光敏色素调控的一个B-BOX型锌指蛋白基因在水稻生长发育中的作用

摘要

在比较野生型日本晴水稻(Widetype,WT)和phyB缺陷型突变体水稻的基因表达谱时,我们筛选到一个受光敏色素B(phyB)所介导的红光抑制的B-box型锌指蛋白基因,进化树分析表明,该基因与拟南芥的BBX22基因属于同一个分支,故将其命名为OsBBX22b。 为了揭示OsBBX22b基因在水稻生长发育中的作用,在本研究中,我们分析了该基因的表达模式、OsBBX22b蛋白质的亚细胞定位、潜在的转录激活活性和可能的相互作用蛋白。同时培育了该基因的过表达水稻株系,并分析了转基因水稻株系的生长发育特征。具体结果如下: (1)对OsBBX22b基因的表达模式分析结果表明,OsBBX22b基因在叶片,特别是旗叶中表达水平非常高,而且OsBBX22b基因的表达受光周期和生物钟调节。据此推测OsBBX22b基因可能参与水稻的光周期反应。通过分析外源激素JA和ABA以及干旱和盐胁迫对OsBBX22b基因表达水平的影响,结果表明JA抑制OsBBX22b基因的表达;ABA瞬时诱导OsBBX22b基因的表达;干旱和盐胁迫均能瞬时抑制OsBBX22b基因的表达。 (2)OsBBX22b蛋白的亚细胞定位显示,OsBBX22b定位于细胞核。修饰的酵母单杂实验表明,OsBBX22b(至少在酵母中)具有潜在的转录激活活性(B-box功能域起主要作用)。 (3)酵母双杂实验的初步结果表明,OsBBX22b可能与拟南芥的7个转录因子相互作用。 (4)红光和远红光脉冲实验表明,与WT相比OsBBX22b-OX株系的胚芽鞘对红光和远红光不敏感,据此推测OsBBX22b可能负调控光敏色素介导的光信号途径。 (5)OsBBX22b-OX植株对外源ABA反应结果表明,OsBBX22b-OX株系对外源ABA超敏感,进一步的RT-PCR分析结果表明OsBBX22b可能影响ABA的应答途径。 (6)通过比较OsBBX22b-OX株系和WT的表型,我们发现从种子萌发到种子成熟的整个生命周期中,OsBBX22b-OX株系的株高均低于野生型。统计成熟期水稻地上各部分的长度,结果显示转基因水稻的第一节间、第二节间和第四节间长度均小于非转基因水稻,而第三节间和第五节间差异不明显。说明OsBBX22b基因过量表达能够抑制第一节间、第二节间和第四节间延伸。 (7)我们发现OsBBX22b基因过表达延迟水稻开花时间。在自然长日条件和温室短日条件下,OsBBX22b-OX株系均比WT的开花时间延迟。QRT-PCR分析OsBBX22b过量表达不影响生物钟核心组分基因的表达,据此推测OsBBX22b基因可能是在生物钟的输出途径上发挥作用。通过比较水稻两种成花素Hd3a和RFT1及其上游基因(Hd1和Ehd1)在转基因株系和WT中的转录水平,我们发现OsBBX22b过量表达抑制开花素Hd3a和RFT1的表达而对开花素上游基因Hd1和Ehd1的表达无影响。据此推测,OsBBX22b通过不同于Hd1和RFT1的途径调控水稻的光周期开花。 (8)我们分析了OsBBX22b-OX株系在水稻生长发育不同时期的特征,结果显示,OsBBX22b过量表达导致水稻叶长和穗长抑制、叶面积减少、单株粒数和小花数减少、穗重降低、种子千粒重增加,而OsBBX22b过量表达对幼苗期的叶角大小和叶绿素的积累无影响。 (9)通过比较野生型和OsBBX22b过表达转基因(OsBBX22b-OX)株系的基因表达图谱,我们发现OsBBX22b上调185个基因的表达,下调116个基因的表达,其中在OsBBX22b上调的基因,至少有22个具有转录激活活性。QRT-PCR结果证明,OsBBX22b基因过表达能够上调OsbHLH148和OsJAZ1、OsJAZ3、OsJAZ7、OsJAZ11、OsJAZ13基因的表达,据此推测OsBBX22b基因可能参与水稻的JA信号途径。 通过上述分析我们初步揭示了OsBBX22b基因在水稻生长发育中的作用。

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第一部分 文献综述

1 B-box锌指蛋白

2 光敏色素

3本论文的研究意义

第二部分 实验论文第一章 OsBBX22b基因的生物信息学分析

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第二章OsBBX22b基因的表达模式分析

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第三章 OsBBX22b在水稻生长发育中的作用

1 实验材料和方法

2实验结果

3.讨论

第三部分 总 结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文及申请专利

附录

附录一：实验所用培养基的制配

附录二：水稻总RNA的提取和纯化、半定量RT-PCR和荧光定量QRT-PCR

1.水稻总RNA的提取和纯化

2．半定量RT-PCR

3. 荧光定量QRT-PCR

附录三：论文的相关引物