甘蓝粉虱特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试剂盒

摘要

本发明涉及甘蓝粉虱特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试剂盒。所述引物对包括引物APZYJF：5'-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3′；和引物APZYJR：5′-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3′。该引物只对甘蓝粉虱具有扩增能力，其检测灵敏度达到了1/25600头雌性成虫。是对甘蓝粉虱形态学检测鉴定方法的补充和改进。同时，本方法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸、有机蔬菜生产基地、鲜切花生产基地，以及蔬菜、观赏植物种苗和植株调运中推广。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明甘蓝粉虱特异性SS-COI引物对及 快速PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

甘蓝粉虱Aleyrodes proletella(L.)，属同翅目、粉虱科、粉虱属，是一种世界性 检疫害虫。甘蓝粉虱的寄主植物较多，有12科38种加3属，分别为十字花科16种 加1属，菊科10种加3属，毛茛科3种，伞形科1种加1属，玄参科1属，桔梗科 2种，凤仙花科、小檗科、大戟科、壳斗科、豆科和罂粟科各1种。而且，随着甘蓝 粉虱入侵区域的逐渐扩大和定居时间的推移，其寄主植物的种类和危害程度有进一 步增加的趋势。甘蓝粉虱以成虫和若虫进行危害，危害方式主要有两种，一是直接 危害，亦即以刺吸式口器吸食寄主植物汁液，与植物争夺营养物质，导致寄主叶片 黄化、提前落叶、落花甚至落果，严重影响作物产量和质量；二是间接危害，亦即 成虫和若虫分泌的蜜露诱发煤污病，不仅影响植物的光合作用、降低作物产量，还 严重影响作物的品质和观赏植物的观赏价值。而有关其是否传播植物病毒，尚不得 而知。如甘蓝粉虱近年来在欧洲各国严重危害十字花科蔬菜，并在英国多次暴发成 灾，对欧洲芸苔属蔬菜产业的健康发展构成了极大威胁，而且已对拟除虫菊酯类杀 虫剂产生了抗性。

甘蓝粉虱原产于英国南部，二十世纪九十年代之前是欧洲十字花科蔬菜的一种 次要害虫。然而，随着国际贸易的日趋频繁，甘蓝粉虱传播扩散迅速，目前已广泛 分布于欧洲如奥地利、英格兰、捷克斯洛伐克、芬兰、法国、德国、匈牙利、意大 利、波兰、西班牙、瑞典、瑞士、南斯拉夫；非洲如加那利群岛、埃及、摩洛哥、 安哥拉、肯尼亚、莫桑比克，北非和东非；亚洲如俄罗斯(塔吉克斯坦帕米尔山脉)、 中国台湾、伊拉克、印度；澳洲的澳大利亚；太平洋群岛的新西兰；大西洋群岛的 百慕大群岛；南美洲的巴西，以及北美洲的美国东部等国家和地区。我国大陆于2012 年7月在北京市朝阳区首次发现甘蓝粉虱危害菊科杂草抱茎苦荬菜，2013年8月在 新疆乌鲁木齐和吐鲁番发现其危害生菜。甘蓝粉虱最嗜食十字花科和菊科植物，而 我国幅员辽阔，除海南省地处热带以外，横跨暖温带和亚热带；菊科植物是我国主 要观赏植物类型，而十字花科植物是我国主要的蔬菜种植类型，在青海和西藏以外 的全国各省市区均有种植。甘蓝粉虱是新传入我国的一种粉虱类入侵害虫，目前仅 在北京和新疆发现，一旦发生即可造成严重危害。而蔬菜花卉的调运以及观光旅游 等是甘蓝粉虱进一步扩散蔓延的主要方式，因此加强对甘蓝粉虱的检疫和监测检测 是杜绝其进一步传播扩散的根本途径。

甘蓝粉虱体型微小，雌性成虫体长1.5mm，雄性个体稍小；卵长约0.3mm，初 产蜡白色，半透明；初孵若虫体长约0.4mm，淡黄绿色；卵及初孵若虫肉眼均难以 发现。而加强检疫和监测检测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上 用于甘蓝粉虱鉴定的方法主要是：1)形态特征鉴定。而且目前国内针对甘蓝粉虱尚 没有标准的检测方法。

COI技术曾用于鉴别甘蓝粉虱的近缘种。mtDNA COI技术检测是利用通用型的 引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、 纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SS-COI PCR技术检 测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性 的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵 敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。

发明内容

本发明的目的为提供一对甘蓝粉虱特异性SS-COI引物。

本发明的另一目的为提供一种甘蓝粉虱的特异性快速PCR检测方法。

本发明的再一目的为提供一种甘蓝粉虱的特异性快速PCR检测试剂盒。

本发明根据甘蓝粉虱的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只 对甘蓝粉虱具有扩增能力。是对甘蓝粉虱形态学鉴定识别方法的补充和改进。同时， 本方法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在 甘蓝粉虱检测/监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、有机 蔬菜生产基地、鲜切花生产基地，以及蔬菜和观赏植物种苗及植株等的调运中推广。

根据本发明的一对甘蓝粉虱特异性SS-COI引物为：

引物APZYJF：5′-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3′；和

引物PPZYJR：5′-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3′。

根据本发明的甘蓝粉虱种特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR 扩增的步骤。

根据本发明的甘蓝粉虱种特异性检测试剂盒包括上述甘蓝粉虱特异性SS-COI 引物。

本发明的甘蓝粉虱种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测 甘蓝粉虱。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1)检测准确性高。本方法根据甘蓝粉虱种特异性SS-COI标记设计的引物 APZYJF和APZYJR，在PCR快速检测甘蓝粉虱时，可扩增出384bp的片段，不仅 对甘蓝粉虱的单头成虫和2龄、三龄、四龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头 初孵若虫也能准确检测。

2)操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般 整个过程可在5个小时内完成。

3)特异性强。本发明设计的引物可特异性检测甘蓝粉虱，在其近缘种、属粉虱 中无扩增产物。

因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。

附图说明

图1为引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱及其近缘种、属粉虱的SS-COI PCR 扩增结果，

M:分子量标准Trans2K^TM；1:甘蓝粉虱Aleyrodes proletella(L.)；2:双钩巢粉虱； 3:螺旋粉虱；4:烟粉虱Asia II3隐种；5:烟粉虱Asia II1隐种；6:烟粉虱China1 隐种；7:烟粉虱Asia I隐种；8:烟粉虱MED隐种；9:温室粉虱；10:柑橘粉虱；11: 非洲小粉虱；12:阴性对照(超纯水)。

图2为引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱不同虫态和性别的SS-COI PCR扩增 结果，

M:分子量标准Trans2K^TM；1:单粒卵；2:一龄若虫；3:二龄若虫；4:三龄若 虫；5:四龄若虫；6:雌性成虫；7:雄性成虫；8:阴性对照(超纯水)。

图3为引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱检测阈值的测定，

M:分子量标准Trans2K^TM；1-16分别为1:1/25；2:1/50；3:1/100；4:1/200；5: 1/400；6:1/800；7:1/1600；8:1/3200；9:1/6400；10:1/12800；11:1/25600；12:1/51200； 13:1/102400；14:1/204800；15:1/409600；16:1/819200头雌性成虫；17:阴性对照(超 纯水)。

具体实施方式

实施实例1：引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱的扩增效果

1)粉虱模板DNA的制备

将单头粉虱置于滴有20μL提取缓冲液(50mM Tris-HCl、lmM EDTA、1％ SDS、20mM NaCl,pH8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分 研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分2次清洗匀 浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃ 水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴8min，加入220μL氯仿/异戊醇(V:V＝24:1) 抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离心20min，取 上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃ 放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷 的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管 倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入50μL超纯水，充分溶解后于-20 ℃保存备用。

2)检验甘蓝粉虱的特异性引物的合成

Primer APZYJF：5′-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3′

Primer APZYJR：5′-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3′由上海生工生物工程 技术服务有限公司合成。

3)PCR扩增反应

反应体系为20μL，其中10×PCR buffer(含Mg²⁺)2.0μL、dNTP(10mM)0.3μL、 Taq聚合酶(2.5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.3μL、模板DNA2.0 μL、超纯水14.9μL。

4)PCR扩增程序

94℃预变性10min；35个循环：94℃ 30sec、52℃ 30sec、72℃ 30sec；最 后72℃延伸10min。

5)PCR产物的鉴定

取5μL PCR产物用1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物primer APZYJF/APZYJR以甘蓝粉虱线粒体DNA为模板，以不同隐种 的烟粉虱(包括：Asia II3隐种、Asia II1隐种、China1隐种、Asia I隐种、MED 隐种)以及双钩巢粉虱、螺旋粉虱、温室粉虱、柑橘粉虱、非洲小粉虱等5种其他 常见种类的粉虱为对照进行SS-COI PCR扩增。在1泳道的甘蓝粉虱中扩增出了384 bp的目的条带(见附图1的1泳道)，在其他10种近缘种、属的粉虱中均无扩增产 物。说明我们所筛选的来自甘蓝粉虱线粒体DNA的特异性SS-COI PCR扩增引物的 特异性强。

384bp片段的序列：

实施实例2：引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱不同虫态和性别的扩增效果

1)甘蓝粉虱模板DNA的制备

将不同虫态和性别的单头/单粒甘蓝粉虱置于滴有20μL提取缓冲液(50mM  Tris-HCl、l mM EDTA、1％SDS、20mM NaCl,pH8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的 PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200 μL缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20 mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220 μL氯仿/异戊醇(V:V＝24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、 12000r/min离心20min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待 出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心 弃去上清液。加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min， 小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入50 μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。

2)检验甘蓝粉虱的特异性引物的合成

Primer APZYJF：5′-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3′

Primer APZYJR：5′-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3′由上海生工生物工程 技术服务有限公司合成。

3)PCR扩增反应

反应体系为20μL，其中10×PCR buffer(含Mg²⁺)2.0μL、dNTP(10mM)0.3μL、 Taq聚合酶(2.5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.3μL、模板DNA2.0 μL、超纯水14.9μL。

4)PCR扩增程序

94℃预变性10min；35个循环：94℃ 30sec、52℃ 30sec、72℃ 30sec；最 后72℃延伸10min。

5)PCR产物的鉴定

取5μL PCR产物用1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物APZYJF/APZYJR以不同虫态和性别的甘蓝粉虱线粒体DNA为模板 进行PCR扩增。甘蓝粉虱的雌性成虫和雄性成虫均扩增出了384bp的目的条带(见 附图2的6、7泳道)；同时甘蓝粉虱的单头四龄若虫、三龄幼虫、二龄幼虫、初孵 幼虫以及单粒卵也扩增出了384bp的目的条带(见附图2的5、4、3、2、1泳道)， 说明我们所筛选的甘蓝粉虱的种特异性SS-COI PCR扩增引物的准确性高。

实施实例3：引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱检测阈值的测定

1)甘蓝粉虱模板DNA的制备

将单头甘蓝粉虱雌性成虫置于滴有20μL提取缓冲液(50mM Tris-HCl、lmM  EDTA、1％SDS、20mM NaCl,pH8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部作为 匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分2 次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀 后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇 (V:V＝24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离 心20min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉 淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加 入500μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液； 然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入50μL超纯水。原 模板溶液以2倍进行递减梯度稀释至1/819200头，取2μL作为PCR扩增的模板，直接 加到PCR反应体系中。

2)检验甘蓝粉虱的特异性引物的合成

Primer APZYJF：5′-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3′

Primer APZYJR：5′-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3′由上海生工生物工程 技术服务有限公司合成。

3)PCR扩增反应

反应体系为20μL，其中10×PCR buffer(含Mg²⁺)2.0μL、dNTP(10mM)0.3μL、 Taq聚合酶(2.5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.3μL、模板DNA2.0 μL、超纯水14.9μL。

4)PCR扩增程序

94℃预变性10min；35个循环：94℃ 30sec、52℃ 30sec、72℃ 30sec；最 后72℃延伸10min。

5)PCR产物的鉴定

取5μL PCR产物用1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物primer APZYJF/APZYJR做检测阈值的测定，以不同稀释倍数的甘蓝粉 虱线粒体DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最低模板DNA浓度为1/25600头 雌性成虫(见附图3)。