一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用

摘要

本发明公开了一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用，所述蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，步骤为：含IsCT目的片段的获得；多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建；毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建；重组毕赤酵母的构建和筛选；重组菌的摇瓶发酵诱导表达。本发明综合多项因素，采用巴斯德毕赤酵母表达系统，选用分泌型表达载体pPICZαA和Mut

说明书

技术领域

本发明属于抗菌肽领域，具体是一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用。 

背景技术

抗生素的发现是化学治疗药物史上最重要的发现之一，它极大地降低了感染性疾病的死亡率。然而，抗生素的大量使用，尤其是不合理使用导致了日益严重的抗生素耐受现象。耐药菌，尤其是多药物耐受菌，已成为威胁公共安全的重大问题，也导致了对新型抗感染药物的需求越来越迫切。自从发现cecropin以来，抗菌肽的研究备受关注，目前已经鉴别的抗菌肽超过2 000 种，几乎来源于从微生物到哺乳动物所有种类的生物。抗菌肽研究的角度也得到极大的扩展，从作用机理、产生机制到挖掘抗菌肽其他功能，如免疫调节、离子调节、抗氧化功能等，再到临床应用研究。抗菌肽是由基因编码、核糖体合成的，是宿主先天性免疫防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽类生物活性物质，是先天性免疫的重要效应分子。 

1.IsCT是一种天然的α-螺旋抗菌肽，来源于马达加斯加黑爪蝎（Opisthacanthus madagascariensis），是抗菌肽中最短的多肽，仅由13个氨基酸残基（ILGKIWEGIKSLF）组成，没有半胱氨酸。IsCT对哺乳动物和细菌细胞都有活性。基于这个基因设计的IsCT衍生物中的[L⁶, K¹¹]-IsCT（ILGKILKGIKKLF）中与IsCT一样，对E. coli, P. aeruginosa, S. trphimurium, S. epidermidis, S. aureus有相同的抑菌活性，同时当[L⁶, K¹¹]-IsCT浓度达到100μM时的溶血活性仅为20%，因此在饲料、医药中有较高的应用价值。 

2.抗菌肽是生物内在免疫的效应分子，在生物体内含量甚微，从天然资源中提取成本高、得率低、工序繁琐，所以不可能通过从生物体内直接提取大量抗菌肽的方式来满足商业化的生产，目前主要的两种方式是直接合成多肽和基因工程手段。而化学合成价格昂贵，也难以应用于临床；因此利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要的意义。 抗菌肽重组表达研究始于20 世纪80 年代中期，至今已经取得相当多的研究成果，具备了一定的理论和技术基础。 

由于抗菌肽分子量小，且可能对宿主菌有毒性，因此在大肠杆菌中抗菌肽单独表达的报告并不多且表达量不高。 

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统，目前通过毕赤酵母表达了很多不同种类的蛋白。因此选择用毕赤酵母作为表达IsCT衍生物的宿主。在毕赤酵母中生产重组蛋白有优于其他真核生物和原核生物的特点：1.便于基因工程操作，具有强有力的乙醇氧化酶（AOX1）基因启动子，可严格调控外源基因的表达；2.作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰；从而使表达出的蛋白具有生物活性；3.营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；4.可高密度发酵培养，表达量高；5.在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，有利于纯化；6.糖基化程度低，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不产生过度的糖基化；7.可通过重组基因多拷贝整合增加所需蛋白的表达量。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用。 

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 

一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，包括以下步骤： 

（1）含IsCT目的片段的获得

以α信号肽为模板设计引物，上游引物：5′GCGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC 3′，下游引物：5′CCGGAATTCTTAAAACAACTTCTTAATACCCTTCAAAATCTTACCCAAAATTCTTTTAGCTTCAGCCTCTCTTTTC 3′，其中TTCGAA为BstBⅠ的酶切位点；GAATTC为EcoRⅠ的酶切位点，目的基因设计在下游引物上，以质粒pPICZαA为模板，PCR扩增得到含有目的基因和α信号肽的片段；将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化；

（2）多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建  

单拷贝重组质粒pPICZαA-IsCT用BglⅡ和BamHⅠ双酶切后，将双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶后回收表达盒段并纯化；同时用BamHⅠ线性化质粒pPICZαA-IsCT，并去磷酸化后，用T4连接酶连接，得到二拷贝质粒pPICZαA-(IsCT)2，重复这个过程，得到更多拷贝数的IsCT衍生物；

（3）毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建  

质粒pPICZαA和含有目的基因的片段同时用BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切，构建重组质粒pPICZαA-IsCT；然后用CaCl₂法转入E. coli感受态细胞，在Zeocin+ LBL平板上涂板，过夜培养；提取阳性转化子质粒进行BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定；

（4）重组毕赤酵母的构建和筛选 

以MssⅠ线性化重组质粒pPICZαA-IsCT，采用电转化宿主菌P. pastoris X33于Zeocin+ YPDS平板上涂板，28-32℃培养2-3d，随机挑选转化子进行菌落PCR鉴定；

（5）重组菌的摇瓶发酵诱导表达 

将筛选得到的重组转化子X33/pPICZαA-IsCT接种于10mL BMGY培养基中，30℃，200r/mim震荡培养16-20h至OD600=2-6；离心收集菌体，再将X33/pPICZαA-IsCT悬浮于25mL BMMY培养基中，并使起始OD600=1，继续震荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1%的甲醇，得到重组菌，即为蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并分析重组菌的生长曲线和IsCT衍生物的抗菌活性。

作为进一步的方案：步骤（1）中用于PCR扩增的PCR反应体系为：引物各10pmol/L，Premix prime STAR 25μL，模板1μL，加无菌水至总体积为50μL；反应条件为：98℃ 5min;98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 20s，30个循环；72℃ 10min；将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化。 

所述的蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法制备的蝎源抗菌肽IsCT衍生物在治疗外伤类感染类疾病的应用。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明综合多项因素，采用巴斯德毕赤酵母表达系统，选用分泌型表达载体pPICZαA和Mut⁺型宿主菌X-33，进行分泌表达蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并对体外分泌表达产物进行抑菌活性检测，为其在临床上治疗外伤类感染类疾病提供理论基础及技术支持。 

附图说明

图1为重组质粒pPICZαA-IsCT的示意图； 

图2为单拷贝重组质粒双酶切凝胶电泳图；

图2中：M:DNA Marker;

1:重组质粒经BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切；

图3为二拷贝重组质粒单双酶切凝胶电泳图；

图4为三拷贝重组质粒单双酶切电泳图；

图3和图4中：M：DNA Marker；

1：二拷贝（图3）及三拷贝（图4）重组质粒经BgIⅡ和BamHⅠ双酶切双酶切；

2、3：二拷贝（图3）及三拷贝（图4）重组质粒单酶切；

图5为单拷贝重组毕赤酵母发酵120h后对S. aureus ATCC 25923的抑制实验结果图；

图6为单拷贝重组毕赤酵母发酵120h后对E. coli ATCC 8739的抑制实验结果图；

图7为表达产物SDS-PAGE分析图；

图7中：M:预染蛋白Marker；

343:IsCT衍生物标准品；

11、12:单拷贝重组菌株发酵上清液；

21、22、23：二拷贝重组菌株发酵上清液。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 

1材料与方法 

1.1实验材料

1.1.1质粒与菌株

质粒：pPICZαA；菌株：E.coli Top10，Pichia pastoris X33，E. coli ATCC 8739，S. aureus ATCC 25923均由本实验室保存

1.1.2试剂

DNA聚合酶Premix prime STAR、T₄ DNA连接酶、DNA marker和限制性内切酶购自大连宝生物有限公司；实验中所用试剂盒购自OMEGA、Biomega和QIAGEN公司；无氨基酸酵母基础氮源YNB和蛋白胨均购自Difco公司；酵母提取物购自Oxford公司；引物由上海捷瑞公司合成；其他试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法 

1.2.1含IsCT目的片段的获得  

以α信号肽为模板设计引物，上游引物：5′GCGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC 3′ ，下游引物：5′CCGGAATTCTTAAAACAACTTCTTAATACCCTTCAAAATCTTACCCAAAATTCTTTTAGCTTCAGCCTCTCTTTTC 3′，（其中下划线TTCGAA为BstBⅠ的酶切位点；GAATTC为EcoRⅠ的酶切位点），目的基因设计在下游引物上，以质粒pPICZαA为模板，PCR扩增得到含有目的基因和α信号肽的片段。PCR反应体系为：引物各10pmol/L，Premix prime STAR 25μL，模板1μL，加无菌水至总体积为50μL。反应条件为：98℃ 5min;98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 20s，30个循环；72℃ 10min。将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化。

1.2.2多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建  

单拷贝重组质粒pPICZαA-IsCT用BglⅡ和BamHⅠ双酶切后，将双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收表达盒段并纯化。同时用BamHⅠ线性化质粒pPICZαA-IsCT，并去磷酸化后，用T4连接酶连接，得到二拷贝质粒pPICZαA-(IsCT)2，重复这个过程，得到更多拷贝数的IsCT衍生物。

1.2.3 毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建  

质粒pPICZαA和含有目的基因的片段同时用BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切，构建重组质粒pPICZαA-IsCT（图1）。然后用CaCl₂法转入E. coli感受态细胞，在Zeocin+ LBL(25mg/L)平板上涂板，过夜培养。提取阳性转化子质粒进行BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。

1.2.4 重组毕赤酵母的构建和筛选 

以MssⅠ线性化重组质粒pPICZαA-IsCT，采用电转化宿主菌P. pastoris X33于Zeocin+ YPDS(100mg/L)平板上涂板，30℃培养2-3d，随机挑选转化子进行菌落PCR鉴定。

1.2.5 重组菌的摇瓶发酵诱导表达 

将筛选得到的重组转化子X33/pPICZαA-IsCT接种于10mL BMGY培养基中，30℃，200r/mim震荡培养16-20h至OD600=2-6。离心收集菌体，再将X33/pPICZαA-IsCT悬浮于25mL BMMY培养基中，并使起始OD600=1，继续震荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1%的甲醇，并分析重组菌的生长曲线和IsCT衍生物的抗菌活性。实验以P. pastoris X33/ pPICZαA作为阴性对照。

1.2.6  IsCT活性测量 

取发酵液10mL，5000rpm离心5min，取上清液，标记为原液，测定原液pH，以氢氧化钠调节pH至6.5-7.0，取调节pH后的原液，依次倍比稀释至2×、4×、8×、16×，包括原液共得5个不同浓度的样品。高温灭菌后的营养琼脂培养基，待其温度降到45℃左右，加入1-2滴TTC试剂（可选），按1:1000比例接入供试大肠杆菌，混匀。混匀后倒入无菌培养皿内，每皿25mL，待其凝固（金黄色葡萄球菌同上）。用表面光滑的无菌不锈钢管在培养基上打孔，将空中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分与平皿融合（防止药液渗漏，影响结果），每一平板打5个孔，分别加入供试样品原液、2×、4×、8×、16×，每孔加至液面与液体培养基齐平（约75μL），于平板底部做标记。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养15-24h,观察抑菌效果，量取抑菌圈直径（减去孔径）并记录结果。 

1.2.7 表达产物SDS-PAGE电泳分析 

取发酵120h的发酵液离心，取上清，60℃下浓缩10倍，之后将浓缩液进行SDS-PAGE电泳，并将化学合成的IsCT标准品作为对照，分析蛋白表达情况。

2.结果分析 

2.1 IsCT衍生物重组质粒的构建

以质粒pPICαA为模板扩增IsCT衍生物基因，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收产物，按方法“1.2.2”构建重组质粒pPICZαA-IsCT，双酶切鉴定结果符合预期（图2），送上海美吉生物医药有限公司测序，测序结果正确。重组质粒pPICZαA-IsCT的结构示意图如图1所示。按方法1.2.2构建的二拷贝、三拷贝重组质粒经单双酶切鉴定结果符合预期（图3、4）。

2.2.2 单拷贝重组毕赤酵母发酵液上清对E. coli ATCC 8739，S. aureus ATCC 25923最小抑菌浓度的测定  

按方法1.2.6对单拷贝发酵液稀释为不同的浓度，测不同稀释度的发酵液对E. coli ATCC 8739，S. aureus ATCC 25923的抑菌圈。如图5示，其中在对S. aureus ATCC 25923的抑制实验中，发酵液稀释4倍后，对S. aureus ATCC 25923仍有抑菌活性，稀释8后，没有抑菌活性，因此可以定义对S. aureus ATCC 25923的最低抑菌浓度为IsCT衍生物发酵液浓度的0.25倍。在对E. coli ATCC 8739的抑制实验中，发酵液稀释2倍后，对E. coli ATCC 8739仍有抑菌活性，稀释4倍后，没有抑菌活性，因此可以定义对E. coli ATCC 8739的最低抑菌浓度为IsCT衍生物发酵液浓度的0.5倍。

2.2.3表达产物的SDS-PAGE分析 

将单拷贝及二拷贝发酵液上清浓缩之后进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，IsCT蛋白大约在2kD，比标准品略大，可能与蛋白翻译后的糖基化等修饰有关。

3.讨论 

为了在毕赤酵母中高效表抗菌肽IsCT衍生物，本研究根据IsCT衍生物的氨基酸序列，选择毕赤酵母的偏嗜性密码子，把含有目的基因的DNA片段设计在下游引物上，通过PCR的方法扩增得到含有α信号肽的目的基因序列。

由于毕赤酵母没有天然质粒，现用的表达载体均为整合性载体，含目的基因的表达载体通过同源重组的方式整合至酵母染色体上，从而获得目的基因稳定整合的工程菌株。采用内切酶使表达载体线性化，表达框与宿主基因组发生单交换而整合于染色体中，从而提高了整合的成功率。由于pPICZαA载体在表达框两侧有同尾酶的酶切位点，可以利用同尾酶双酶切，去磷酸化后，连接构建多拷贝的IsCT衍生物来提高表达量。 

醇氧化酶（AOX1）启动子和α信号肽有利于外源基因在甲醇的控制下稳定、高效的分泌表达。同时可以选择强启动子、信号肽和优化发酵条件等方法实现IsCT突变体的分泌表达量的增加。 

大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌是临床上外伤感染的主要病原菌。在临床工作中大肠埃希菌所致感染有所上升，滥用抗生素和细菌间R因子相互传递，耐药菌株明显增加，给临床治疗带来困难。金黄色葡萄球菌所致感染不但病情严重，而且往往对多种抗菌药物耐药，给治疗带来极大困难。我国医院感染监控网数据表明，金葡菌在医院感染的革兰阳性菌中排第一位。而且，随着抗菌药物的广泛使用，金葡菌的耐药率和多重耐药菌株不断增长和变化。而与普通抗生素相比，抗菌肽的抗菌范围更广，除了抗细菌外，有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、有包膜的病毒及癌细胞（对癌细胞的选择性作用可能与其细胞骨架的改变有关），同时能加速愈合过程。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒、抗感染等方面有良好的应用前景。更为重要的是，抗菌肽这种从生物体中获得的物质恰巧具有独特的抗菌机理，不像一般抗生素那样通过阻断生物大分子的生物合成来发挥租用，不会产生看耐药性，因而极有希望开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。而本研究通过毕赤酵母X-33工程菌表达出来的IsCT衍生物不论是对大肠埃希氏菌还是金黄色葡萄球菌，都表现出良好的抑制作用，为在临床上替代此类抗外伤感染药物成为可能。 

4.影响外源基因在毕赤酵母中表达的几个因素 

迄今已有200多种外源蛋白在毕赤酵母中获得表达，但也有许多蛋白表达不理想，甚至不能表达。一般认为影响外源基因在该系统表达的因素很多，如启动子的选择、目的基因的特性、mRNA的非翻译区（UTR）、目的基因密码子的使用、载体的选择、宿主菌的选择等。

4.4.1 外源基因的特性 

外源基因的内在特性是决定表达成败的重要影响因素，AT含量过高的基因在毕赤酵母中表达有时会造成转录提前终止，毕赤酵母的AOX1转录终止序列就是一个“AT”富含区，序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号。

4.4.2 温度 

温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的结果。温度对毕赤酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质（溶解氧量、基质的分解吸收速率等）及生物合成方向等都有影响。从酶学动力学角度看，温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但温度过高，又会使酶易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的产量。据报道，毕赤酵母的培养温度为28℃~30℃，28℃是酵母菌体生长的最适温度，30℃是外源蛋白表达的最适温度。诱导期间超过32℃，对蛋白表达不利，甚至会导致细胞死亡。

4.4.3 pH值 

培养基的pH不论对菌体生长还是对蛋白的分泌表达都是相当重要的。发酵培养基的pH对微生物生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：1.影响酶活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；2.影响微生物所带细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；3.影响培养基中某些组分和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用；4.pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。毕赤酵母在pH值3.0-7.0的范围内均可生长，但当pH低于2.2时菌体停止生长，当控制pH恒定（5.0）时表达量最高。毕赤酵母高密度发酵过程中pH的调控是通过在线补加氨水和盐酸来平衡酸碱性进行的。其中，氨水既是酸碱的调节剂，又为毕赤酵母发酵提供氮源。尤其在基因工程分泌表达过程中，有些蛋白对pH值比较敏感，容易受到蛋白水解酶的水解，因此，必选选择合适的pH值，既可以高效表达目的蛋白又能抑制蛋白酶的水解，保持目的蛋白的稳定性。尽管毕赤酵母生长的pH范围比较宽，但是具体到不同的重组工程菌，就各有不同的最适生长pH值。

4.4.4溶解氧 

   发酵基质中溶解氧量（DO）对于好氧微生物生长是非常重要的，在发酵过程中，保证氧的供给，满足生产菌对氧的需求，是提高发酵产量的重要因素。高密度发酵过程中，有报道认为如果用发酵罐进行培养，外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶高出10-100倍，主要原因是普通摇瓶发酵的通气不理想，影响了菌体的高密度生长及表达。毕赤酵母是好氧微生物，它的生长代谢过程需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响酵母的代谢，使后期的生长变得极为缓慢。菌体在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，使后期的生长变得极为缓慢。菌体在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给而非常重要。随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降，细胞生长减慢。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果抑制了细菌的生长繁殖。因此保持一定的溶解氧浓度，可以降低底物和有害废物的抑制作用，实现高密度发酵。研究表明，在毕赤酵母高密度发酵过程中，如溶氧低于20%，将会使菌体生长和代谢受到影响。但如果溶氧过高（超过60%），细胞就会发生氧中毒。可见，溶氧过高或过低都对外源蛋白的表达有很大影响。因此，使溶氧保持在有利于外源蛋白高效表达的范围对于高密度发酵来说是非常重要的。

  对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。 

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。