一个水稻锌指蛋白基因的抗白叶枯病基因工程应用

摘要

本发明属于基因工程领域，涉及一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，重组载体和转化细胞、转基因水稻的鉴定方法及载体、转化细胞、培育方法在水稻抗白叶枯病上的应用。培育方法为(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得；(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得；(3)转基因植株获得。重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA连接酶将基因ZFP181连接到植物表达载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白，必要时可包括增强子；基因ZFP181参与水稻的抗病应答反应，增强ZFP181的表达能提高水稻抗白叶枯病性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因 水稻的培育方法，在培育方法中使用的重组载体和转化细胞、转基因水稻的鉴定 方法及以上载体、转化细胞、培育方法在水稻抗白叶枯病上的应用。

背景技术

A20/AN1锌指蛋白是一类具有A20或AN1锌指结构的蛋白，其广泛存在 于真核生物中。已有研究结果表明，A20/AN1锌指蛋白在动物体中主要参与 NF-κB介导的免疫反应，而在植物体中主要参与非生物胁迫响应。

OSISAP1为植物中分离的第一个A20/AN1锌指蛋白基因。OSISAP1的表达 受冷、脱水、盐、水浸没(低氧)、重金属、机械伤害等胁迫及胁迫激素ABA 的诱导。过量表达OSISAP1可提高转基因烟草幼苗对盐、冷及干旱的耐受性 (Mukhopadhyay et al.，2004)。随着基因组测序的深入开展，人们在水稻、拟南芥、 杨树、玉米和番茄基因组中分别鉴定了18、14、19、11和13个A20/AN1型锌 指蛋白(Huang et al.，2008；Jin et al.，2007；Solanke et al.，2009；Vij and Tyagi， 2006)。进一步分析研究发现植物中大部分A20/AN1家族锌指蛋白基因的表达受 一种或多种非生物胁迫诱导(Huang et al.，2008；Jin et al.，2007；Solanke et al.，2009； Stroher et al.，2009；Vij and Tyagi，2006)，可能参与了非生物胁迫响应(Solanke et  al.，2009；Vij and Tyagi，2006)

随着植物A20/AN1锌指蛋白家族基因的鉴定，关于该基因家族成员功能的 鉴定也逐步展开。OsiSAP8受盐、干旱、脱水、冷、水浸没、伤害、重金属及 ABA诱导。过量表达OsiSAP8能提高苗期烟草及水稻对盐，冷及干旱胁迫的耐 受性。水稻ZFP177受冷及热胁迫诱导，过量表达ZFP177能提高转基因烟草幼 苗对冷、热及氧化胁迫的耐受性，但导致转基因烟草幼苗对盐及干旱胁迫敏感。 獐毛AlSAP受盐、冷、热胁迫及ABA、SA诱导，异源表达AlSAP能提高转基 因酵母对渗透胁迫及离子胁迫的耐受性。过量表达AlSAP转基因烟草与野生型 一样表现正常生长表型，同时能提高转基因烟草植株对冷、热、干旱及盐胁迫的 耐受性。过量AlSAP转基因水稻表现与其转基因烟草相似结果，能提高其对冷、 干旱及盐胁迫的耐受性。此外，AlSAP能提高转基因小麦的抗旱性及耐盐性(Ben  Saad et al.，2012a)。AtSAP12受冷及盐诱导，其重组蛋白四级结构随着氧化还原 状态改变而改变，高浓度DTT和硫氧还蛋白TrxA，低浓度DTT，硫氧还蛋白与 其依赖的NADPH均能降低氧化的AtSAP12聚合体，增加AtSAP12单体蛋白量。 在盐及冷胁迫条件下，AtSAP12单体蛋白量显著降低，推测AtSAP12可能通过 不同氧化还原状态下功能的改变而来参与非生物胁迫响应(Stroher et al.，2009)。 AtSAP10表达受各种胁迫调节，包括金属及非金属离子(Cd、Zn、AsIII、AsIV， Ni和Mn)、ABA、热，盐和冷。AtSAP10能提高转基因拟南芥对高温、Zn、 Mn和Ni胁迫耐受性(Dixit and Dhankher，2011)。

以上研究表明A20/AN1型锌指蛋白在植物抗逆应答反应中发挥了重要的作 用，然而该类基因在植物抗病应答反应中的研究还罕见报道。

发明内容

针对目前A20/AN1型锌指蛋白类基因在植物抗病应答反应中研究的空白， 公开水稻A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯病基因工程中的应用，过 量表达该基因可以提高植物的抗白叶枯病性，有利于水稻抗病性遗传改良。

本发明的目的具体通过以下技术手段获得：

1.本发明提供一种重组载体，该载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的 A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA链接酶将基因ZFP181连接到载体， 能够过量表达A20/AN1锌指蛋白。

所述表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等，该表达载体以任 何一种启动子启动表达，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启 动子、Actin启动子，自身基因启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包 括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。

2.本发明还提供包括上述1重组载体的转化细胞。

3.本发明提供一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法， 该方法包括如下步骤：

(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得

选用水稻粳稻品种韭菜青，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA，参 照Ferments公司反转录系统合成韭菜青cDNA第一链；设计基因克隆引物上游 引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZFP181R： 5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′，以反转录获得的韭菜青cDNA为模板，通 过PCR扩增ZFP181基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP181基因片段连接到 pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP181；

(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得

根据ZFP181基因序列，以步骤(1)中获得的重组质粒pMD18T-ZFP181为 模板，设计引物对，通过PCR扩增ZFP181基因全长；利用Nco I与BstP I将 ZFP181全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1304的CaMV 35S启动子下 游，获得重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181；

(3)转基因植株获得

将获得的重组载体pCAMBIA1304-ZFP181转化农杆菌EHA105；以水稻粳 稻品种“中花11”为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体 pCAMBIA1304-ZFP181中包含目的基因ZFP181的T-DNA区整合到水稻基因组 中，从而获得ZFP181过量表达转基因植株。

转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

4.权利要求3所述的锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法， 其特征在于：步骤(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得过程中使用的引物对， 上游引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZFP181R： 5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′；步骤(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181 的获得过程中，设计的引物对为ZFP181F-30a：5′-TCTCGGATTCG ACCATGGC-3′；ZFP181Rs：5′-GAGGTAACCGGAAAATTC AGGTTG-3′。

5.转锌指蛋白基因ZFP181水稻的鉴定方法，其特征在于：该方法包括如下 步骤(1)设计转基因检测引物对：LacZ-F：5′-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3′， 181RT2-R：5′-AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3′，对提取的转基因水稻DNA进行 PCR检测，能够扩增出1313bp DNA片段的植株即为ZFP181过量表达转基因水 稻阳性植株；从而确定ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；

(2)设计ZFP181基因特异引物181RT4-F：5′-AGGAG CCGACGG AGCTGAGG-3′与181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′及内参基因18S  rRNA引物18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′，18S-R：5′-CAGACACT AAAGCGCCCGGTA-3′，以野生型水稻作对照，对待检测转基因水稻进行实时荧 光定量PCR分析；通过与野生型对照相比，ZFP181基因的表达高于野生型对照 的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；

(3)提取ZFP181过量表达转基因植株DNA并利用EcoR I对各个转基因 株系基因组DNA进行酶切，以hptII基因编码区内583bp DNA序列为模板，通 过随机引物扩增获得地高辛标记的探针，进行Southern杂交分析，具有阳性检 测条带的待检测转基因水稻为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株。

6.序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯 病水稻育种上的应用，其特征在于：增强所述的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181 的表达，能够提高水稻的抗白叶枯病性。

7.权利要求1所述的重组载体在抗白叶枯病水稻育种上的应用。

8.权利要求2所述的转化细胞在抗白叶枯病水稻育种上的应用。

9.权利要求3-4任一项所述培育方法抗白叶枯病上的应用。

10.根据权利要求3-4任一项所述方法制成的转基因水稻在抗白叶枯病上的 应用。

有益效果：

1.本发明公开了一种过量表达水稻ZFP181基因的抗白叶枯病性基因工程应 用。该基因来自水稻(Oryza sativa L.)，能够在水稻中稳定过量表达，过量表 达该基因可以提高水稻的抗白叶枯病性，有利于水稻抗病性遗传改良。

2.本发明人提供的ZFP181基因功能是参与水稻的抗病应答反应，属于诱导 性表达，正常情况下，水稻A20/AN1锌指蛋白正常表达，当水稻收到白叶枯病 感染后能及时在白叶枯病的诱导下过量表达蛋白，既能提高水稻的抗病性，也避 免水稻在正常情况下过表达蛋白而影响产量。

3.利用本发明ZFP181基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何 一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子、Actin 启动子，自身基因启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不 论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括 对抗生素抗性的酶，对除草剂具有抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β-葡糖醛 酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标 记选择。

附图说明

图1重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181载体的构建

A.重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的载体结构图。B.重组质粒 pCAMBIA1304-ZFP181双酶切鉴定。M1：DNA分子标记DL2000plus；M2： DNA分子标记DL15k bps；1：重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181；2：重组质粒 pCAMBIA1304-ZFP181pro经BstP I和Nco I双酶切

图2重组质粒pTCK303-ZFP181载体的构建

A.重组质粒pTCK303-ZFP181的载体结构图。B.重组质粒 pTCK303-ZFP181双酶切鉴定。M1：DNA分子标记DL2000plus；M2：DNA分 子标记DL15k bps；1：重组质粒pTCK303-ZFP181经Kpn I和BamH I双酶切； 2：重组质粒pTCK303-ZFP181经Sac I和Spe I双酶切；3重组质粒 pTCK303-ZFP181经SacI和BamHI双酶切；4：重组质粒pTCK303-ZFP181

图3 ZFP181过量表达转基因水稻的PCR鉴定

1-14：ZFP181过量表达转基因水稻T₀代株系；WT，-，+：分别为野生型 (中花11)，阴性对照，阳性对照；M：DNA分子标记DL2000plus。

图4 ZFP181RNAi干涉抑制表达转基因水稻的PCR鉴定

1-33：ZFP181干涉抑制表达转基因水稻T₀代株系；WT，-，+：分别为野 生型(中花11)，阴性对照，阳性对照；M：DNA分子标记DL2000plus。

图5 ZFP181转基因水稻植株的Real-time PCR和Southern blot鉴定

A.Real-time PCR鉴定ZFP181过量表达转基因水稻。B.Real-time PCR鉴定 ZFP181RNAi转基因水稻。C.Southern blot鉴定ZFP181过量表达转基因水稻。 D.Southern blot鉴定ZFP181RNAi抑制表达转基因水稻。Ox1-Ox8：ZFP181过 量表达转基因株系；Wild type：野生型植株；Kd1-Kd8：ZFP181RNAi转基因 株系。

图6 ZFP181转基因水稻白叶枯病抗性鉴定

A.ZFP181转基因水稻白叶枯病抗性鉴定；B.ZFP181转基因水稻剑叶经白 叶枯侵染14后病斑长度统计。

Ox3，Ox4：ZFP181过量表达转基因水稻株系；WT：野生型植株；Kd2， Kd4：ZFP181 RNAi转基因株系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1.

锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育

(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得

选用水稻粳稻品种韭菜青，于人工气候培养箱(16h光照/8h黑暗，白天 30℃夜晚26℃)中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方。待幼苗 生长至3-4叶期时，取幼苗于液氮中速冻并于-80℃冰箱中保存备用。取保存的 水稻幼苗样品，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA的提取。总RNA的 质量以及浓度通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，获得符合质量的总RNA即28s rRNA 和18s sRNA条带清晰，进一步用于合成cDNA第一链。cDNA第一链的合成参 照Ferments公司反转录系统的操作手册进行。

设计基因克隆引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′及ZFP181R： 5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′，以反转录获得的韭菜青cDNA为模板，通 过PCR扩增ZFP181基因全长。PCR扩增使用Prime star HS DNA聚合酶 (Takara)，PCR程序如下：98℃预变性5min，98℃变性5s，56℃复性10s， 72℃延伸40s，30个循环后，72℃10min。然后在PCR产物中加入普通DNA 聚合酶72℃保温30min，通过电泳检测PCR扩增结果并利用DNA片段纯化试 剂盒回收所扩增的DNA片段。进一步通过TA-克隆系统将DNA片段连接到 pMD18-T载体，利用CaCl₂转化法将其转入大肠杆菌DH5α中获得重组质粒 pMD18T-ZFP181。重组质粒经测序后获得具有完整ORF的水稻A20/AN1锌指 蛋白基因ZFP181的cDNA序列SEQ ID NO.1。ZFP181的ORF全长516bp，编 码171个氨基酸。

(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得

根据ZFP181基因序列，设计一对载体构建引物ZFP181F-30a： 5′-TCTCGGATTCGACCATGGC-3′与ZFP181Rs：5′-GAGGTAACCGGAAAA TTCAGGTTG-3′，以实施例1中获得的重组质粒pMD18T-ZFP181为模板通过 PCR扩增ZFP181基因全长。利用Nco I与BstP I将ZFP181全长正向插入植物 双元表达载体pCAMBIA1304的CaMV 35S启动子下游，获得重组质粒 pCAMBIA1304-ZFP181并通过测序验证其正确性(图1)。

(3)转基因植株获得

将获得的重组载体通过冻融法转化农杆菌EHA105。以水稻粳稻品种“中花 11”为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pCAMBIA1304-ZFP181 中目的基因ZFP181的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181过量表 达转基因植株。

实施例2

锌指蛋白基因ZFP181RNAi转基因水稻的培育

步骤(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得如实施例1

(2)重组质粒pTCK303-ZFP181的获得

利用在线RNAi靶定位点预测软件(http：//bioinfo.clontech.com/rnaidesigner http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)，对ZFP181全长cDNA 序列的可能siRNA位点进行预测，选取可能siRNA位点最多且序列特异性最好 的cDNA片段，长度为254bp，作为干涉区段插入植物干涉表达载体。根据选取 的干涉区段设计引物RNAi-181F1：5′-GGTACCGTTAGGTTCTAAAAG GATAATAC-3′与RNAi-181R1：5′-TTGGATCCTCAACCACCACTACA-3′，以重 组质粒pMD18T-ZFP181为模板扩增干涉DNA区段并通过BamHI和Kpn I酶切 位点将该序列反向插入pTCK303植物干涉表达载体MCS1中获得pTCK303-C1。 同时，设计引物RNAi-181F2：5′-CCA AACTAGTTAGGTTCTAAAAGGATAA TAC-3′与RNAi-181R2：5′-GAGCTCAACCTCAACCACCACTA-3′，以重组质粒 pMD18T-ZFP181为模板扩增干涉DNA区段并通过Spe I与Sac I酶切位点将该 序列正向插入pTCK303-C1植物干涉表达载体MCS2中，从而获得重组质粒 pTCK303-ZFP181并通过测序验证其正确性(图2)。

(3)转基因植株获得

将获得的重组载体通过冻融法转化农杆菌EHA105。以水稻粳稻品种中花11 为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pTCK303-ZFP181中包含目 的片段的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181 RNAi转基因植株。

实施例3

ZFP181过量表达转基因水稻分子鉴定

取T3代转基因水稻叶片，通过SDS小量DNA提取法提取水稻基因组DNA。 以提取的DNA为模板，通过引物LacZ-F：5′-GGCTCG TATGTTGTGTGGAA-3′ 与181RT2-R：5′-AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3′进行PCR检测，其中能够扩增 出1313bp DNA片段的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株，结果所 检测的14株水稻植株中有13株为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株(图3)。

设计ZFP181基因特异引物181RT4-F：5′-AGGAGCCGACGGAGCTGAGG-3′ 与181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′及内参基因18S rRNA引物 18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′，18S-R：5′-CAGACACTAAAGCGCC CGGTA-3′，对ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株进行实时荧光定量PCR分 析，结果表明所检测的8个阳性转基因水稻株系除Ox6和Ox7外，其余6个阳 性转基因水稻株系中ZFP181基因的表达均高于野生型对照(图5-A)

提取ZFP181过量表达转基因植株DNA并利用EcoR I对各个转基因株系 基因组DNA进行酶切，以hptII基因编码区内583bp DNA序列为模板，通过随 机引物扩增获得地高辛标记的探针，从而进行Southern杂交分析，实验方法参 照Southern杂交试剂盒(Roche)，结果显示所检测的转基因株系成功整合了外 源目的DNA(图5-C)

实施例4

锌指蛋白基因ZFP181RNAi转基因水稻的分子鉴定

设计多克隆插入位点MCS2两侧载体特异性引物LacZ-F：5′-GGCTCG TAT GTTGTGTGGAA-3′与P303C2-R：5′-TGGTCCAGTCTTTCCGCTGATA-3′，以提 取的DNA为模板进行PCR阳性验证，其中能够扩增出934bp DNA片段的植株 即为ZFP181 RNAi转基因水稻阳性植株，结果所检测的33株水稻中有23株为 ZFP181 RNAi转基因水稻阳性植株(图4)。

设计ZFP181基因特异引物181RT4-F：5′-AGGAGCCGACGGAGCTGAGG-3′ (SEQ ID NO.12)与181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′(SEQ ID NO. 13)及内参基因18S rRNA引物18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′(SEQ ID  NO.14)，18S-R：5′-CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3′(SEQ ID NO.15)， 对ZFP181 RNAi转基因水稻阳性植株进行实时荧光定量PCR分析。结果表明所 检测的8个阳性转基因水稻株系中ZFP181基因的表达均低于野生型对照(图 5-B)。

提取ZFP181 RNAi转基因植株DNA并利用EcoR I对各个转基因株系基因 组DNA进行酶切，以hptII基因编码区内583bp DNA序列为模板，通过随机引 物扩增获得地高辛标记的探针，从而进行Southern杂交分析，实验方法参照 Southern杂交试剂盒(Roche)，结果显示所检测的转基因株系成功整合了1-3 个拷贝外源目的DNA(图5-D)

实施例5

转基因植株抗病性鉴定

分别将ZFP181过量表达转基因水稻和ZFP181 RNAi转基因水稻播种并种 植于大田中生长到孕穗期，对水稻植株剑叶进行剪叶接种白叶枯病菌，具体方法 如下：首先将白叶枯菌系Z173划线于牛肉汁蛋白胨培养基(蛋白胨5-10g/L， 牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏1g/L，蔗糖10g/L，琼脂15/L，PH 6.8-7.0)，28-30℃ 恒温培养箱中培养2-5天至长出菌落。然后将白叶枯菌落用去离子水重悬并稀释 至OD₆₀₀＝0.5(菌液浓度约为5X 10⁸cfu/mL)，用于进一步水稻叶片接菌。接种 时将剪刀进入白叶枯菌悬液1-2s，再用沾有菌液的剪刀从距剑叶顶部1-2cm处 剪去叶尖，每株水稻接菌3-5片剑叶，每个株系接菌3-5株植株，接菌2-3周后， 统计发病情况。结果显示ZFP181过量表达转基因水稻接菌叶片病斑长度显著低 于野生型水稻，而ZFP181 RNAi干涉抑制转基因水稻接菌叶片病斑长度与野生 型无明显差异，表明ZFP181过量表达能增强水稻对白叶枯病的抗性(图6)。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而 本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种 改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。