公开/公告号CN104330577A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-02-04
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申请/专利权人 南方医科大学南方医院;广州华亘朗博药业有限公司;
申请/专利号CN201410652743.7
申请日2014-11-17
分类号G01N33/68;G01N33/577;
代理机构广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙);
代理人汤喜友
地址 510000 广东省广州市广州大道北1838号
入库时间 2023-12-17 03:18:42
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-05-18
授权
授权
2015-03-11
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/68 申请日:20141117
实质审查的生效
2015-02-04
公开
公开
技术领域
本发明涉及医疗器械生物类免疫体外诊断领域,具体涉及一种基 于磁微粒分离化学发光法定量检测血液中C反应蛋白的试剂盒及其 制备方法,以及应用该试剂盒定量检测血液中C反应蛋白的方法。
背景技术
血清CRP水平是指示细菌感染的一项敏感而客观的指标。细菌 感染时,血清CRP的水平可以中度或明显升高,阳性率可达90%以 上;而病毒等感染时CRP水平多正常或轻度升高,因此可以帮助细 菌感染与非细菌感染的鉴别诊断。此外,定量测定脑脊液、胸腔积液 中的CRP水平亦可以对脑膜炎、胸膜炎的鉴别诊断有一定意义;不 仅如此,CRP水平还与感染范围和感染严重程度有一定关系。另外, 血清CRP水平还可以用来预测感染性疾病的严重程度、住院时间的 长短、预后及复发。CRP还可以反映动脉粥样硬化斑块的成分并预测 斑块破裂的可能性,是心血管疾病的独立预测因子。冠心病、急性冠 脉综合征患者CRP往往明显升高,如心肌梗死患者中血清CRP可以 急剧上升,其升高水平与冠状动脉梗阻程度、冠心病终末事件的发生 及预后、充血性心力衰竭的程度等均有显著相关性。目前,CRP已经 成为健康人及冠脉疾病患者心血管疾病风险的预测因子之一,也是监 测疾病治疗效果的指标之一。
在国内,C反应蛋白(CRP)检测临床上主要以国外进口试剂和 免疫组化试剂应用为主,国外进口试剂价格非常昂贵,给患者带来很 大的经济负担,不利于在基层普及。具有自主知识产权的国产C反 应蛋白(CRP)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少,也仅停留在96 孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差, 也不利于高通量的全自动检测。
因此,有待开发对C反应蛋白(CRP)检测灵敏度高与可靠性并 能降低检测成本的检测技术。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的旨在提供一种C反应蛋白定 量测定试剂盒,该试剂盒能够有效提高检测灵敏度及可靠性,并降低 成本,延长有效期。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到:
一种C反应蛋白定量测定试剂盒,其包括校准品、质控品、抗 试剂、磁微粒试剂和发光底物;该试剂盒包括校准品、质控品、抗试 剂、磁微粒试剂和发光底物;所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素 抗体与羧基磁珠偶联制成,所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物 缓冲液中制成。
另一方面,本发明还提供了这种C反应蛋白定量测定试剂盒的 制备方法,包括以下步骤:
分别配制C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微 粒试剂、发光底物;将C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试 剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内,得到C反应蛋 白的定量测定试剂盒。
本试剂盒的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体为能与 人体内C反应蛋白抗原特异结合的单克隆抗体,所述碱性磷酸酶标 记的C反应蛋白标记抗体为能与C反应蛋白抗原特异结合的单克隆 抗体。包被抗体和标记抗体除能与C反应蛋白抗原特异性结合外, 配对使用时可与抗原形成“三明治”夹心结构。
具体地,所述C反应蛋白定量测定试剂盒按照如下方法制备而 成:
A、C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品的配制方法如下:
用标准品缓冲液溶解C反应蛋白,配置C反应蛋白校准品、C 反应蛋白质控品;其中,所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清 中加入0.01g~0.05g的四环素和0.1g~0.5g的硫酸新霉素,完全溶解后 经过0.22μm滤膜处理制备而成;
B、抗试剂的制备方法如下:
1)抗试剂缓冲液的制备:
将12.12mg~60.57mg的Tris、0.01g~0.05g的四环素、1g~5g的 绵羊血清、3g~10g的新生牛血清、1g~5g的马血清加入1L纯化水中, 充分搅拌至完全溶解,制得抗试剂缓冲液;
2)异硫氰酸荧光素与C反应蛋白偶联,获得异硫氰酸荧光素标 记的C反应蛋白包被抗体:
首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为 1.0~5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液,使用分光光度计在495nm处 读取吸光值,来调整浓度,然后按照C反应蛋白抗体与异硫氰酸荧 光素的质量之比为1:1.1,将二者同时转移到棕色玻璃瓶中,室温下 搅拌1~2小时,充分反应后使用pH为8~9的碳酸氢盐缓冲液进行平 衡,然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的C反应 蛋白包被抗体;紫外监测,记录仪记录纯化图谱,同时注意确认含有 连接物的试管,注意、避光防护;
3)碱性磷酸酶与C反应蛋白抗体偶联,获得碱性磷酸酶标记的 C反应蛋白标记抗体:
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0~5.0mg/mL 的碱性磷酸酶溶液,可以根据分光光度计在280nm处读取吸光值, 将碱性磷酸酶的吸光值应该在一定的范围内。然后按照碱性磷酸酶与 C反应蛋白的摩尔比为1:2~1:10的量将二者转移至棕色瓶中,室温下 搅拌4~5小时,充分反应后使用pH为8~9的碳酸氢盐缓冲液平衡, 然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标 记抗体;注意含有连接物的试管的避光防护。
4)将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被 抗体和和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体, 加入含有表面活性剂的Tris盐缓冲液,充分搅拌后获得所述抗试剂; 所述表面活性剂为Tween 20、Triton X-100、Bronidox中的一种或多 种,表面活性剂的添加量为0.01%~0.5%。
C、磁微粒试剂的制备:
将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂。
1)取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中,将 该反应瓶在磁场中放置15min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清,向 反应瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积2~5倍的磁微粒缓冲液, 混匀20-30min;再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清;重复清 洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL,混匀待 用;所述磁微粒缓冲液的配置方法是将12.12mg的Tris,5.82mg的 氯化钠,50g的甲基纤维醚加入到1L纯化水中,充分搅拌至完全溶 解即得;该磁珠缓冲液含多种去垢剂,能够有效地清除非特异性吸附, 提高检测特异性;
2)连接反应:按照质量比羧基磁珠溶液:抗异硫氰酸荧光素抗 体=100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸 荧光素抗体,在2~8℃内保持混匀状态反应18小时;
3)反应瓶在磁场中放置15min,待羧基磁珠沉降后用磷酸缓冲 液清洗3遍,然后定容至10mg/mL,2~8℃保存,制得所需磁微粒试 剂。
D、发光底物的制备:将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制备发 光底物;
用相当于ALPS体积4~10倍的发光底物缓冲液充分溶解ALPS, 所述发光底物缓冲液的配置方法是将12.12g~121.14g的Tris、5.82g 的氯化钠、0.03g的光泽精加入到1L纯化水中,充分搅拌至完全溶解, 用盐酸调节pH至9.5即得。
进一步的,本发明的C反应蛋白定量测定试剂盒,该试剂盒还 包括清洗液,该清洗液主要用于在检测过程中清洗与磁微粒试剂反应 后的样品,清洗液的具体组分可以参照所属领域的常规操作进行。通 常是磷酸二氢钠、氯化纳、Tween20和ProcLin300的混合溶液,在 试剂盒制品中可以浓缩清洗液的形式存在,检测时适当稀释后使用。 优选的清洗液的配置方法是将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠、50mL 的Tween-20、50mL的曲拉通-100,加入1L纯化水中,充分搅拌至 完全溶解。
再一方面,本发明还提供了利用这种C反应蛋白定量测定试剂 盒检测C反应蛋白的方法,该方法包括步骤:
1)取三支试管分别加15μL C反应蛋白的校准品、15μL C反应 蛋白的质控品、15μL待测样本;
2)每支试管中加入60μL抗试剂,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振 荡试管30s,置37℃下水浴5min;
3)每支试管中加入30μL磁微粒试剂,用塑料薄膜覆盖试管,轻 轻振荡试管30s,置37℃下水浴5min;
4)将三支试管在磁分离器上沉淀2min,缓慢地倒转试管和磁分 离器,倒出上清液,把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上,用 力拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
5)每支试管中加入300μL清洗液,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻 振荡试管30s,混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器,倒出上清液,把 倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除 去粘在管壁上的所有液滴;
6)重复步骤5)一次;
7)每支试管中加入200μL发光底物溶液,振荡混匀3s,用化学 发光仪检测发光强度。
本发明的试剂盒中未详细提及的试剂组分(例如清洗液、一些必 要的缓冲液等)、试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等 均可以按照所属领域的常规操作进行,符合相关行业规定即可。本发 明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进 行,例如在检测前可将各试剂放至室温(18~25℃),加样前充分混匀; 所用检测仪器设备例如化学发光类测定仪的使用按照说明书操作进 行;本发明中,未特别注明单位的比例与含量,固体组分为质量比例 与含量,液体组分为体积比例与含量。
本发明的有益效果在于:
1、本发明以碱性磷酸酶为标记酶,通过化学反应标记抗体,并 使用凝胶层析分离纯化,提高了反应的灵敏度;
2、本发明以抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒 试剂,使免疫反应更容易混匀和分离,而且大大提高了反应速度;
3、本发明以ALPS(N-乙基-N-(3-丙磺基)苯胺钠盐)为底物, 该底物是辉光性底物,灵敏度高,可以快速达到平台期,平台稳定期 长且信号较强,有利于信号的检测,提高了最终试剂盒的灵敏度和特 异性性能;并进一步优化了化学发光增强体系,保证了终产品的信号 灵敏度高和稳定性好、变异小;
4、本试剂盒稳定性良好,有效期可至一年以上;
5、本试剂盒在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达 95%以上,且费用仅为其1/5,使用成本低。
附图说明
图1是C反应蛋白的标准曲线;
图2是C反应蛋白定量测定试剂盒与进口检测试剂的检测效果 相关性曲线。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明做具体说明。
实施例1:各种缓冲液的配置,具体如下:
1、Tris盐缓冲液
将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠,加入1L纯化水中,充分搅 拌至完全溶解,用盐酸调整最终pH为7.5。
2、校准品缓冲液的制备
在1L新生牛血清中加入0.01g四环素和0.1g硫酸新霉素,充分 溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成。
3、抗试剂缓冲液
将30.5mg的Tris、0.03g的四环素、3g的绵羊血清、8g的新生 牛血清、3g的马血清加入1L纯化水中,充分搅拌至完全溶解即得;
4、磁微粒缓冲液
将12.12mg的Tris、5.82mg的氯化钠、50g的甲基纤维醚加入 1L纯化水中,充分搅拌至完全溶解即得。
5、发光底物缓冲液
将50.21g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入1L纯化 水中,充分搅拌至完全溶解,用盐酸调节缓冲液的pH至9.5即得;
6、清洗液浓缩液的配置
将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠、50mL的Tween-20、50mL 的曲拉通-100加入1L纯化水中,充分搅拌至完全溶解即得。
实施例2:C反应蛋白定量测定试剂盒的制备
1、校准品和质控品的制备
首先用标准品缓冲液溶解C反应蛋白,配置成如表1所示的目 标浓度的校准品和质控品;本实施例所用的C反应蛋白采购自生产 厂家fitzgerald公司。
表1 校准品和质控品的制备
2、抗试剂的制备方法如下:
1)异硫氰酸荧光素与C反应蛋白抗体偶联,获得异硫氰酸荧光 素标记的C反应蛋白包被抗体:
首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为2.5mg/mL 的异硫氰酸荧光素溶液,然后按照质量比为C反应蛋白:异硫氰酸 荧光素溶液=1:1.1将二者转移到棕色玻璃瓶里,室温下搅拌1~2小时; 充分反应后使用pH为8~9的碳酸氢盐缓冲液平衡,然后使用凝胶层 析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体;
2)碱性磷酸酶与C反应蛋白抗体偶联,获得碱性磷酸酶标记的 C反应蛋白标记抗体:
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为2.5mg/mL的碱 性磷酸酶溶液,按照摩尔比为碱性磷酸酶:C反应蛋白=1:2的二者转 移至棕色玻璃瓶中,室温下搅拌4~5小时,充分反应后使用pH为8~9 的碳酸氢盐缓冲液平衡,然后使用凝胶层析分离纯化得到碱性磷酸酶 标记的C反应蛋白标记抗体;紫外监测,记录仪记录纯化图谱,注 意、避光防护;
3)将步骤1)中获得的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被 抗体和和步骤2)中获得的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体加 入含有0.1%Tween 20的Tris盐缓冲液中,充分搅拌后获得所述抗试 剂;
3、磁微粒试剂的制备:将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基偶联制 得磁微粒试剂;
1)取10mL的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中,将该 反应瓶在磁场放置15min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清,向反应 瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积5倍的磁微粒缓冲液,震荡清 洗20~30min;再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复清洗 羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL,混匀待用;
2)连接反应:按照质量比羧基磁珠溶液:抗异硫氰酸荧光素抗 体=100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸 荧光素抗体,在2~8℃内保持混匀状态反应18小时;
3)反应瓶在磁场中放置15min,待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓 冲液清洗3遍,随后定容至10mg/mL,2~8℃保存,制得所需待用磁 微粒试剂。
4、发光底物的制备:
用相当于ALPS体积7倍的发光底物缓冲液充分溶解ALPS。
5、将C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒 试剂、发光底物独立地置于包装容器内,得到C反应蛋白的定量测 定试剂盒。
实施例3:利用实施例2所述的C反应蛋白定量测定试剂盒检测 C反应蛋白的方法,该方法包括步骤:
1)取三支试管分别加15μL C反应蛋白的校准品、15μLC反应 蛋白的质控品、15μL待测样本;
2)每支试管中加入60μL抗试剂,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振 荡试管30s,置37℃下水浴5min;
3)每支试管中加入30μL磁微粒试剂,用塑料薄膜覆盖试管,轻 轻振荡试管30s,置37℃下水浴5min;
4)将试管在磁分离器上沉淀2min,缓慢地倒转试管和磁分离器, 倒出上清液,把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上,用力拍击 磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
5)每支试管中加入300μL清洗液,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻 振荡试管30s,混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器,倒出上清液,把 倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去 粘在管壁上的所有液滴;
6)重复步骤5)一次;
7)每支试管中加入200μL发光底物溶液,振荡混匀3s,用化学 发光仪检测发光强度;
8)数据的处理:
通过四参数非线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线 的四参数Logistic方程:Y=350.4984+(4283133.6431-350.4984)/(1+ (X/68.2067)^-1.3246(R=0.999025),标准曲线如图1所示,其 中,横轴代表校准品的浓度值,纵轴代表发光值。
临床数据:
1、为了评价本发明的C反应蛋白定量测定试剂盒的稳定性和准 确性,每隔2个月对本实施例的试剂盒性能进行测定。
测试结果如表2所示。由表2可以看出:C反应蛋白与发光值的 相关性连续15个月保持在0.99以上,本发明的试剂盒的最低检测限 和准确度的相对偏差以及每批次的质控品的变异系数也符合国家标 准。表2的数据表明本发明的C反应蛋白定量测定试剂盒的有较好 的稳定性和准确性。
表2 C反应蛋白定量测定试剂盒分析性能和稳定性表
2、C反应蛋白定量测定试剂盒与进口检测试剂检测效果的比较
选取240份标本,将标本中的低中高值分离后,对低中高值样本 进行单独的线性回归分析,得到了线性回归方程y=0.969X-0.732, R2=0.964。该回归曲线方程如图2所示,其中,横轴代表对照测值, 纵轴代表参考测值。图2表明,本发明的试剂盒性能可靠,灵敏度高, 线性范围宽,可配合全自动仪器使用。
3、采用本实施例的C反应蛋白定量测定试剂盒,对120份正常 人样本进行检验;用SPSS 19.0 for windows软件对正常人样本的测定 结果进行正态性检验,数据整体分布基本属于非正态分布。
表3 C反应蛋白定量测定试剂盒正态性检验表
4、C反应蛋白定量测定试剂盒临床参考值范围;以正常人样本 检测值的双侧95百分位数作为参考值。
表4 C反应蛋白定量测定试剂盒临床参考值范围表
可以看出,本发明的试剂盒性能可靠,灵敏度高,线性范围宽, 可配合全自动仪器使用。
上述实施例仅为本发明优选的实施案例,不能以此来限定本发明 所要求保护的范围,本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何 非实质性的及替换均属于本发明要求保护的范围。
机译: L-岩藻糖-脱氢酶,其制备方法,使用所述酶定量测定l-岩藻糖,以及用于定量测定的试剂盒
机译: L-岩藻糖-脱氢酶,其制备方法,使用所述酶定量测定l-岩藻糖,以及用于定量测定的试剂盒
机译: 低密度脂蛋白中胆固醇的定量测定方法,定量测定试剂盒和定量试剂盒