法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-01-09
授权
授权
2015-03-25
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N7/01 申请日:20141107
实质审查的生效
2015-02-18
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。
背景技术
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是危害养禽界的烈性传染病之一,已被国际兽疫局(The Office International des Epizooties, OIE)列定为A类传染疾病。如今,虽然没有发生世界性的大流行,但局部地区的疫情时有发生,给养禽界带来巨大经济损失,我国每年用于防治新城疫病(Newcastle Disease,ND)的疫苗达到上亿元。目前,灭活疫苗和弱毒疫苗在ND免疫预防中最为常用。
白细胞介素2(Interleukin 2,IL2)主要是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一类重要的淋巴因子,在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗中具有重要作用。
对哺乳动物的IL2在B、T细胞的增殖和分化,增强NK细胞、单核细胞杀伤活性等功能中发挥着重要的作用,甚至可对神经系统发挥免疫调节作用。鸡的IL2作为第一个克隆的非哺乳动物的IL2,又与哺乳动物的IL2分子有明显的不同。
除了T细胞外,IL2对免疫系统的其它细胞都有直接或间接的影响。在间接的方面,IL2分别刺激IFNα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和B细胞生长因子(即调节巨噬细胞及B细胞活性的细胞因子)的产生,所以rChL2的产生为我们研究禽免疫学提供了一个有用的工具,同样也可作为一种潜在疫苗增强剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。
本发明提供的鸡新城疫病毒毒株(命名为rClone30-chIL2病毒),其制备方法包括如下步骤:将重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养,得到所述鸡新城疫病毒毒株;所述重组质粒pBrClone30-chIL2为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3即为rClone30-chIL2病毒的基因组DNA。
所述重组质粒rClone30-chIL2具体可为序列表的序列3所示的质粒。
所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
rClone30-chIL2病毒的制备方法具体如下:
(1)将所述重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-chIL2、0.5μg pBL-N质粒、0.25μgpBL-P 质粒和0.1μgpBL-L质粒),置于5% CO2、37℃环境中静置培养72h;
(2)取步骤(1)得到的转染细胞,反复冻融3次,离心收取细胞上清液,然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔,置于37℃环境中培养72h,收集鸡胚尿囊液;
(3)取步骤(2)得到的鸡胚尿囊液,接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔,置于37℃环境中培养72h,收集鸡胚尿囊液;
(4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液,接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔,置于37℃环境中培养72h,收集鸡胚尿囊液;
(5)将步骤(2)得到的鸡胚尿囊液、步骤(3)得到的鸡胚尿囊液和步骤(4)得到的鸡胚尿囊液混合,得到混合液,即为rClone30-chIL2病毒液。
本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株(命名为rClone30-chIL2病毒),其基因组DNA如序列表的序列3所示。
本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。
本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗,包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。
本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株,命名为rClone30-chIL2,因此简称毒株rClone30-chIL2。毒株rClone30-chIL2是将chIL2多肽的编码基因插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30(简称毒株Clone30,弱毒株,为现有的新城疫病活疫苗)的基因组的F基因和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-chIL2免疫鸡群后,7 d后攻毒,重组病毒具有较好的保护效果,为进一步提高NDV重组新城疫疫苗的早期免疫效果提供了新思路。
本发明构建的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株,可制备为任何常规制剂,如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。
本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂chIL2,能够在疫苗免疫早期刺激鸡体内产生NDV抗体并增强体液免疫水平,提高免疫保护效率。本发明对于新城疫病的防治具有重大价值。
附图说明
图1为重组质粒pBrClone30-chIL2的元件示意图。
图2为混合液的HA和HI效价结果。
图3为PCR鉴定电泳图。
图4为实施例2的结果。
图5为实施例3的结果。
图6为实施例4的结果。
图7为实施例5的结果;
图8为实施例6的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
提及“pBrClone30质粒”的文献:“Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.。
提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献:Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy,Fuliang Bai,Immunology letters.。
pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因,其中SacⅡ和MluI酶切识别位点位于F基因和HN基因之间。将pBrClone30质粒、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒起辅助作用,pBrClone30质粒提供病毒的全基因组),得到毒株Clone30。
提及“NDV强毒BJ株”的文献:“鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其遗传变异分析”,校海霞,河北农业大学硕士学位论文。
BHK-21细胞:ATCC编号为CRL-13001。
DF-1细胞:ATCC编号为CRL-12203。
SPF级白色来航鸡:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
chIL2多肽的全称为鸡白细胞介素2,如序列表的序列2所示,其编码基因的开放阅读框如序列表的序列1自5’末端第15至446位核苷酸所示。
完全DMEM培养基即为含有5%胎牛血清的DMEM培养基。
鸡血红细胞凝集(HA)试验的具体方法如下:(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入25μL生理盐水;(2)在第1孔中加入25μL待测病毒液,混匀后吸25μL到第2孔,如此倍比稀释直到第10孔,第10孔混匀后弃除25μL;(3)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞;(4)震荡后室温静置20-30min,观察结果。
鸡血红细胞凝集抑制(HI)试验的具体方法如下:(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水;(2)第1孔加入待检血清25μL,混匀后吸25μL至第2孔,倍比稀释直至第10孔,第10孔混匀后弃除25μL;(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液(4个血凝单位),室温静置30min;(4)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞;(5)震荡后室温静置30-40min,观察结果。
实施例1、rClone30-chIL2病毒液的制备
一、重组质粒的合成
1、合成序列表的序列1所示的chIL2基因序列。
合成序列表的序列1中,自5ˊ末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶SacⅡ的识别序列,第9-14位核苷酸为Kozac序列,第15至446位核苷酸为chIL2多肽的编码基因,第447至452位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列。
2、用限制性内切酶SacII和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子,回收酶切产物。
3、用限制性内切酶SacII和MluI双酶切pBrClone30质粒,回收约16000bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接,得到重组质粒pBrClone30- chIL2。重组质粒pBrClone30- chIL2的核苷酸序列如序列表的序列3所示。重组质粒pBrClone30-chIL2的元件示意图见图1。
二、重组病毒的制备
1、将重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30-chIL2、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μgpBL-L质粒),置于5% CO2、37℃环境中静置培养72h。
2、取步骤1得到的转染细胞,反复冻融3次,离心收取细胞上清液,然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔,置于37℃环境中培养72h,收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为4096,HI效价为256)。
3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液,接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔,置于37℃环境中培养72h,收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为2048,HI效价为1024)。
4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液,接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔,置于37℃环境中培养72h,收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为1024,HI效价为512)。
5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿囊液混合,得到混合液(该混合液的HA效价为2048,HI效价为512,见图2)。
6、取步骤5得到的混合液,提取总RNA并反转录为cDNA,采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定(F1:5ˊ-CCGCGGACGCCACCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTG-3ˊ;R1:5ˊ-ACGCGTTTATTTTTGCAGATATCTCACAAAG-3ˊ),结果见图3。PCR扩增片段大小约为432bp,与预期相符。
结果表明,成功制备了具备感染性的表达chIL2多肽的NDV病毒,将步骤5得到的混合液命名为rClone30-chIL2病毒液。
三、对照病毒的制备
用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30-chIL2进行步骤二的1至5,得到的混合液命名为rClone30病毒液。
实施例2、检测病毒液中chIL2的表达量
1、以0.1 MOI重组新城疫病毒rClone30-chIL2感染HepG2细胞。感染72 h后,收获细胞上清,以含有10% FBS的DMEM培养基作为调零对照,Mock对照组为不加任何试剂或者病毒的DF-1细胞。
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL2病毒液,其它同步骤1。
3、利用重组NDV rClone30-chIL2 感染的DF-1细胞上清为抗原,采用双抗夹心方法,并按照试剂盒说明书进行ELISA检测。
结果见图4。结果表明,rClone30-chIL2感染细胞后,chIL2的蛋白表达量明显高于rClone30,差异极显著 (p<0.01)。
实施例3、rClone30-chIL2病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线
1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板,以0.1MOI的剂量将实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液(rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培养基稀稀释)接种于细胞单层,采用含1μg/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基,置于5% CO2、37℃环境中静置培养96h,每隔24h取上清液并测定TCID50。
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL2病毒液,其它同步骤1。
结果见图5。rClone30-chIL2病毒与rClone30病毒保持着一致的繁殖滴度。结果表明,chIL2的编码基因的插入并不影响rClone30病毒的增殖能力。
实施例4、rClone30-chIL2病毒或rClone30病毒免疫鸡后的HI抗体效价
参照农业部标准,青年鸡的抗体效价≥5log2时判为合格。特别是在30日龄前后抗体水平低于此标准,如果在此期间有强毒侵入,就有可能暴发新城疫。如果鸡群能在此期间达到此标准,将不受新城疫病毒的威胁。
取30日龄的SPF级白色来航鸡,随机分为3组,每组10只。分别处理如下(均为单次免疫):
第一组:每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液(rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第二组:每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第三组:每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。
分别于免疫后7d、14 d、21d翅静脉采血分离血清,检测HI效价。
结果见图6。免疫后7d,第一组血清的HI效价为4.5log2,第二组的效价为2.8log2,经统计学分析呈差异显著 (p<0.05),且这两组均与对照组呈差异极显著 (p<0.01);在免疫14 d和21 d后,rClone30-chIL2组HI抗体平均效价均达到5log2以上,略高于rClone30组,但差异不显著 (p>0.05),而这两组组HI抗体效价仍与对照组呈差异极显著 (p<0.01)。
实施例5 重组病毒rClone30-chIL2或rClone30免疫含母源抗体的鸡后的HI抗体效价(母源抗体高的情况)
在养鸡生产中,一个鸡群的母源抗体水平往往参差不齐,其中一些母源抗体水平较低的雏鸡在其幼龄阶段易感染野毒和带毒,当其它雏鸡母源抗体水平下降时,它们亦依次受感染,使野毒在鸡群中的传播连绵不断,遗留很大的潜在威胁。据有关文献报道,蛋鸡出雏后在不同日龄测定其新城疫母源抗体水平,结果显示:1日龄母源抗体为6.6log2;7日龄时抗体水平下降为4.7log2;到10日龄时抗体水平降到4log2以下,如果以抗体效价4log2为临界保护值,1日龄雏鸡母源抗体保护率为95%,7日龄母源抗体保护率为80%,到10日龄时母源抗体保护率只有50%。
取1日龄的含母源抗体的白色来航鸡,随机分为3组,每组10只。分别处理如下(均为单次免疫):
第一组:组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液(rClone30-chIL2病毒液用完全培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第二组:组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第三组:组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL生理盐水。
分别于免疫后0d、6d翅静脉采血分离血清,检测HI效价。
结果见图7。免疫后7d,第一组血清的HI效价为6.5log2高于5log2,第二组的效价为4.75log2,即在母源抗体高的情况下rClone30-chIL2病毒液将可以实现早期有效保护效果,使鸡免受新城疫病毒的威胁,而rClone30病毒液的保护效果明显低于rClone30-chIL2病毒液。
实施例6 重组病毒rClone30-chIL2或rClone30免疫含母源抗体的鸡后的HI抗体效价(母源抗体低的情况)
在养鸡生产中,一个鸡群的母源抗体水平往往参差不齐,其中一些母源抗体水平较低的雏鸡在其幼龄阶段易感染野毒和带毒,当其它雏鸡母源抗体水平下降时,它们亦依次受感染,使野毒在鸡群中的传播连绵不断,遗留很大的潜在威胁。据有关文献报道,蛋鸡出雏后在不同日龄测定其新城疫母源抗体水平,结果显示:1日龄母源抗体为6.6log2;7日龄时抗体水平下降为4.7log2;到10日龄时抗体水平降到4log2以下,如果以抗体效价4log2为临界保护值,1日龄雏鸡母源抗体保护率为95%,7日龄母源抗体保护率为80%,到10日龄时母源抗体保护率只有50%。
取1日龄的含母源抗体的白色来航鸡,随机分为3组,每组10只。分别处理如下(均为单次免疫):
第一组:组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液(rClone30-chIL2病毒液用完全培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第二组:组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第三组:组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL生理盐水。
分别于免疫后0d、6d翅静脉采血分离血清,检测HI效价。
结果见图8。免疫后7d,第一组血清的HI效价为5.9log2,第二组的效价为6.3log2,即在母源抗体低的情况下,rClone30-chIL2病毒液早期有效保护效果更好,使鸡免受新城疫病毒的威胁。
实施例7、攻毒试验
将30日龄SPF级白色来航鸡随机分为3组,每组30只。分别处理如下(均为单次免疫):
第一组:实验第1天,每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液(rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第二组:实验第1天,每只通过滴鼻电眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释,用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml);
第三组:实验第1天,每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。
实验第8天,采用NDV强毒BJ株进行攻毒(每只鸡采用104 ELD50的剂量经肌肉注射途径攻毒,攻毒体积为0.1ml),实验第18天,统计各组的发病与死亡情况。结果见表1。
表1 各组的发病与死亡情况统计(三次试验的平均值)
发病表征如下(满足①-④中的一项以上即判断为发病):①上呼吸道分泌大量黏液,自口鼻流出,有时挂于嘴端,常摇头想甩掉;呼吸困难,呼吸时喉部发出“咯咯”的喘鸣声或尖叫声;②由于呼吸困难,血液中氧气不足,二氧化碳增多,使肉髯变为青紫色,临死前及死后尤为明显;③下痢,粪便呈绿色、黄白色,有时混有少量血液;④部分鸡嗉囊蓄积大量酸臭液体,倒提鸡时,液体急速自口中流出,提壶倒水一般。
结果表明:rClone30-chIL2组攻毒后10 d内所有鸡均得到100%保护,且无临床症状;rClone30组攻毒后有16只发病,保护率为47%;而对照组所有鸡在攻毒后第4 d全部死亡。rClone30-chIL2可以提高攻毒保护效率。
序列表
序列1、chIL2的核苷酸序列
1 CCGCGGACGC CACCATGATG TGCAAAGTAC TGATCTTTGG CTGTATTTCG GTAGCAATGC
61 TAATGACTAC AGCTTATGGA GCATCTCTAT CATCAGCAAA AAGGAAACCT CTTCAAACAT
121 TAATAAAGGA TTTAGAAATA TTGGAAAATA TCAAGAACAA GATTCATCTC GAGCTCTACA
181 CACCAACTGA GACCCAGGAG TGCACCCAGC AAACTCTGCA GTGTTACCTG GGAGAAGTGG
241 TTACTCTGAA GAAAGAAACT GAAGATGACA CTGAAATTAA AGAAGAATTT GTAACTGCTA
301 TTCAAAATAT CGAAAAGAAC CTCAAGAGTC TTACGGGTCT AAATCACACC GGAAGTGAAT
361 GCAAGATCTG TGAAGCTAAC AACAAGAAAA AATTTCCTGA TTTTCTCCAT GAACTGACCA
421 ACTTTGTGAG ATATCTGCAA AAATAAACGC GT
序列2、chIL2的氨基酸序列
1 MMCKVLIFGC ISVAMLMTTA YGASLSSAKR KPLQTLIKDL EILENIKNKI HLELYTPTET
61 QECTQQTLQC YLGEVVTLKK ETEDDTEIKE EFVTAIQNIE KNLKSLTGLN HTGSECKICE
121 ANNKKKFPDF LHELTNFVRY LQK
序列3(自5ˊ末端第2703-18414位核苷酸为病毒rClone30-chIL2基因组)
1 CTGGCGTAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC GTAGCCTGAA
61 TGGCGAATGG GACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG TGGTTACGCG
121 CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC
181 CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG
241 GTTCCGATTT AGTGCTTTAC GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTAGG GTGATGGTTC
301 ACGTAGTGGG CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG AGTCCACGTT
361 CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT CGGTCTATTC
421 TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG TTAAAAAATG AGCTGATTTA
481 ACAAAAATTT AACGCGAATT TTAACAAAAT ATTAACGTTT ACAATTTCAG GTGGCACTTT
541 TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA
601 TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT
661 GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT
721 TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG
781 AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA
841 AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG
901 TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT
961 TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG
1021 CAGTGCTGCC ATAAGCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG
1081 AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTTCA CAACATGGGG GATCATGTAA CTCGCCTTGA
1141 TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC
1201 TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC
1261 CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC
1321 GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG
1381 CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC
1441 GACGGGCAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC
1501 ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT
1561 AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC
1621 CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA
1681 AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC
1741 ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT
1801 AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG
1861 CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC
1921 AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT
1981 ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA
2041 GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CATTGAGAAA GCGCCACGCT
2101 TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG
2161 CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GGAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA
2221 CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCCGAGCC TATGGAAAAA
2281 CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT
2341 CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA
2401 TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA
2461 GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA
2521 CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTACCT
2581 CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCCTATGT TGTGTGGAAT
2641 TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTCGG
2701 AAGCGGCCGC TAATACGACT CACTATAGGG ACCAAACAGA GAATCCGTAA GTTACGATAA
2761 AAGGCGAAGG AGCAATTGAA GTCGCACGGG TAGAAGGTGT GAATCTCGAG TGCGAGCCCG
2821 AAGCACAAAC TCGAGAAAGC CTTCTGCCAA CATGTCTTCC GTATTTGATG AGTACGAACA
2881 GCTCCTCGCG GCTCAGACTC GCCCCAATGG AGCTCATGGA GGGGGAGAAA AAGGGAGTAC
2941 CTTAAAAGTA GACGTCCCGG TATTCACTCT TAACAGTGAT GACCCAGAAG ATAGATGGAG
3001 CTTTGTGGTA TTCTGCCTCC GGATTGCTGT TAGCGAAGAT GCCAACAAAC CACTCAGGCA
3061 AGGTGCTCTC ATATCTCTTT TATGCTCCCA CTCACAGGTA ATGAGGAACC ATGTTGCCCT
3121 TGCAGGGAAA CAGAATGAAG CCACATTGGC CGTGCTTGAG ATTGATGGCT TTGCCAACGG
3181 CACGCCCCAG TTCAACAATA GGAGTGGAGT GTCTGAAGAG AGAGCACAGA GATTTGCGAT
3241 GATAGCAGGA TCTCTCCCTC GGGCATGCAG CAACGGAACC CCGTTCGTCA CAGCCGGGGC
3301 CGAAGATGAT GCACCAGAAG ACATCACCGA TACCCTGGAG AGGATCCTCT CTATCCAGGC
3361 TCAAGTATGG GTCACAGTAG CAAAAGCCAT GACTGCGTAT GAGACTGCAG ATGAGTCGGA
3421 AACAAGGCGA ATCAATAAGT ATATGCAGCA AGGCAGGGTC CAAAAGAAAT ACATCCTCTA
3481 CCCCGTATGC AGGAGCACAA TCCAACTCAC GATCAGACAG TCTCTTGCAG TCCGCATCTT
3541 TTTGGTTAGC GAGCTCAAGA GAGGCCGCAA CACGGCAGGT GGTACCTCTA CTTATTATAA
3601 CCTGGTAGGG GACGTAGACT CATACATCAG GAATACCGGG CTTACTGCAT TCTTCTTGAC
3661 ACTCAAGTAC GGAATCAACA CCAAGACATC AGCCCTTGCA CTTAGTAGCC TCTCAGGCGA
3721 CATCCAGAAG ATGAAGCAGC TCATGCGTTT GTATCGGATG AAAGGAGATA ATGCGCCGTA
3781 CATGACATTA CTTGGTGATA GTGACCAGAT GAGCTTTGCG CCTGCCGAGT ATGCACAACT
3841 TTACTCCTTT GCCATGGGTA TGGCATCAGT CCTAGATAAA GGTACTGGGA AATACCAATT
3901 TGCCAGGGAC TTTATGAGCA CATCATTCTG GAGACTTGGA GTAGAGTACG CTCAGGCTCA
3961 GGGAAGTAGC ATTAACGAGG ATATGGCTGC CGAGCTAAAG CTAACCCCAG CAGCAAGGAG
4021 GGGCCTGGCA GCTGCTGCCC AACGGGTCTC CGAGGAGACC AGCAGCATAG ACATGCCTAC
4081 TCAACAAGTC GGAGTCCTCA CTGGGCTTAG CGAGGGGGGG TCCCAAGCTC TACAAGGCGG
4141 ATCGAATAGA TCGCAAGGGC AACCAGAAGC CGGGGATGGG GAGACCCAAT TCCTGGATCT
4201 GATGAGAGCG GTAGCAAATA GCATGAGGGA GGCGCCAAAC TCTGCACAGG GCACTCCCCA
4261 ATCGGGGCCT CCCCCAACTC CTGGGCCATC CCAAGATAAC GACACCGACT GGGGGTATTG
4321 ATGGACAAAA CCCAGCCTGC TTCCACAAAA ACATCCCAAT GCCCTCACCC GTAGTCGACC
4381 CCTCGATTTG CGGCTCTATA TGACCACACC CTCAAACAAA CATCCCCCTC TTTCCTCCCT
4441 CCCCCTGCTG TACAACTCCG CACGCCCTAG ATACCACAGG CACAATGCGG CTCACTAACA
4501 ATCAAAACAG AGCCGAGGGA ATTAGAAAAA AGTACGGGTA GAAGAGGGAT ATTCAGAGAT
4561 CAGGGCAAGT CTCCCGAGTC TCTGCTCTCT CCTCTACCTG ATAGACCAGG ACAAACATGG
4621 CCACCTTTAC AGATGCAGAG ATCGACGAGC TATTTGAGAC AAGTGGAACT GTCATTGACA
4681 ACATAATTAC AGCCCAGGGT AAACCAGCAG AGACTGTTGG AAGGAGTGCA ATCCCACAAG
4741 GCAAGACCAA GGTGCTGAGC GCAGCATGGG AGAAGCATGG GAGCATCCAG CCACCGGCCA
4801 GTCAAGACAA CCCCGATCGA CAGGACAGAT CTGACAAACA ACCATCCACA CCCGAGCAAA
4861 CGACCCCGCA TGACAGCCCG CCGGCCACAT CCGCCGACCA GCCCCCCACC CAGGCCACAG
4921 ACGAAGCCGT CGACACACAG CTCAGGACCG GAGCAAGCAA CTCTCTGCTG TTGATGCTTG
4981 ACAAGCTCAG CAATAAATCG TCCAATGCTA AAAAGGGCCC ATGGTCGAGC CCCCAAGAGG
5041 GGAATCACCA ACGTCCGACT CAACAGCAGG GGAGTCAACC CAGTCGCGGA AACAGTCAGG
5101 AAAGACCGCA GAACCAAGTC AAGGCCGCCC CTGGAAACCA GGGCACAGAC GTGAACACAG
5161 CATATCATGG ACAATGGGAG GAGTCACAAC TATCAGCTGG TGCAACCCCT CATGCTCTCC
5221 GATCAAGGCA GAGCCAAGAC AATACCCTTG TATCTGCGGA TCATGTCCAG CCACCTGTAG
5281 ACTTTGTGCA AGCGATGATG TCTATGATGG AGGCGATATC ACAGAGAGTA AGTAAGGTTG
5341 ACTATCAGCT AGATCTTGTC TTGAAACAGA CATCCTCCAT CCCTATGATG CGGTCCGAAA
5401 TCCAACAGCT GAAAACATCT GTTGCAGTCA TGGAAGCCAA CTTGGGAATG ATGAAGATTC
5461 TGGATCCCGG TTGTGCCAAC ATTTCATCTC TGAGTGATCT ACGGGCAGTT GCCCGATCTC
5521 ACCCGGTTTT AGTTTCAGGC CCTGGAGACC CCTCTCCCTA TGTGACACAA GGAGGCGAAA
5581 TGGCACTTAA TAAACTTTCG CAACCAGTGC CACATCCATC TGAATTGATT AAACCCGCCA
5641 CTGCATGCGG GCCTGATATA GGAGTGGAAA AGGACACTGT CCGTGCATTG ATCATGTCAC
5701 GCCCAATGCA CCCGAGTTCT TCAGCCAAGC TCCTAAGCAA GTTAGATGCA GCCGGGTCGA
5761 TCGAGGAAAT CAGGAAAATC AAGCGCCTTG CTCTAAATGG CTAATTACTA CTGCCACACG
5821 TAGCGGGTCC CTGTCCACTC GGCATCACAC GGAATCTGCA CCGAGTTCCC CCCCGCAGAC
5881 CCAAGGTCCA ACTCTCCAAG CGGCAATCCT CTCTCGCTTC CTCAGCCCCA CTGAATGATC
5941 GCGTAACCGT AATTAATCTA GCTACATTTA AGATTAAGAA AAAATACGGG TAGAATTGGA
6001 GTGCCCCAAT TGTGCCAAGA TGGACTCATC TAGGACAATT GGGCTGTACT TTGATTCTGC
6061 CCATTCTTCT AGCAACCTGT TAGCATTTCC GATCGTCCTA CAAGACACAG GAGATGGGAA
6121 GAAGCAAATC GCCCCGCAAT ATAGGATCCA GCGCCTTGAC TTGTGGACTG ATAGTAAGGA
6181 GGACTCAGTA TTCATCACCA CCTATGGATT CATCTTTCAA GTTGGGAATG AAGAAGCCAC
6241 TGTCGGCATG ATCGATGATA AACCCAAGCG CGAGTTACTT TCCGCTGCGA TGCTCTGCCT
6301 AGGAAGCGTC CCAAATACCG GAGACCTTAT TGAGCTGGCA AGGGCCTGTC TCACTATGAT
6361 AGTCACATGC AAGAAGAGTG CAACTAATAC TGAGAGAATG GTTTTCTCAG TAGTGCAGGC
6421 ACCCCAAGTG CTGCAAAGCT GTAGGGTTGT GGCAAACAAA TACTCATCAG TGAATGCAGT
6481 CAAGCACGTG AAAGCGCCAG AGAAGATTCC CGGGAGTGGA ACCCTAGAAT ACAAGGTGAA
6541 CTTTGTCTCC TTGACTGTGG TACCGAAGAA GGATGTCTAC AAGATCCCAG CTGCAGTATT
6601 GAAGGTTTCT GGCTCGAGTC TGTACAATCT TGCGCTCAAT GTCACTATTA ATGTGGAGGT
6661 AGACCCGAGG AGTCCTTTGG TTAAATCTCT GTCTAAGTCT GACAGCGGAT ACTATGCTAA
6721 CCTCTTCTTG CATATTGGAC TTATGACCAC CGTAGATAGG AAGGGGAAGA AAGTGACATT
6781 TGACAAGCTG GAAAAGAAAA TAAGGAGCCT TGATCTATCT GTCGGGCTCA GTGATGTGCT
6841 CGGGCCTTCC GTGTTGGTAA AAGCAAGAGG TGCACGGACT AAGCTTTTGG CACCTTTCTT
6901 CTCTAGCAGT GGGACAGCCT GCTATCCCAT AGCAAATGCT TCTCCTCAGG TGGCCAAGAT
6961 ACTCTGGAGT CAAACCGCGT GCCTGCGGAG CGTTAAAATC ATTATCCAAG CAGGTACCCA
7021 ACGCGCTGTC GCAGTGACCG CCGACCACGA GGTTACCTCT ACTAAGCTGG AGAAGGGGCA
7081 CACCCTTGCC AAATACAATC CTTTTAAGAA ATAAGCTGCG TCTCTGAGAT TGCGCTCCGC
7141 CCACTCACCC AGATCATCAT GACACAAAAA ACTAATCTGT CTTGATTATT TACAGTTAGT
7201 TTACCTGTCT ATCAAGTTAG AAAAAACACG GGTAGAAGAT TCTGGATCCC GGTTGGCGCC
7261 CTCCAGGTGC AAGATGGGCT CCAGACCTTC TACCAAGAAC CCAGCACCTA TGATGCTGAC
7321 TATCCGGGTT GCGCTGGTAC TGAGTTGCAT CTGTCCGGCA AACTCCATTG ATGGCAGGCC
7381 TCTTGCAGCT GCAGGAATTG TGGTTACAGG AGACAAAGCC GTCAACATAT ACACCTCATC
7441 CCAGACAGGA TCAATCATAG TTAAGCTCCT CCCGAATCTG CCCAAGGATA AGGAGGCATG
7501 TGCGAAAGCC CCCTTGGATG CATACAACAG GACATTGACC ACTTTGCTCA CCCCCCTTGG
7561 TGACTCTATC CGTAGGATAC AAGAGTCTGT GACTACATCT GGAGGGGGGA GACAGGGGCG
7621 CCTTATAGGC GCCATTATTG GCGGTGTGGC TCTTGGGGTT GCAACTGCCG CACAAATAAC
7681 AGCGGCCGCA GCTCTGATAC AAGCCAAACA AAATGCTGCC AACATCCTCC GACTTAAAGA
7741 GAGCATTGCC GCAACCAATG AGGCTGTGCA TGAGGTCACT GACGGATTAT CGCAACTAGC
7801 AGTGGCAGTT GGGAAGATGC AGCAGTTTGT TAATGACCAA TTTAATAAAA CAGCTCAGGA
7861 ATTAGACTGC ATCAAAATTG CACAGCAAGT TGGTGTAGAG CTCAACCTGT ACCTAACCGA
7921 ATTGACTACA GTATTCGGAC CACAAATCAC TTCACCTGCT TTAAACAAGC TGACTATTCA
7981 GGCACTTTAC AATCTAGCTG GTGGAAATAT GGATTACTTA TTGACTAAGT TAGGTGTAGG
8041 GAACAATCAA CTCAGCTCAT TAATCGGTAG CGGCTTAATC ACCGGTAACC CTATTCTATA
8101 CGACTCACAG ACTCAACTCT TGGGTATACA GGTAACTCTA CCTTCAGTCG GGAACCTAAA
8161 TAATATGCGT GCCACCTACT TGGAAACCTT ATCCGTAAGC ACAACCAGGG GATTTGCCTC
8221 GGCACTTGTC CCAAAAGTGG TGACACAGGT CGGTTCTGTG ATAGAAGAAC TTGACACCTC
8281 ATACTGTATA GAAACTGACT TAGATTTATA TTGTACAAGA ATAGTAACGT TCCCTATGTC
8341 CCCTGGTATT TATTCCTGCT TGAGCGGCAA TACGTCGGCC TGTATGTACT CAAAGACCGA
8401 AGGCGCACTT ACTACACCAT ACATGACTAT CAAAGGTTCA GTCATCGCCA ACTGCAAGAT
8461 GACAACATGT AGATGTGTAA ACCCCCCGGG TATCATATCG CAAAACTATG GAGAAGCCGT
8521 GTCTCTAATA GATAAACAAT CATGCAATGT TTTATCCTTA GGCGGGATAA CTTTAAGGCT
8581 CAGTGGGGAA TTCGATGTAA CTTATCAGAA GAATATCTCA ATACAAGATT CTCAAGTAAT
8641 AATAACAGGC AATCTTGATA TCTCAACTGA GCTTGGGAAT GTCAACAACT CGATCAGTAA
8701 TGCTTTGAAT AAGTTAGAGG AAAGCAACAG AAAACTAGAC AAAGTCAATG TCAAACTGAC
8761 TAGCACATCT GCTCTCATTA CCTATATCGT TTTGACTATC ATATCTCTTG TTTTTGGTAT
8821 ACTTAGCCTG ATTCTAGCAT GCTACCTAAT GTACAAGCAA AAGGCGCAAC AAAAGACCTT
8881 ATTATGGCTT GGGAATAATA CTCTAGATCA GATGAGAGCC ACTACAAAAA TGTGAACACA
8941 GATGAGGAAC GAAGGTTTCC CTAATAGTAA TTTGTGTGAA AGTTCTGGTA GTCTGTCAGT
9001 TAAGAAAAAA TACGGGTAGA AGGTTAACCG GCCCGCGGAC GCCACCATGA TGTGCAAAGT
9061 ACTGATCTTT GGCTGTATTT CGGTAGCAAT GCTAATGACT ACAGCTTATG GAGCATCTCT
9121 ATCATCAGCA AAAAGGAAAC CTCTTCAAAC ATTAATAAAG GATTTAGAAA TATTGGAAAA
9181 TATCAAGAAC AAGATTCATC TCGAGCTCTA CACACCAACT GAGACCCAGG AGTGCACCCA
9241 GCAAACTCTG CAGTGTTACC TGGGAGAAGT GGTTACTCTG AAGAAAGAAA CTGAAGATGA
9301 CACTGAAATT AAAGAAGAAT TTGTAACTGC TATTCAAAAT ATCGAAAAGA ACCTCAAGAG
9361 TCTTACGGGT CTAAATCACA CCGGAAGTGA ATGCAAGATC TGTGAAGCTA ACAACAAGAA
9421 AAAATTTCCT GATTTTCTCC ATGAACTGAC CAACTTTGTG AGATATCTGC AAAAATAAAC
9481 GCGTGGCCTG AGAGGCCTTC AGAGAGTTAA GAAAAAACTA CCGGTTGTAG ATGACCAAAG
9541 GACGATATAC GGGTAGAACG GTAAGAGAGG CCGCCCCTCA ATTGCGAGCC AGGCTTCACA
9601 ACCTCCGTTC TACCGCTTCA CCGACAACAG TCCTCAATCA TGGACCGCGC CGTTAGCCAA
9661 GTTGCGTTAG AGAATGATGA AAGAGAGGCA AAAAATACAT GGCGCTTGAT ATTCCGGATT
9721 GCAATCTTAT TCTTAACAGT AGTGACCTTG GCTATATCTG TAGCCTCCCT TTTATATAGC
9781 ATGGGGGCTA GCACACCTAG CGATCTTGTA GGCATACCGA CTAGGATTTC CAGGGCAGAA
9841 GAAAAGATTA CATCTACACT TGGTTCCAAT CAAGATGTAG TAGATAGGAT ATATAAGCAA
9901 GTGGCCCTTG AGTCTCCGTT GGCATTGTTA AATACTGAGA CCACAATTAT GAACGCAATA
9961 ACATCTCTCT CTTATCAGAT TAATGGAGCT GCAAACAACA GTGGGTGGGG GGCACCTATC
10021 CATGACCCAG ATTATATAGG GGGGATAGGC AAAGAACTCA TTGTAGATGA TGCTAGTGAT
10081 GTCACATCAT TCTATCCCTC TGCATTTCAA GAACATCTGA ATTTTATCCC GGCGCCTACT
10141 ACAGGATCAG GTTGCACTCG AATACCCTCA TTTGACATGA GTGCTACCCA TTACTGCTAC
10201 ACCCATAATG TAATATTGTC TGGATGCAGA GATCACTCAC ATTCATATCA GTATTTAGCA
10261 CTTGGTGTGC TCCGGACATC TGCAACAGGG AGGGTATTCT TTTCTACTCT GCGTTCCATC
10321 AACCTGGACG ACACCCAAAA TCGGAAGTCT TGCAGTGTGA GTGCAACTCC CCTGGGTTGT
10381 GATATGCTGT GCTCGAAAGT CACGGAGACA GAGGAAGAAG ATTATAACTC AGCTGTCCCT
10441 ACGCGGATGG TACATGGGAG GTTAGGGTTC GACGGCCAGT ACCACGAAAA GGACCTAGAT
10501 GTCACAACAT TATTCGGGGA CTGGGTGGCC AACTACCCAG GAGTAGGGGG TGGATCTTTT
10561 ATTGACAGCC GCGTATGGTT CTCAGTCTAC GGAGGGTTAA AACCCAATTC ACCCAGTGAC
10621 ACTGTACAGG AAGGGAAATA TGTGATATAC AAGCGATACA ATGACACATG CCCAGATGAG
10681 CAAGACTACC AGATTCGAAT GGCCAAGTCT TCGTATAAGC CTGGACGGTT TGGTGGGAAA
10741 CGCATACAGC AGGCTATCTT ATCTATCAAG GTGTCAACAT CCTTAGGCGA AGACCCGGTA
10801 CTGACTGTAC CGCCCAACAC AGTCACACTC ATGGGGGCCG AAGGCAGAAT TCTCACAGTA
10861 GGGACATCTC ATTTCTTGTA TCAACGAGGG TCATCATACT TCTCTCCCGC GTTATTATAT
10921 CCTATGACAG TCAGCAACAA AACAGCCACT CTTCATAGTC CTTATACATT CAATGCCTTC
10981 ACTCGGCCAG GTAGTATCCC TTGCCAGGCT TCAGCAAGAT GCCCCAACTC GTGTGTTACT
11041 GGAGTCTATA CAGATCCATA TCCCCTAATC TTCTATAGAA ACCACACCTT GCGAGGGGTA
11101 TTCGGGACAA TGCTTGATGG TGTACAAGCA AGACTTAACC CTGCGTCTGC AGTATTCGAT
11161 AGCACATCCC GCAGTCGCAT TACTCGAGTG AGTTCAAGCA GTACCAAAGC AGCATACACA
11221 ACATCAACTT GTTTTAAAGT GGTCAAGACT AATAAGACCT ATTGTCTCAG CATTGCTGAA
11281 ATATCTAATA CTCTCTTCGG AGAATTCAGA ATCGTCCCGT TACTAGTTGA GATCCTCAAA
11341 GATGACGGGG TTAGAGAAGC CAGGTCTGGC TAGTTGAGTC AATTATAAAG GAGTTGGAAA
11401 GATGGCATTG TATCACCTAT CTTCTGCGAC ATCAAGAATC AAACCGAATG CCGGCGCGTG
11461 CTCGAATTCC ATGTTGCCAG TTGACCACAA TCAGCCAGTG CTCATGCGAT CAGATTAAGC
11521 CTTGTCAATA GTCTCTTGAT TAAGAAAAAA TGTAAGTGGC AATGAGATAC AAGGCAAAAC
11581 AGCTCATGGT AAATAATACG GGTAGGACAT GGCGAGCTCC GGTCCTGAAA GGGCAGAGCA
11641 TCAGATTATC CTACCAGAGT CACACCTGTC TTCACCATTG GTCAAGCACA AACTACTCTA
11701 TTACTGGAAA TTAACTGGGC TACCGCTTCC TGATGAATGT GACTTCGACC ACCTCATTCT
11761 CAGCCGACAA TGGAAAAAAA TACTTGAATC GGCCTCTCCT GATACTGAGA GAATGATAAA
11821 ACTCGGAAGG GCAGTACACC AAACTCTTAA CCACAATTCC AGAATAACCG GAGTGCTCCA
11881 CCCCAGGTGT TTAGAAGAAC TGGCTAATAT TGAGGTCCCA GATTCAACCA ACAAATTTCG
11941 GAAGATTGAG AAGAAGATCC AAATTCACAA CACGAGATAT GGAGAACTGT TCACAAGGCT
12001 GTGTACGCAT ATAGAGAAGA AACTGCTGGG GTCATCTTGG TCTAACAATG TCCCCCGGTC
12061 AGAGGAGTTC AGCAGCATTC GTACGGATCC GGCATTCTGG TTTCACTCAA AATGGTCCAC
12121 AGCCAAGTTT GCATGGCTCC ATATAAAACA GATCCAGAGG CATCTGATGG TGGCAGCTAG
12181 GACAAGGTCT GCGGCCAACA AATTGGTGAT GCTAACCCAT AAGGTAGGCC AAGTCTTTGT
12241 CACTCCTGAA CTTGTCGTTG TGACGCATAC GAATGAGAAC AAGTTCACAT GTCTTACCCA
12301 GGAACTTGTA TTGATGTATG CAGATATGAT GGAGGGCAGA GATATGGTCA ACATAATATC
12361 AACCACGGCG GTGCATCTCA GAAGCTTATC AGAGAAAATT GATGACATTT TGCGGTTAAT
12421 AGACGCTCTG GCAAAAGACT TGGGTAATCA AGTCTACGAT GTTGTATCAC TAATGGAGGG
12481 ATTTGCATAC GGAGCTGTCC AGCTACTCGA GCCGTCAGGT ACATTTGCAG GAGATTTCTT
12541 CGCATTCAAC CTGCAGGAGC TTAAAGACAT TCTAATTGGC CTCCTCCCCA ATGATATAGC
12601 AGAATCCGTG ACTCATGCAA TCGCTACTGT ATTCTCTGGT TTAGAACAGA ATCAAGCAGC
12661 TGAGATGTTG TGTCTGTTGC GTCTGTGGGG TCACCCACTG CTTGAGTCCC GTATTGCAGC
12721 AAAGGCAGTC AGGAGCCAAA TGTGCGCACC GAAAATGGTA GACTTTGATA TGATCCTTCA
12781 GGTACTGTCT TTCTTCAAGG GAACAATCAT CAACGGGTAC AGAAAGAAGA ATGCAGGTGT
12841 GTGGCCGCGA GTCAAAGTGG ATACAATATA TGGGAAGGTC ATTGGGCAAC TACATGCAGA
12901 TTCAGCAGAG ATTTCACACG ATATCATGTT GAGAGAGTAT AAGAGTTTAT CTGCACTTGA
12961 ATTTGAGCCA TGTATAGAAT ATGACCCTGT CACCAACCTG AGCATGTTCC TAAAAGACAA
13021 GGCAATCGCA CACCCCAACG ATAATTGGCT TGCCTCGTTT AGGCGGAACC TTCTCTCCGA
13081 AGACCAGAAG AAACATGTAA AAGAAGCAAC TTCGACTAAT CGCCTCTTGA TAGAGTTTTT
13141 AGAGTCAAAT GATTTTGATC CATATAAAGA GATGGAATAT CTGACGACCC TTGAGTACCT
13201 TAGAGATGAC AATGTGGCAG TATCATACTC GCTCAAGGAG AAGGAAGTGA AAGTTAATGG
13261 ACGGATCTTC GCTAAGCTGA CAAAGAAGTT AAGGAACTGT CAGGTGATGG CGGAAGGGAT
13321 CCTAGCCGAT CAGATTGCAC CTTTCTTTCA GGGAAATGGA GTCATTCAGG ATAGCATATC
13381 CTTGACCAAG AGTATGCTAG CGATGAGTCA ACTGTCTTTT AACAGCAATA AGAAACGTAT
13441 CACTGACTGT AAAGAAAGAG TATCTTCAAA CCGCAATCAT GATCCGAAAA GCAAGAACCG
13501 TCGGAGAGTT GCAACCTTCA TAACAACTGA CCTGCAAAAG TACTGTCTTA ATTGGAGATA
13561 TCAGACAATC AAATTGTTCG CTCATGCCAT CAATCAGTTG ATGGGCCTAC CTCACTTCTT
13621 CGAATGGATT CACCTAAGAC TGATGGACAC TACGATGTTC GTAGGAGACC CTTTCAATCC
13681 TCCAAGTGAC CCTACTGACT GTGACCTCTC AAGAGTCCCT AATGATGACA TATATATTGT
13741 CAGTGCCAGA GGGGGTATCG AAGGATTATG CCAGAAGCTA TGGACAATGA TCTCAATTGC
13801 TGCAATCCAA CTTGCTGCAG CTAGATCGCA TTGTCGTGTT GCCTGTATGG TACAGGGTGA
13861 TAATCAAGTA ATAGCAGTAA CGAGAGAGGT AAGATCAGAC GACTCTCCGG AGATGGTGTT
13921 GACACAGTTG CATCAAGCCA GTGATAATTT CTTCAAGGAA TTAATTCATG TCAATCATTT
13981 GATTGGCCAT AATTTGAAGG ATCGTGAAAC CATCAGGTCA GACACATTCT TCATATACAG
14041 CAAACGAATC TTCAAAGATG GAGCAATCCT CAGTCAAGTC CTCAAAAATT CATCTAAATT
14101 AGTGCTAGTG TCAGGTGATC TCAGTGAAAA CACCGTAATG TCCTGTGCCA ACATTGCCTC
14161 TACTGTAGCA CGGCTATGCG AGAACGGGCT TCCCAAAGAC TTCTGTTACT ATTTAAACTA
14221 TATAATGAGT TGTGTGCAGA CATACTTTGA CTCTGAGTTC TCCATCACCA ACAATTCGCA
14281 CCCCGATCTT AATCAGTCGT GGATTGAGGA CATCTCTTTT GTGCACTCAT ATGTTCTGAC
14341 TCCTGCCCAA TTAGGGGGAC TGAGTAACCT TCAATACTCA AGGCTCTACA CTAGAAATAT
14401 CGGTGACCCG GGGACTACTG CTTTTGCAGA GATCAAGCGA CTAGAAGCAG TGGGATTACT
14461 GAGTCCTAAC ATTATGACTA ATATCTTAAC TAGGCCGCCT GGGAATGGAG ATTGGGCCAG
14521 TCTGTGCAAC GACCCATACT CTTTCAATTT TGAGACTGTT GCAAGCCCAA ATATTGTTCT
14581 TAAGAAACAT ACGCAAAGAG TCCTATTTGA AACTTGTTCA AATCCCTTAT TGTCTGGAGT
14641 GCACACAGAG GATAATGAGG CAGAAGAGAA GGCATTGGCT GAATTCTTGC TTAATCAAGA
14701 GGTGATTCAT CCCCGCGTTG CGCATGCCAT CATGGAGGCA AGCTCTGTAG GTAGGAGAAA
14761 GCAAATTCAA GGGCTTGTTG ACACAACAAA CACCGTAATT AAGATTGCGC TTACTAGGAG
14821 GCCATTAGGC ATCAAGAGGC TGATGCGGAT AGTCAATTAT TCTAGCATGC ATGCAATGCT
14881 GTTTAGAGAC GATGTTTTTT CCTCCAGTAG ATCCAACCAC CCCTTAGTCT CTTCTAATAT
14941 GTGTTCTCTG ACACTGGCAG ACTATGCACG GAATAGAAGC TGGTCACCTT TGACGGGAGG
15001 CAGGAAAATA CTGGGTGTAT CTAATCCTGA TACGATAGAA CTCGTAGAGG GTGAGATTCT
15061 TAGTGTAAGC GGAGGGTGTA CAAGATGTGA CAGCGGAGAT GAACAATTTA CTTGGTTCCA
15121 TCTTCCAAGC AATATAGAAT TGACCGATGA CACCAGCAAG AATCCTCCGA TGAGGGTACC
15181 ATATCTCGGG TCAAAGACAC AGGAGAGGAG AGCTGCCTCA CTTGCAAAAA TAGCTCATAT
15241 GTCGCCACAT GTAAAGGCTG CCCTAAGGGC ATCATCCGTG TTGATCTGGG CTTATGGGGA
15301 TAATGAAGTA AATTGGACTG CTGCTCTTAC GATTGCAAAA TCTCGGTGTA ATGTAAACTT
15361 AGAGTATCTT CGGTTACTGT CCCCTTTACC CACGGCTGGG AATCTTCAAC ATAGACTAGA
15421 TGATGGTATA ACTCAGATGA CATTCACCCC TGCATCTCTC TACAGGGTGT CACCTTACAT
15481 TCACATATCC AATGATTCTC AAAGGCTGTT CACTGAAGAA GGAGTCAAAG AGGGGAATGT
15541 GGTTTACCAA CAGATCATGC TCTTGGGTTT ATCTCTAATC GAATCGATCT TTCCAATAAC
15601 AACAACCAGG ACATATGATG AGATCACACT GCACCTACAT AGTAAATTTA GTTGCTGTAT
15661 CAGAGAAGCA CCTGTTGCGG TTCCTTTCGA GCTACTTGGG GTGGTACCGG AACTGAGGAC
15721 AGTGACCTCA AATAAGTTTA TGTATGATCC TAGCCCTGTA TCGGAGGGAG ACTTTGCGAG
15781 ACTTGACTTA GCTACTTTCA AGAGTTATGA GCTTAATCTG GAGTCATATC CCACGATAGA
15841 GCTAATGAAC ATTCTTTCAA TATCCAGCGG GAAGTTGATT GGCCAGTCTG TGGTTTCTTA
15901 TGATGAAGAT ACCTCCATAA AGAATGACGC CATAATAGTG TATGACAATA CCCGAAATTG
15961 GATCAGTGAA GCTCAGAATT CAGATGTGGT CCGCCTATTT GAATATGCAG CACTTGAAGT
16021 GCTCCTCGAC TGTTCTTACC AACTCTATTA CCTGAGAGTA AGAGGCCTAG ACAATATTGT
16081 CTTATATATG GGTGATTTAT ACAAGAATAT GCCAGGAATT CTACTTTCCA ACATTGCAGC
16141 TACAATATCT CATCCCGTCA TTCATTCAAG GTTACATGCA GTGGGCCTGG TCAACCATGA
16201 CGGATCACAC CAACTTGCAG ATACGGATTT TATCGAAATG TCTGCAAAAC TATTAGTATC
16261 TTGCACCCGA CGTGTGATCT CCGGCTTATA TTCAGGAAAT AAGTATGATC TGCTGTTCCC
16321 ATCTGTCTTA GATGATAACC TGAATGAGAA GATGCTTCAG CTGATATCCC GGTTATGCTG
16381 TCTGTACACG GTACTCTTTG CTACAACAAG AGAAATCCCG AAAATAAGAG GCTTAACTGC
16441 AGAAGAGAAA TGTTCAATAC TCACTGAGTA TTTACTGTCG GATGCTGTGA AACCATTACT
16501 TAGTCCCGAT CAAGTGAGCT CTATCATGTC TCCTAACATA ATTACATTCC CAGCTAATCT
16561 GTACTACATG TCTCGGAAGA GCCTCAATTT GATCAGGGAA AGGGAGGACA GGGATACTAT
16621 CCTGGCGTTG TTGTTCCCCC AAGAGCCATT ATTAGAGTTC CCTTCTGTGC AAGATATTGG
16681 TGCTCGAGTG AAAGATCCAT TCACCCGACA ACCTGCGGCA TTTTTGCAAG AGTTAGATTT
16741 GAGTGCTCCA GCAAGGTATG ACGCATTCAC ACTTAGTCAG ATTCATCCTG AACTCACATC
16801 TCCAAATCCG GAGGAAGACT ACTTAGTACG ATACTTGTTC AGAGGGATAG GGACTGCATC
16861 TTCCTCTTGG TATAAGGCAT CTCATCTCCT TTCTGTACCC GAGGTAAGAT GTGCAAGACA
16921 CGGGAACTCC TTATACTTAG CTGAAGGGAG CGGAGCCATC ATGAGTCTTC TCGAACTGCA
16981 TGTACCACAT GAAACTATCT ATTACAATAC GCTCTTTTCA AATGAGATGA ACCCCCCGCA
17041 ACGACATTTC GGGCCGACCC CAACTCAGTT TTTGAATTCG GTTGTTTATA GGAATCTACA
17101 GGCGGAGGTA ACATGCAAAG ATGGATTTGT CCAAGAGTTC CGTCCATTAT GGAGAGAAAA
17161 TACAGAGGAA AGTGACCTGA CCTCAGATAA AGTAGTGGGG TATATTACAT CTGCAGTGCC
17221 CTACAGATCT GTATCATTGC TGCATTGTGA CATTGAAATT CCTCCAGGGT CCAATCAAAG
17281 CTTACTAGAT CAACTAGCTA TCAATTTATC TCTGATTGCC ATGCATTCTG TAAGGGAGGG
17341 CGGGGTAGTA ATCATCAAAG TGTTGTATGC AATGGGATAC TACTTTCATC TACTCATGAA
17401 CTTGTTTGCT CCGTGTTCCA CAAAAGGATA TATTCTCTCT AATGGTTATG CATGTCGAGG
17461 AGATATGGAG TGTTACCTGG TATTTGTCAT GGGTTACCTG GGCGGGCCTA CATTTGTACA
17521 TGAGGTGGTG AGGATGGCGA AAACTCTGGT GCAGCGGCAC GGTACGCTTT TGTCTAAATC
17581 AGATGAGATC ACACTGACCA GGTTATTCAC CTCACAGCGG CAGCGTGTGA CAGACATCCT
17641 ATCCAGTCCT TTACCAAGAT TAATAAAGTA CTTGAGGAAG AATATTGACA CTGCGCTGAT
17701 TGAAGCCGGG GGACAGCCCG TCCGTCCATT CTGTGCGGAG AGTCTGGTGA GCACGCTAGC
17761 GAACATAACT CAGATAACCC AGATCATCGC TAGTCACATT GACACAGTTA TCCGGTCTGT
17821 GATATATATG GAAGCTGAGG GTGATCTCGC TGACACAGTA TTTCTATTTA CCCCTTACAA
17881 TCTCTCTACT GACGGGAAAA AGAGGACATC ACTTAAACAG TGCACGAGAC AGATCCTAGA
17941 GGTTACAATA CTAGGTCTTA GAGTCGAAAA TCTCAATAAA ATAGGCGATA TAATCAGCCT
18001 AGTGCTTAAA GGCATGATCT CCATGGAGGA CCTTATCCCA CTAAGGACAT ACTTGAAGCA
18061 TAGTACCTGC CCTAAATATT TGAAGGCTGT CCTAGGTATT ACCAAACTCA AAGAAATGTT
18121 TACAGACACT TCTGTACTGT ACTTGACTCG TGCTCAACAA AAATTCTACA TGAAAACTAT
18181 AGGCAATGCA GTCAAAGGAT ATTACAGTAA CTGTGACTCT TAACGAAAAT CACATATTAA
18241 TAGGCTCCTT TTTTGGCCAA TTGTATTCTT GTTGATTTAA TCATATTATG TTAGAAAAAA
18301 GTTGAACCCT GACTCCTTAG GACTCGAATT CGAACTCAAA TAAATGTCTT AAAAAAAGGT
18361 TGCGCACAAT TATTCTTGAG TGTAGTCTCG TCATTCACCA AATCTTTGTT TGGTTTGGTG
18421 GCCGGCATGG TCCCAGCCTC CTCGCTGGCG CCGGCTGGGC AACATTCCGA GGGGACCGTC
18481 CCCTCGGTAA TGGCGAATGG GACGCGGCCG ATCCGGCTGC TAACAAAGCC CGAAAGGAAG
18541 CTGAGTTGGC TGCTGCCACC GCTGAGCAAT AACTAGCATA ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC
18601 GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG CTGAAAGGAG GAACTATATC CGGATCGGCC GATCCGGCTG
18661 CTAACAAAGC CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT
18721 AACCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT
18781 CCGGATGGCC GCCACCGGTG GGCCTTGCAG CACATCCCCC CTTCGCCAG
机译: 重组DNA表达盒,重组DNA分子,重组火鸡疱疹病毒,宿主细胞,构建重组火鸡疱疹病毒,制备疫苗,预防或减少传染性法氏囊病病毒感染和/或新城疫病毒或相关症状的方法鸟类疾病和疫苗接种,鸟类疫苗以及表达盒和疫苗的用途。
机译: 表达4型翼状腺病毒截短纤维2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株的制备方法及其应用。
机译: 用于检测apirase mansoni RNA测序的方法,通过测序方法检测apirase s.Mansoni RNA的存在,用于检测apgenase基因在DNA基因中的存在的方法。人体中重组疫苗apirase片段的生产,血浆表达,抗体apirase s的生产方法,Mansoni apirase,抗体,疫苗,apirase s蛋白的检测方法,mansoni的生产方法人体apirase中表达该基因的重组体,重组DNA载体,载体,蛋白apirase蛋白S.mansoni,S.mansoni apirase的cDNA基因