一种开发小麦亲缘物种特异分子标记的方法及应用

摘要

本发明属于作物遗传育种与农业生物技术领域，提供一种用于开发小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记的标记引物和方法，及该标记引物和方法的应用。本发明共提供了157对引物对，经过引物对扩增后的百萨偃麦草特异片段，全部定位于百萨偃麦草染色体上，说明该引物对的特异性；同时，通过本发明提供的百萨偃麦草特异分子标记的开发方法获得的特异扩增片段在百萨偃麦草中的多态率高达40.2％，说明本方法的可行性。本发明通过157对引物获得182个定位于百萨偃麦草染色体的分子标记，数量大，为从中发掘百萨偃麦草有益性状基因进而将有利基因通过分子标记辅助选择转移到栽培小麦中提供了便利。

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种与农业生物技术领域，涉及一种用于开发小麦亲缘物种百萨偃麦草特异 分子标记的标记引物和方法，及该标记引物和方法的应用。

背景技术

小麦亲缘物种中蕴含丰富的有利基因，是小麦遗传改良的重要基因资源。远缘杂交和染色体工程 技术是转移和利用小麦亲缘物种有利基因的主要途径。小麦亲缘物种特异分子标记的开发有助于加快 外源染色体中的有益基因向小麦转移和利用。

基于PCR(polymerase chain reaction)的分子标记具有简单、有效和经济的特点，在分子标记辅 助选择中得到广泛应用。目前，小麦亲缘物种基于PCR的染色体特异分子标记的开发主要通过三个 途径，一是利用小麦中已经开发的标记直接在亲缘物中通过扩增筛选，获得小麦亲缘物种特异标记(见 参考文献：陈华锋,钱保俐,庄丽芳,陈全战,冯祎高,裴自友,亓增军,陈佩度,刘大钧.普通小麦中 国春-百萨偃麦草异染色体系的分子标记分析.作物学报,2007,33:1232-1239；Zhang J-Y,Li X-M, Wang Richard R.-C.,Cortes A.,Rosas V.and A.Mujeebi-Kazi.Molecular cytogenetic characterization of  Eb-genome chromosomes in Thinopyrum bessarabicum disomic addition lines of bread wheat.Plant Sci, 2002,163(1):167-174)；二是利用已经公开发表的小麦EST(expressed sequence tag)序列，通过比对分 析，然后根据保守性区段设计引物扩增可变区开发的物种特异标记(Daniel J.Mullan,Amanda Platteter, Natasha L.Teakle,Rudi Appels,Timothy D.Colmer,Joseph M.Anderson,and Michael G.Francki, EST-derived SSR markers from defined regions of the wheat genome to identify Lophopyrum elongatum  specific loci.Genome,2005,48:811-822)；三是基于基因组测序为基础开发的物种特异标记(见参考文 献：陈士强,秦树文,黄泽峰,戴毅,张璐璐,高营营,高勇,陈建民.基于SLAF-seq技术开发长穗偃 麦草染色体特异分子标记.作物学报,2013,39(4):727-734)。

随着高通量测序技术的发展，通过转录组测序可以迅速获得小麦亲缘物种大量的基因EST序列， 同时随着越来越多的小麦基因组序列数据的公布，通过比对分析可以从小麦亲缘物种的转录组序列中 筛选获得这些物种特异的EST序列，从而为设计该物种特异分子标记提供了可能。但是，经过检索， 并没有发现通过高通量测序对小麦亲缘物种百萨偃麦草的特异分子标记进行筛选研究。而百萨偃麦草 由于具有强耐盐、磷高效、抗病、分蘖强等多种优良性状，如果能利用其基因进行小麦改良，对拓展 栽培小麦遗传基础、培育高产耐逆品种具有重要的应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于公开一种开发小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记的标记引物和方法，为接 下来其他小麦亲缘物种特异分子标记的开发提供指导。

同时，通过本发明提供的标记引物和方法获得百萨偃麦草特异分子标记，为将百萨偃麦草的优良 基因向小麦转移提供便利。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种用于开发小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记的标记引物，其序列如下所示：

1)lfz1725：上游引物TGGCTTTGTCATTGCCAGT；下游GCCATAACGGAGATCTGGAG；

2)lfz1728：上游引物CGCAGTCAAATCAAATGGAA；下游引物CTCCAGCTCGACGGAAGC；

3)lfz1730：上游引物TTGAACCCCGACTTTTTCAG；下游引物ATGTACCTCACCTCCCATGC；

4)lfz1731：上游引物CGCGATGAATAGTTTGAGCA；下游引物GACAGCGAATTTGGAGAAGC；

5)lfz1743：上游引物GATGTGTTTGTGCAGGTTGG；下游引物TGGGTTCAGGGAAGGATATG；

6)lfz1745：上游引物GTCAGCACGACCACCTGTT；下游引物CCGGCGTCAGATGATAGAG；

7)lfz1747：上游引物GAGAGGCTTGAGCCAATCAG；下游引物AATTCTGTCCTGGGCAACAC；

8)lfz1751：上游引物ATGCATATGCGTCCAACTGA；下游引物ACAAGACCGAGGCTGAGATG；

9)lfz1754：上游引物GAGAAGGGGCAAAATGGAAT；下游引物CTAATGGCATGGTGGTGTTG；

10)lfz1755：上游引物ACACCCCAGCTGCAACTAAC；下游引物GTGAGGAGAAGGAGCAAGCA；

11)lfz1756：上游引物ATGAGCACGTGAGACTGTGG；下游引物CAGGCCTCTTTGCCTCATAG；

12)lfz1757：上游引物TCACAGGAAACACCATCAGG；下游引物TTGAGTGGGTACACGATTGC；

13)lfz1758：上游引物GATTGAGGGAACGAGCAAGA；下游引物TGATCGATCTGACCACCAAA；

14)lfz1759：上游引物AGTTGGCTTGGGTCAGATTG；下游引物TGTAGGAGGCTCGCTCAAAT；

15)lfz1762：上游引物GGCCTTGTGGTAACTCCAAA；下游引物AAGCTGCCTGACGACATTCT；

16)lfz1763：上游引物TTTCACCGTTTGCATTAGCA；下游引物GAAGTGGCTTTTCCATCCAA；

17)lfz1767：上游引物ACTGGCTAGCACACCGACTT；下游引物CTGTGTGCTGGTTGCCTCTA；

18)lfz1781：上游引物CACGTTCCATGATGTTGGTC；下游引物CCACGATCATATGCCTCCTT；

19)lfz1783：上游引物CATGGAAGGCTTGAAATGGT；下游引物CCGGGTGAGTTGAGTTTGAT；

20)lfz1784：上游引物GATGCCCCTAACAAGACGAA；下游引物ATGTCGGAGATCAGGTGGAC；

21)lfz1790：上游引物GGATCAAGGAAGAAAGGTTGC；下游引物CTCCAACACGATGGAGGTCT；

22)lfz1793：上游引物GCCACCAGAAGGATCTTGAC；下游引物CATAGCCCCTTAGCTCGTTG；

23)lfz1797：上游引物TACGACTGAAGCAAGCATCG；下游引物AGGGAAACCTCCACACTTCC；

24)lfz1799：上游引物CCCAAATTCCCCATTTCTCT；下游引物GGAGATGGGAGTGACCTCAA；

25)lfz1804：上游引物CACGCAATTCATCGAACACT；下游引物GTATCCATAGCTGCGCCAAT；

26)lfz1806：上游引物TCATCCACAAAATGGCAAAA；下游引物TTCCTCAAGTCCCACCAAAG；

27)lfz1808：上游引物ATTGAACCGGTGAGAGATCG；下游引物CGATCTGCGTCTTCCCTCTA；

28)lfz1809：上游引物CCACGATGGGATCAGTTACC；下游引物GCTACTTGCGTGCAACACAT；

29)lfz1810：上游引物ATCGCCAGCCTCTTGAGTT；下游引物CGACACAGCAGACCATCAGT；

30)lfz1816：上游引物CGGAAGGTTGCTGATGAGAT；下游引物GGCACCCACAGTCAAAAAGA；

31)lfz1817：上游引物ATGACACTCACCTGCCTTCC；下游引物TTCTGGCAAACCACGTCATA；

32)lfz1820：上游引物CTTCATGGCACGTACGGTTA；下游引物ATTCCACGCATCTTGAACCT；

33)lfz1821：上游引物ATGAACGGGAAGTGTCGAAG；下游引物GAGGACGGTTGTAGCAAGGA；

34)lfz1822：上游引物GCATCTCTGGCCTTGTCTTC；下游引物GACGGCACACTCCTCCTAGA；

35)lfz1826：上游引物AGAGTGACACCGTCCGTGA；下游引物CTCCAGTCTCCCGACCTTAG；

36)lfz1829：上游引物GGTGGGTATACAGCGGAGAA；下游引物GTGCTACACCGAGCCATTTT；

37)lfz1836：上游引物GATATCTGCCGGTGACGAAC；下游引物CAGAGAAACACAGCAAAGCTGA；

38)lfz1838：上游引物CCTGAACAAGAACCCTCCAA；下游引物AATAATACCCCCGGCTTCAG；

39)lfz1841：上游引物TCCTTTCTCACTGCCCATTC；下游引物TCATGAGTGCGGTTCATCTC；

40)lfz1850：上游引物TTTTTCCCTTGTGGCTTTTG；下游引物GATGCCTACCTCCCAGACAA；

41)lfz1852：上游引物CAAATCCCAAGGCAGTCCTA；下游引物CTTGCCACCAATCACCTCTT；

42)lfz1853：上游引物CTCGCAGAGAAGGTGGAGAC；下游引物CACCTTCGAATCCCTTGAAA；

43)lfz1857：上游引物AGTCGCCGGTACGATGTAGT；下游引物ACGCTTCCTCCAGAGAGAGA；

44)lfz1859：上游引物TGCCGAAGACTGAGCACTAA；下游引物TCGCCTTCTACAGTCCAGGT；

45)lfz1866：上游引物TTGAGGCTCTCCCGTAAGAA；下游引物GCCCCCAGAAAGAAAGAAAA；

46)lfz1876：上游引物CTGCGGTATAGGGTGACACA；下游引物GCTACTTGTTGGGCCTGAAG；

47)lfz1877：上游引物TGGACAGCCTGAACATGAAG；下游引物CGCAGATGAAGATGCCCTAC；

48)lfz1879：上游引物AAGAGGAGGAGCCCAGGTAG；下游引物CACGGATTCGAACTCCACTT；

49)lfz1880：上游引物GCCTGGATGAAATGGAGAAA；下游引物TAGCACTGTCCAGCGATTTG；

50)lfz1882：上游引物CAGGGACTTTCCTTCGATCA；下游引物GCACTGCCTTTCTCAAGGTC；

51)lfz1883：上游引物GGTTGATGGGAGATGCAGAA；下游引物GGCCGACAGTATAGCTCCTG；

52)lfz1884：上游引物GACAGTGACCTCGATGAGCA；下游引物AAACCATGTTTGTCGGCATT；

53)lfz1886：上游引物TGAAAGTTGTAGCGCCAGTG；下游引物ACCAGAGTCGTCATCCATCC；

54)lfz1899：上游引物GCTAGGTTATGCCGAAGACG；下游引物CCTCCATCTCCCATGGAGTC；

55)lfz1900：上游引物GCCAAGCACATCACTCTGAA；下游引物GCGACTACATGTACCGCAAA；

56)lfz1901：上游引物CATTGTCCATCCAATGAGGA；下游引物GCGACTACATGTACCGCAAA；

57)lfz1906：上游引物CCACTGCATCCATCTTCCTT；下游引物GCCTTCTCTTCCATGCTTCTT；

58)lfz1907：上游引物GTCCTCGATGCAGAGGAATC；下游引物TTTGCTTCACCTCCTCGTCT；

59)lfz1908：上游引物GCTGGCTTGGAGCTATGTTC；下游引物TACCATCAGCCTTGGTCCTC；

60)lfz1913：上游引物TCAAGTGCAGACTTGCGAAC；下游引物AAAATGGAACTGGGGGAAAC；

61)lfz1914：上游引物AAGCGTACCTTCTGCAAGGA；下游引物TTTTTCGTGGCAAAGATGATT；

62)lfz1917：上游引物CTCCAGCAGGTTCTCGATGT；下游引物TGTTTATCCCCTGGTTCTGG；

63)lfz1920：上游引物CGACAAATGCCAGAGAGTGA；下游引物ACTGCTACGTCGCTGACCTC；

64)lfz1922：上游引物TCCTTGCAGACAAGCTGGAT；下游引物CTTTGGTGTCCCCGAAATC；

65)lfz1923：上游引物ATGGAAGACCGTTGAGGTTG；下游引物CTCCAACCACCTTCTTGCAC；

66)lfz1924：上游引物CACCGTTCTTTGGCTATGGT；下游引物CTGATTTCTGGGTTGCTGCT；

67)lfz1934：上游引物TTGCAGTACCATCGCAAAAG；下游引物GCAGCCAGATGTCTGTCCAT；

68)lfz1936：上游引物ACCGCAGAATCAACAGGAGT；下游引物GCCCTCCCTTGCTTTACTTT；

69)lfz2213：上游引物AATAACAAACGGCAGGAACG；下游引物AGCCACGATCAACGATAAGG；

70)lfz2214：上游引物CTCGCTAGTCGGGAAGGAG；下游引物CGGACATGGACAGAGATGGT；

71)lfz2215：上游引物CTCAGACGGGAGGAAGACAG；下游引物ATCGAGTACTTCCCGCTCCT；

72)lfz2220：上游引物GCAGCATTCAGCAAAAATCA；下游引物ATTGGGGAGGTAGGATGAGG；

73)lfz2221：上游引物GGGATGGTTGCTTGTGAAAC；下游引物TCAATTTCATTGCCCAGACA；

74)lfz2222：上游引物GGCCACGCCTCTGAGTTAC；下游引物AGAGGCCTAGGTGGCTCATT；

75)lfz2225：上游引物TTGAGTGAGCATCGATGGAG；下游引物CCTGAAATCGCAGCACTGTA；

76)lfz2226：上游引物ACTGGAACGATGAGGACTGC；下游引物TGTCACAACCATCATGAGCA；

77)lfz2228：上游引物CGTCATCACTGCGAGAAGAA；下游引物GCACGTCCACATACATTTGC；

78)lfz2229：上游引物CTCCGACCTTGACTCCTCTG；下游引物TGTCTACCGAGTTGCTCACG；

79)lfz2232：上游引物ACTTACACATGGGGCACACA；下游引物AATGAGGAAGGCATCCATTG；

80)lfz2233：上游引物TCCCAAGGTGACCATTTTGT；下游引物GAAACGGTTGCTGTGAAGGT；

81)lfz2235：上游引物GAGCTCACCGAGTGGTTCTG；下游引物TTGTGGTGGAGGTACACGAA；

82)lfz2237：上游引GACCGAACGATTTGATCCAC；下游引物CGAAAATAAAACCGCAGGAG；

83)lfz2240：上游引物CACGCCCAGACTCAGATACA；下游引物AAGGAATGATCCTCGACCAA；

84)lfz2241：上游引物GGATTGACAAGAGGCAGGAA；下游引物GAAACAGGGGAAGGAAGGAG；

85)lfz2244：上游引物CAAAATCCTGCAACCCTGAT；下游引物CTCTTCATAGGCCGCTTCAG；

86)lfz2247：上游引物GGGATCTGATTTTCGAGTGC；下游引物GACGAAAGGAAAACGGAACA；

87)lfz2249：上游引物ACATTGGAGGAACCCATCCT；下游引物GCAGCCGCCAAATTAGAT；

88)lfz2254：上游引物GGCCGTGAAGTAATGATGGT；下游引物TTAGCAGATTTGCCCACCTC；

89)lfz2256：上游引物GGCTTTGTGAACCGATTGAG；下游引物GAGGGCTTTATGCTCGTCTG；

90)lfz2257：上游引物GGCTTTGTGAACCGATTGAG；下游引物GAGGGCTTTATGCTCGTCTG；

91)lfz2258：上游引物TCCCAACAGCTGCCTTAGTC；下游引物CTTTCTCTCCCCGTCTCCTT；

92)lfz2263：上游引物GCAAGATCCCCCATCAGTTA；下游引物CAGCCACTCCATTACCCAGT；

93)lfz2264：上游引物ACCCGAAAATAGGGGAGAAA；下游引物CCCTGAATTCACTCCTCTGC；

94)lfz2267：上游引物CATCCAGATCTCCGGCTAGA；下游引物ATTTTCGCACACACTCCACA；

95)lfz2268：上游引物ACGTCTGGCGAACAATTACC；下游引物AGGGCACTGCGTAGATGAAG；

96)lfz2274：上游引物TGGAGGAGGTAGTGGATTCG；下游引物ATGGAGGAAGGACGTGTGAG；

97)lfz2281：上游引物GCAGTGGAAGATGAGGTGGT；下游引物GCGTGTGTGCTTCTTCATGT；

98)lfz2282：上游引物TTTGGGGGATTCGTCCTAGT；下游引物CGTAGCCGGAAGACAGACTC；

99)lfz2283：上游引物GGGGATAAGCAGCAGAGACA；下游引物TACGAGGCTGGGTCCTCTAA；

100)lfz2287：上游引物CTTCTCCCCCTTGAGAGTCC；下游引物ACGACAGGGAGGAATGAATG；

101)lfz2296：上游引物GAAGCTGCGGCTACTCAATC；下游引物GGTATCAACTGTAACTCTT；

102)lfz2304：上游引物AAGCCTTATGGGAGGCAGTT；下游引物GAACCCCAAGGATCCTGAAT；

103)lfz2306：上游引物CCTTATCCAATCCCGTCTCA；下游引物CCGCACTTGACTGCTACAGA；

104)lfz2308：上游引物TCACACGAACCAACGAGAAC；下游引物TACTGGAACATGGGCCTAGC；

105)lfz2310：上游引物CTTGCTTCTCCCACTTGCTC；下游引物TTTGATGGGCTTTGGTTAGG；

106)lfz2314：上游引物GGCTGTCGTACTGGACGAAT；下游引物CCAGTGGCATCAGTCCATC；

107)lfz2318：上游引物GGGTTGCTGAGTCCACTGAT；下游引物CTCGGGGATCATTCAAGAAA；

108)lfz2322：上游引物TCATGGCTCACATGGCTATC；下游引物ACAATTGGGACCATCCAAAA；

109)lfz2325：上游引物TCGATCACCCACAAGAACAA；下游引物AGAGAGCGGACGTGTTCAGT；

110)lfz2326：上游引物CTGCTGAAACTCCCCAAGAC；下游引物CGGCGTGTACATAGCATAGG；

111)lfz2327：上游引物GTGGCTCGATGACGAATACC；下游引物TGCTGTGTTCTCCTCCCTTT；

112)lfz2330：上游引物ATCGGAGAGCTTCTGTTCCA；下游引物ATTTGGTGGCCTTCACTGTC；

113)lfz2335：上游引物CTAGTCCCAGCGCCTAACAA；下游引物TAAAATCGGCCTCATCCTTG；

114)lfz2336：上游引物ACACAGTGGGAAGTGGGAAG；下游引物CTCTAGTCGCACGGTCTGGT；

115)lfz2337：上游引物GACGGAAGGTTGGACAAAAA；下游引物TTCCTCCTCCCTTCCACTCT；

116)lfz2339：上游引物GCCTTTGCCTAGCCTAGCTT；下游引物CAGCCACCCTCAGGTGTTAT；

117)lfz2340：上游引物TGTCTCTGGCGAGTTTCTGA；下游引物AGCAATCCAGTCCTCGTCAC；

118)lfz2341：上游引物TTTCCATGTCAAGGTGGTCA；下游引物CACCAACACAACGACACCTC；

119)lfz2342：上游引物GTGGCCCTTTCCTTCTCTCT；下游引物ACCAGAAGGTCCCAGAGGAT；

120)lfz2343：上游引物TCTTCTTCCTCACGCCCTTA；下游引物GCTCGAGTCCGTAGAAGTGG；

121)lfz2344：上游引物GCTTAACGCTTCTGGTCGTC；下游引物GCCGCTAGTGTAGCAGGTCT；

122)lfz2345：上游引物GCGAATCGTTACACGGAAAT；下游引物TCGGTGAGGTGAAAGGTCTC；

123)lfz2346：上游引物CAGACTCAGCAGACCAACCA；下游引物CATCTCCACCCAATGGTTTT；

124)lfz2349：上游引物CCGTGGCAATAAGAGGAAAA；下游引物CTTGATTTCAGCAGGCTTCC；

125)lfz2352：上游引物AGCCAGGAGTTGGTGCTCTA；下游引物ATGCGAACGAGGATCAAAAG；

126)lfz2354：上游引物ACGGACTCTTCTCCCTCCAT；下游引物TAGTGCAGCATCCGTTCTTG；

127)lfz2358：上游引物GCTGCAGCCACCTTATTCTC；下游引物AACCCCGGATCTATGTTTCC；

128)lfz2375：上游引物CCCACACCACTCCTTCAACT；下游引物TTTGACCTCGGTTTGTCCTC；

129)lfz2386：上游引物TGTAGAATCCTTGGGCCATC；下游引物TTGCACTTTCTGTGGCATGT；

130)lfz2393：上游引物AGAAGATTGCTGAGGGCAAA；下游引物CCATTGAGGCGCTGAATTAT；

131)lfz2394：上游引物GACGAGGATTCTGCATGGTT；下游引物CCCTCATCCTTCAAGTCCAA；

132)lfz2395：上游引物AAAAGGCTCCTCACAAGCAA；下游引物CAACGAGCTTGATGCTGAAA；

133)lfz2396：上游引物GACGAAGAAGAGGCAAGGTG；下游引物TCTCCCTCATCTCGGTTCTC；

134)lfz2403：上游引物TGCAGCTACTGCAATCAAGG；下游引物ATTTTGCTGTGGGCTGTAGG；

135)lfz2405：上游引物TGTAGAAGCAGGGGGAGTTG；下游引物CCAGCAGTTCATCACCTGAA；

136)lfz2406：上游引物TGGAGACAGTGAGGCTGTTG；下游引物CCTTGCATAGCTCCCTTGAG；

137)lfz2407：上游引物CAGGCTGTATGTGCTTGACC；下游引物GGCGTCGCTAGTGAGATAGG；

138)lfz2408：上游引物AGTCGCCCAATGTATCCAAC；下游引物CGATATCCATTCGGTGCTCT；

139)lfz2416：上游引物ACTCGGAGCAGCGAAAGTAG；下游引物AGGCCTATGCACAGCCATAC；

140)lfz2420：上游引物GTGTGCACAAATGCTCTGCT；下游引物ACGATCAATCCCAGCATCTC；

141)lfz2422：上游引物TTTGAAATGTCCTCGCACAG；下游引物AAGGAACGCATATGGAATCG；

142)lfz2453：上游引物AAAACGAGGCATCACAATCC；下游引物GCTTAGCGAAGAGCTTGCAT；

143)lfz2457：上游引物AGAAGAGTGCGGATGCTGAT；下游引物AATCTGCTCAAGCCCTGAAA；

144)lfz2459：上游引物GGGGCTACAATCACCCAGTA；下游引物GCAGCAAGCAAAAACTTTCC；

145)lfz2463：上游引物ACTTGGATGGCAAATTGGAG；下游引物TTCTCCAGGCGAAGTTGTCT；

146)lfz2466：上游引物GCAGCAAACTGGGTCAAAAT；下游引物TGAGGAAAAACTGGGTCAGG；

147)lfz2467：上游引物CTACATGCTGGTTGGCTGAA；下游引物CACCCTACCTTGCTCGTCTC；

148)lfz2472：上游引物CCCTGTTGCTCAAGATGGAT；下游引物TGGACGAGCAAGACTGACAC；

149)lfz2473：上游引物TGTCGCGTGATGTGGTATTT；下游引物TCATCGCAATTTGACTGAGC；

150)lfz2475：上游引物TGAGGTGGTTGTCGGAGAG；下游引物GTACTTGCTTTCGCCTGGAA；

151)lfz2481：上游引物AACCAGCTTCGCAGGAGAG；下游引物AGTGGTGTCGTGATCGAGGT；

152)lfz2484：上游引物TCAACCTCCTCAGCTTGCTT；下游引物GCGTCCAATCGTGATTTTCT；

153)lfz2486：上游引物GCCCAACATCAATCAGACCT；下游引物TACACTGCCCGTTCGTGATA；

154)lfz2493：上游引物CGAGGAGGAGAGGTTGAGTG；下游引物TCCTCATGGAAGAAGGCAAC；

155)lfz2495：上游引物TCGAACAGGACGAGGAAGTC；下游引物GGACCAGCCACAAGTTCATC；

156)lfz2499：上游引物GGCTTCACGCATGAAATTCT；下游引物AGCTCGGCAGTGTCAACTTT；

157)lfz2501：上游引物ATAAAAAGGCAAGCCCACCT；下游引物CAAGTGGAACAGAGCAAGCA。

2.本发明还提供一种高效开发小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记的方法，包括如下步骤：

(1)以百萨偃麦草为对象，获取总RNA，进行转录组测序，获得EST序列；

(2)将步骤(1)得到的EST序列与小麦D基因组进行blast比对，获得与小麦D基因组没有相似性 的EST序列；

(3)以步骤(2)得到的与小麦D基因组没有相似性的EST序列为基础，设计引物对；

(4)以普通小麦“中国春”、百萨偃麦草、中国春-百萨偃麦草双倍体的全基因组DNA作为模板，经 PCR扩增，最后得到在百萨偃麦草特异性的扩增片段；

(5)以中国春-百萨偃麦草异染色体系的全基因组DNA作为模板，定位步骤(4)获得的百萨偃麦草 的特异性扩增片段，确定扩增片段在百萨偃麦草染色体上的位置，即定位于百萨偃麦草染色体上的特 异性扩增片段为百萨偃麦草特异性分子标记。

3.权利要求2所述的高效开发小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记的方法，其特征在于：步骤(3) 设计的引物对包括上述1提供的引物对。

4.本发明还提供高效开发小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记的方法在开发小麦其他亲缘物种特 异分子标记上的应用。

5.本发明还提供上述1提供的标记引物在小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记开发上的应用。

6.本发明还提供标记引物获得的小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记在小麦新品种选育上的应用。

7.利用上述2或3提供的方法获得的小麦亲缘物种百萨偃麦草特异分子标记在小麦新品种选育上的应 用。

本发明提供的方法，概括性地可以表述如下：

以百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum2n＝2x＝14,JJ)(见参考文献：裴自友,温辉芹,陈 华锋,庄丽芳,亓增军.百萨偃麦草在小麦遗传改良中的应用研究进展.陕西农业科学,2008,54(1): 70-74)为试材，通过转录组测序和拼接，获得了EST序列，这些序列和小麦D基因组(Aegilops tauschii) 基因组序列(Jia J.,Zhao S.,Kong X.,Li Y.,Zhao G.,He W.,R.Appels,M.Pfeifer,Tao Y.,Zhang X.,Jing  R.,Zhang C.,Ma Y.,Gao L.,Gao C.,M.Spannagl,K.F.Mayer,Li D.,Pan S.,Zheng F.,Hu Q.,Xia X.,Li J., Liang Q.,Chen J.,T.Wicker,Gou C.,Kuang H.,He G.,Luo Y.,B.Keller,Xia Q.,Lu P.,Wang J.,Zou H., Zhang R.,Xu J.,Gao J.,C.Middleton,Quan Z.,Liu G.,Yang H.,Liu X.,He Z.,Mao L.,Aegilops tauschii  draft genome sequence reveals a gene repertoire for wheat adaptation.Nature,2013.496(7443):1-5.)进行 BLAST比对(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)，筛选在小麦D基因组中没 有相似性的序列，说明这些序列可能为百萨偃麦草物种特异性的EST序列，然后随机选取部分EST 序列，利用在线软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物507对，分别以普通小麦中国春、 百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双倍体和一套中国春-百萨偃麦草异染色体系(见参考文献：陈华锋, 钱保俐,庄丽芳,陈全战,冯祎高,裴自友,亓增军,陈佩度,刘大钧.普通小麦中国春-百萨偃麦草异 染色体系的分子标记分析.作物学报,2007,33:1232-1239；Shen Yuefeng,Shen Jian,Dawadondup, Zhuang Lifang,Wang Yanzhi,Pu Jing,Feng Yigao,Chu Chenggen,Wang Xiue&Qi Zengjun,Physical  localization of a novel blue grained gene derived from Thinopyrum bessarabicum,Mol Breeding,2013, 31:195-204)的全基因组DNA作为模板，经过PCR扩增分析，最后得到在百萨偃麦草具有特异扩增 片段的引物，并将获得的特异扩增片段定位于百萨偃麦草的不同染色体，即获得百萨偃麦草染色体特 异的分子标记。

有益效果：

1.本发明以普通小麦中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体和一套中国春-百萨偃麦 草异染色体系的全基因组DNA作为模板，获得的在百萨偃麦草的特异扩增片段多态率高达40.2％， 说明本发明提供的方法的可行性。

2.本发明通过157对引物获得182个百萨偃麦草分子标记，分子标记数量大，为从中发掘百萨偃 麦草有益性状基因进而通过分子标记辅助选择将有益性状基因转移到栽培小麦中提供了便利。

3.本发明分别利用获得的23对和12对百萨偃麦草特异标记引物对对三个小麦-百萨偃麦草易位 系进行了扩增分析，明确了这三个易位系中，一个涉及百萨偃麦草染色体1J，另两个涉及6JS的不同 区段，并将这36个特异标记分别定位1J和6JS的两个不同区段，显示了这些引物对在小麦-百萨偃 麦草易位系的选育及百萨偃麦草基因转移中的应用潜力。

4.本发明合成的507对引物中，346对引物(68.2％)在普通小麦中国春中亦能稳定扩增，亦可 以作为小麦的分子标记引物，丰富了小麦的分子标记资源，，显示了这些引物对在小麦及其他亲缘物 种研究中的应用潜力。

附图说明

图1引物对lfz1872、lfz1873、lfz1876、lfz1878、lfz1883、lfz1884、lfz1885、lfz1889、lfz1896、 lfz1900、lfz1901、lfz1904在小麦中国春、百萨偃麦草、中国春-百萨偃麦草双倍体中的扩增。a:引物 对lfz1872；b:引物对lfz1873；c:引物对lfz1876；d:引物对lfz1878；e:引物对lfz1883；f:引物对lfz1884； g:引物对lfz1885；h:引物对lfz1889；i:引物对lfz1896；j:引物对lfz1900；k:引物对lfz1901；l:引物对 lfz1904；泳道:M:DL2000；1:中国春；2:百萨偃麦草；3:中国春-百萨偃麦草双倍体；.箭头示特异扩增 条带，lfz1872、lfz1873、lfz1876、lfz1883、lfz1884、lfz1889、lfz1900、lfz1901、lfz1904多态引物。

图2引物对lfz1755、lfz1757、lfz1880、lfz1882在中国春、中国春-百萨偃麦草双倍体、百萨偃麦 草及其中国春-百萨偃麦草异染色体系中的扩增。a图：引物对lfz1755与lfz1757；泳道M:DL2000， 大小分别为1000bp、750bp、500bp、250bp b图：引物对lfz1880与lfz1882；泳道M:DL2000，大小 分别为500bp、250bp；1:中国春；2:中国春-百萨偃麦草双倍体；3:百萨偃麦草；4:中国春-百萨偃麦草二 体代换系DS1J(1B)；5:中国春-百萨偃麦草易位系T2JS-2BS·2BL；6:中国春-百萨偃麦草二体易位附加 系DA6JS·2JL；7:中国春-百萨偃麦草二体易位附加系DA3JS·4JL；8:中国春-百萨偃麦草二体附加系 DA4J；9:中国春-百萨偃麦草二体代换系DS5J(5A)；10:中国春-百萨偃麦草二体代换系DS6J(6A)；11:中 国春-百萨偃麦草二体易位附加系DA3JS·7JS；箭头示特异扩增条带。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本 领域的公知手段。

实施例1

选取处于分蘖盛期的百萨偃麦草，将其转移到装满石英砂的花盆中，在Hogland营养液中培养两 周后，转入250mmol.L^-1NaCl溶液中进行胁迫，胁迫3小时后和12小时后分别剪取叶片。采用Trizol 试剂提取百萨偃麦草总RNA，然后利用Agilent2100(安捷伦2100)平台对样本进行检测，对合格的 样品(RIN>7.5，总量大于15ug总RNA)构建转录组文库。在上机测序之前，进一步采用qPCR方 法对转录组文库进行质量检测，确认文库中片段大小为330bp以及文库浓度为55.51nM，最后在 Hiseq2500高通量测序平台上进行4G深度的从头测序。

在Hiseq2500平台获得的原始测序数据经去除含有接头信息的reads、低质量reads(即质量值Q≤5 的碱基数占整个read的50％以上的reads)及未测出的碱基比例占整个碱基比例大于10％(以N表 示)的reads后，最终获得22,466,730clean reads和4,493,346,000clean bases。运用Trinity方法对clean  reads进行组装，共获得47908条EST序列，获得的EST序列长度从最短的201bp到最长11032bp分 布，平均长度为870bp。EST的N50达到1334bp，N50是指将拼接好的EST序列从长到短排列(或 从短到长)，然后相加，当恰好加到总长度的50％时，那一条序列的长度就叫EST序列的N50。N50 值是评定转录组测序后拼接好坏的一个标准，一般来说是越大越好，拼接质量越高。

比对分析：采用blast软件子程序blastn，比较百萨偃麦草转录组EST序列与小麦D基因组序列 (http://gigadb.org/dataset/100054；Jia et al.Aegilops tauschii draft genome sequence reveals a gene  repertoire for wheat adaptation.Nature,2013.496(7443):1-5.)，发现42915条(占总获得的47908条EST 序列89.7％)序列在小麦D基因组中有同源序列，而4957条(ESTs)没有相似性序列(“No hits found”)， 说明这些序列可能为百萨偃麦草物种特异性的序列，随机选择4957条中的部分百萨偃麦草ESTs设计 507对引物(如表1和表2所示)。以普通小麦“中国春”、百萨偃麦草、中国春-百萨偃麦草双倍体的 全基因组DNA作为模板，经PCR扩增，获得百萨偃麦草特异性扩增片段及相对应的引物对。这里的 特异性扩增片段指的是在中国春中没有出现而在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双倍体同时出现的 特异性扩增片段。如表1所示，共获得204对百萨偃麦草特异性引物对，扩增出209条百萨偃麦草特 异性片段，即209个百萨偃麦草特异分子标记。。

引物设计原则：采用primer 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物，遵循一般引物设计 原则，引物大小为18-27个碱基，一般为20个碱基；Tm值60℃为宜，本专利的目的之一是为了追 踪设计百萨偃麦草特异标记引物，因此引物以扩增出的片段大小为250-1000bp为宜(太短多态性可 能受引物二聚体影响，一般Taqase 1MIN扩增1Kbp，因此产物大小以250-1000bp为宜)。

PCR扩增：

PCR反应体系：

PCR反应程序：

经过94℃预变性3min；33个“94℃，30s；50-60℃(根据引物不同退火温度进行调整)，45-60s； 72℃，1min10S”33个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。

反应结束在反应液中加入2μl变性Loading Buffer，经8％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，用硝酸银 和氢氧化钠“两步法”染色，然后照相观察。

经过PCR分析，具有多态性扩增的引物为204对，占整个设计引物对507对的40.2％，说明在百 萨偃麦草中具有特异扩增片段的引物对多态率高达40.2％。

染色体定位：利用普通小麦“中国春”、百萨偃麦草、中国春-百萨偃麦草双倍体和中国春-百萨偃 麦草异染色体系(DS1J(1B)、T2JS-2BS·2BL、DA6JS·2JL、DA3JS·4JL、DA4J、DS5J(5A)、DS6J(6A)、 DA3JS·7JS)的全基因组DNA作为模板，经PCR扩增，对具有多态性扩增的引物对进行定位，即经 过扩增后，在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双倍体同时出现的的特异性扩增条带在哪个异染色体 系中出现，就将相应的特异性扩增片段定位在对应的染色体或区段上，寻找到对应的引物对。如表1 所示，获得157对能够定位于百萨偃麦草染色体的引物对，共定位了182个百萨偃麦草特异分子标记。 表1中Contigs就是转录组测序后拼接而成的若干EST序列，Tm(℃)均为55℃。

表1 百萨偃麦草特异标记的引物序列、扩增位点与染色体定位

注：“-”表示在现有的中国春-百萨偃麦草异染色体系中无定位信息

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此， 本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发 明的保护范围。