理，实验操作简便快捷，并避免引入其他误差因 素，提高了结果的稳定性和重复性，荧光检测的灵敏度高、特异型强，其结果是直接读取的 数字化荧光信号，易于标准化。

(3)本发明方法对马尾松GGPPS基因的表达丰度在一定程度上反映了植物二萜合成链的 活跃程度，马尾松GGPPS基因表达水平相对较高的马尾松植株，其体内的二萜化合物合成相 对较多，产脂力可能相对较高。本发明建立的检测马尾松GGPPS相对表达量的方法，可为选 育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。

附图说明

图1：马尾松针叶组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物扩增曲线；

图2：马尾松针叶组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物熔解曲线；

图3：马尾松半木质化茎组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物扩增曲线；

图4：马尾松半木质化茎组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物熔解曲线；

图5：马尾松木质化茎组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物扩增曲线；

图6：马尾松木质化茎组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物熔解曲线；

图7：马尾松根系组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物扩增曲线；

图8：马尾松根系组织GGPPS基因荧光定量RT-PCR特异引物熔解曲线。

图中标识：Fluorescence为荧光信号值；Cycles为扩增循环数；-(d/dT)Fluorescence 为荧光信号微分值；Temperature为温度。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明的实施方法，而不是限制本发明。

实施例1：马尾松半木质化茎和木质化茎部组织GGPPS基因表达分析

1、样品的采集：选择1年生马尾松植株顶端半木质茎段和近根部木质化茎段组织，采样 后马上放入液氮中保存，待后续实验使用。

2、总RNA的提取和纯化：采用上海生工柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(SK8661)，按 试剂盒说明书方法提取总RNA并纯化。

3、cDNA第一链的合成：采用上海生工第一链cDNA合成试剂盒(AMV First Strand cDNA  Synthesis Kit)(SK2445)进行cDNA第一链的合成，具体操作步骤如下：

(1)在0.2-mlPCR管中加入以下试剂：

5μl total RNA；

1μl Random Primer p(dN)₆(0.2μg/μl)；

5μl Rnase-free ddH₂O。

(2)70℃温浴5min。

(3)冰浴10sec，离心加入下列试剂：

4.0μl 5*Reaction Buffer；

2.0μl dNTP Mix(10mmol/L)；

1.0μl Rnase inhibitor(20U/μl)；

2.0μl AMV Reverse Transcriptase(10U/μl)；

20.0μl Total volume。

(4)37℃温浴5min。

(5)42℃温浴60min。

(6)70℃温浴10min。终止反应。

(7)将上述溶液-20℃保存。

4、实时荧光定量PCR检测：采用ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)试剂盒，利用 LightCycler480 Software Setup(Roche罗氏)方法进行实验，具体操作步骤如下：

(1)将cDNA样品稀释8倍作为模板上机检测。

(2)配制反应混合液，实时荧光定量PCR扩增体系参数详见表2。

表2：实时荧光定量PCR扩增体系参数

组分 浓度 体积(μl) SybrGreenQpcr Master Mix 2X 10 引物F(10Um) 10μM 1 引物R(10Um) 10μM 1 ddH20 6 模板(Cdna) 2 Total 20

采用的引物序列为：

马尾松GGPPS基因的特异性引物序列：

P-GGPPS-F:5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'；

P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'。

马尾松actin基因的特异性引物序列：

P-actin-F:5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3'；

P-actin-R:5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3'。

(3)PCR的循环条件

95℃3min；

95℃15sec，60℃40sec(共40个循环)。

5、相对表达量的计算：

实时荧光定量PCR完成后，根据获得Ct值计算不同马尾松组织样本中GGPPS的ΔCt和值，计算方法如下：

ΔCt＝Ct(GGPPS)-Ct(actin)

ΔΔCt＝ΔCt(木质化茎)-ΔCt(半木质化茎)

以值表示木质化茎中GGPPS相对于半木质化茎中GGPPS基因的表达量。两种马尾 松茎段的组织样本的GGPPS基因的表达量见表3、表4。

表3：两种马尾松茎段的组织样本的GGPPS基因和内参基因的Ct值表

4：两种马尾松茎段的组织样本的GGPPS基因的表达量结果表

从上述表3的结果分析，半木质化茎和木质化茎两种组织样本各重复中GGPPS基因Ct值 的标准差都非常小，说明本方法具有非常好的重复性。

从上述表4两种马尾松茎段的组织样本的GGPPS基因的表达量的结果显示，马尾松木质 化茎组织中GGPPS基因表达量比马尾松半木质茎组织中GGPPS基因表达量高13.51％。

实施例2：马尾松针叶和根部组织GGPPS基因表达分析

1、样品的采集：选择1年生马尾松植株针叶和根系组织，采样后马上放入液氮中保存， 供后续实验使用。

2、总RNA的提取和纯化：采用上海生工柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(SK8661)按常 规方法提取总RNA并纯化。

3、cDNA第一链的合成：采用上海生工第一链cDNA合成试剂盒(AMV First Strand cDNA  Synthesis Kit)(SK2445)按常规方法进行cDNA第一链的合成，具体操作步骤如下：

(1)在0.2-mlPCR管中加入以下试剂：

5μl total RNA；

1μl Random Primer p(dN)₆(0.2μg/μl)；

5μl Rnase-free ddH₂O。

(2)70℃温浴5min。

(3)冰浴10sec，离心加入下列试剂：

4.0μl 5*Reaction Buffer；

2.0μl dNTP Mix(10mmol/L)；

1.0μl Rnase inhibitor(20U/μl)；

2.0μl AMV Reverse Transcriptase(10U/μl)；

20.0μl Total volume。

(4)37℃温浴5min。

(5)42℃温浴60min。

(6)70℃温浴10min。终止反应。

(7)将上述溶液-20℃保存。

4、实时荧光定量PCR检测：采用ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)试剂盒，利用 LightCycler480 Software Setup(Roche罗氏)方法进行实验，具体操作步骤如下：

(1)将cDNA样品稀释8倍作为模板上机检测。

(2)配制反应混合液，实时荧光定量PCR扩增体系参数详见表5。

表5：实时荧光定量PCR扩增体系参数表

组分 浓度 体积(μl) Sybr Green qPCR Master Mix 2X 10 引物F(10uM) 10μM 1 引物R(10uM) 10μM 1 ddH20 6 模板(cDNA) 2 Total 20

采用的引物序列为：

马尾松GGPPS基因的特异性引物序列：

P-GGPPS-F:5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'；

P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'。

马尾松actin基因的特异性引物序列：

P-actin-F:5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3'；

P-actin-R:5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3'。

(3)PCR的循环条件

95℃3min；

95℃15sec，60℃40sec(共40个循环)。

5、相对表达量计算：

实时荧光定量PCR完成后，根据获得Ct值计算不同马尾松组织样本中GGPPS的ΔCt和值，计算方法如下：

ΔCt＝Ct(GGPPS)-Ct(actin)；

ΔΔCt＝ΔCt(根系)-ΔCt(针叶)；

以值表示根系中GGPPS相对于针叶中GGPPS基因的表达量。马尾松针叶和根系的 组织样本的GGPPS基因的表达量见表6、表7。

表6：马尾松针叶和根系的组织样本的GGPPS基因和内参基因的Ct值表

7：马尾松针叶和根系的组织样本的GGPPS基因的表达量结果表

从上述表6的结果分析，马尾松针叶和根系两种组织样本各重复中GGPPS基因Ct值的标 准差都非常小，说明本方法具有非常好的重复性。

从上述表7的马尾松叶和根系的组织样本的GGPPS基因的表达量的结果显示，马尾松根 系组织中GGPPS基因表达水平比马尾松针叶组织中GGPPS基因表达水平低74.31％。