天麻素/天麻粉在制备抗肝纤维化药物中的应用

摘要

本发明属于医药领域，涉及天麻素在制备抗肝纤维化药物中的应用，通过对Ⅰ型胶原蛋白α1启动子活性的抑制作用、对大鼠血清中ALT和AST含量的影响、对大鼠肝脏组织病理结构的影响、对大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响、对大鼠肝脏组织氧化应激反应的影响以及对大鼠肝纤维化程度的影响等系统研究证明，天麻素具有良好的抗肝纤维化活性，有望研发成为抗肝纤维化的新药。

说明书

技术领域：

本发明属于医药领域，涉及天麻素/天麻粉在制备抗肝纤维化药物中的应用。

背景技术：

肝纤维化是肝脏内细胞外基质(特别是Ⅰ型胶原α1)过度沉积的病理过程， 它是机体对急、慢性肝损伤的一种修复反应。各种病因引起的慢性肝病及某些有 毒物质所致的肝脏损伤，均可引起肝细胞炎症坏死，并继发纤维化的病理特征。 肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是向肝硬化甚至原发性肝细胞癌发展的重要环 节，在我国导致肝纤维化的主要疾病是乙型病毒性肝炎。传统观点认为，人的肝 脏一旦发生纤维化后，是不可能发生逆转的，而著名的肝病专家Rogking在对肝 纤维化进行深入研究后提出，人典型的肝肝纤维化是可以逆转的，这对有效控制 肝脏疾病由肝炎向肝硬化、肝癌恶性发展具有重要意义。多年来，国内外学者在 肝纤维化的发生机制、调节因素、诊断及治疗方面进行了大量研究。尽管实验研 究用药不少，但是至今除针对引起肝纤维化的病因外，仍然没有能用于临床的高 效、无明显毒副作用的西药。临床实践表明，中医药治疗肝纤维化在改善临床症 状等方面显示了很大的潜力。目前，我国临床使用的抗肝纤维化中药有：扶正化 瘀胶囊、复方鳖甲软肝片、大黄蛰虫丸、小柴胡制剂、强肝胶囊等。所述药物均 为中药复方制剂，由多味中药组成，而且所有复方制剂中均不含有天麻成分。

天麻为兰科天麻属植物，其干燥块茎亦称天麻(GastrodiaelataBlume)，是 一味常用而较名贵的中药，临床多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、 抽搐、破伤风等症。天麻素(Gastrodin)是天麻的有效单体成分之一，目前在临 床上主要用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病。天麻素CAS号62499-27-8，分 子式C₁₃H₁₈O₇，分子量286.3，分子结构式为：

近年来，本实验室通过对天麻素/天麻粉的系统生物学活性研究发现，作为 单味药的天麻素/天麻粉，具有抗肝纤维化的活性，继而进行了后续的深入研究 工作。所述天麻素/天麻粉在抗肝纤维化中的应用，迄今为止，尚未见有国内外 的相关报道。

发明内容：

本发明提供了天麻素/天麻粉在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明还提供了天麻素/天麻粉为有效成分与药学上可接受的载体组成的组 合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明利用Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子作为药物筛选的靶标，构建了 抗肝纤维化药物细胞筛选模型，并使用该模型筛选出天麻素/天麻粉对COL1A1 启动子具有显著的抑制作用。为进一步确定天麻素/天麻粉的抗肝纤维化作用， 本发明制备胆总管结扎的SD大鼠模型，并对大鼠肝功能、肝组织病理结构、肝 组织纤维化程度、胶原纤维含量及氧化应激程度进行检测，结果显示，天麻素/ 天麻粉能够抑制肝纤维化的产生。

本发明用于抗肝纤维化治疗时，天麻粉口服给药，天麻素口服或非口服给药 均属安全有效的。口服用药可以制成任何常规剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒 等；非口服用药，可制成注射液针剂等。

本发明所述天麻素给药剂量可根据服用方式、病情轻重以及患者年龄等因素 调整改变，通常成人口服剂量选自1-100mg/日；成人注射剂量选自1-50mg/日。

本发明用于制备抗肝纤维化药物时，其辅料及制备方法可选用药学上可接受 的任何形式。

附图说明：

图1-天麻素对Ⅰ型胶原蛋白α1启动子活性的抑制作用

其中：*p<0.05与对照组(给药浓度为零)相比。

图2-天麻素对大鼠肝脏组织病理结构的影响

其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；B为模型组大鼠肝 脏组织切片HE染色结果；C为给药天麻素组大鼠肝脏组织切片HE染色结果； D为对所有动物组织胆管增生情况的统计图；E为对所有动物组织坏死情况的 统计图*p<0.05，**p<0.01与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图3-天麻素对大鼠肝纤维化程度的影响

其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片天狼星红染色结果；B为模型组大鼠 肝脏组织切片天狼星红染色结果；C为给药天麻素组大鼠肝脏组织切片天狼星红 染色结果；D为对所有动物组织天狼星红染色面积的统计图

*p<0.05与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图4-天麻素对大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响

其中：*p<0.05与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图5-天麻素对大鼠肝脏组织氧化应激反应的影响

其中：*p<0.05与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图6-天麻粉对Ⅰ型胶原蛋白α1启动子活性的抑制作用

其中：*p<0.05，**p<0.01与对照组(给药浓度为零)相比。

图7-天麻粉对大鼠肝脏组织病理结构的影响

其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；B为模型组大鼠肝脏 组织切片HE染色结果；C为给药天麻粉组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；D 为对所有动物组织坏死情况的统计图

**p<0.01与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图8-天麻粉对大鼠肝纤维化程度的影响

其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片天狼星红染色结果；B为模型组大鼠 肝脏组织切片天狼星红染色结果；C为给药天麻粉组大鼠肝脏组织切片天狼星红 染色结果；D为对所有动物组织天狼星红染色面积的统计图

##p<0.01与假手术组相比。

图9-天麻粉对大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响

其中：##p<0.01与假手术组相比。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解 释而不是限定。

《实施例1》天麻素抑制Ⅰ型胶原蛋白α1启动子活性试验

1.1构建稳定表达Ⅰ型胶原蛋白α1启动子COL1A1P的单克隆细胞株 LX2-COL

采用基因组DNA提取试剂盒，提取LX2细胞(Mount Sinai School of  Medicine)的基因组DNA。利用NCBI数据库人全基因组信息Ⅰ型胶原α1基因 COL1A1序列(序列号：NC_000017.11)前约2400bp，作为COL1A1启动子序 列。应用primer premier5.0引物设计软件，设计COL1A1启动子的引物，上下游 引物序列分别为5’AAGAGCTCGTGGGAAAGCCTGGATGG3’(含SacⅠ酶切位 点)，5’AAAGATCTTTTGGGACTTACTGTCTTCGT 3’(含BglⅡ酶切位点)。 以LX2细胞的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到目的片段Ⅰ型胶原α1 基因COL1A1启动子，并利用琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物。

将Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子片段与pGL4.17[luc2/Neo]载体经SacⅠ 和BglⅡ双酶切后连接，连接反应液转化大肠杆菌DH5α感受态中，在LB固体 平板，37℃倒置培养16-20h，挑取氨苄青霉素抗性单克隆，提取质粒DNA。利 用菌落PCR、酶切等技术初步鉴定阳性克隆，获得重组质粒，命名为 pGL4.17-COL1A1P

在含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基，37℃，5％CO2条件下培 养LX2细胞。按照每孔5×10⁴个细胞铺于48孔板，培养24h在6孔板中培养 LX2细胞达到接近90％-95％汇合时，进行细胞转染。24h后，加入浓度梯度G418 (AMERCO)，最终选择浓度为100μg·mL^-1的G418继续培养转染 pGL4.17-COL1A1P质粒的LX2细胞，并及时换液。待6孔板中的细胞长满后， 铺单细胞到96孔板。待单细胞长成克隆(约1周-2周)，加D-荧光素(Thermo  Fisher)至终浓度60μg·mL^-1，利用活体生物发光成像系统(IVIS 200，Xenogen) 拍摄，选择信号最强的单克隆细胞株LX2-COL，并扩大培养。

1.2将以上构建的稳定表达Ⅰ型胶原蛋白α1启动子COL1A1P的单克隆细胞 LX2-COL铺于96孔白板，每孔2×10⁴个细胞。待细胞汇合度约90％后，无血清培 养24h，加TGF-β1(2ng/ml)诱导，同时加入浓度梯度的天麻素(市售产品)， 浓度分别为1μg/ml、3μg/ml、30μg/ml，每组实验设3个复孔。按照Bright-Glo^TMLuciferase Assay System说明书操作步骤，24h后吸弃培养基，加入任意培养基 50μl/孔。加入荧光素酶底物50μl/孔，2min后进行检测。结果显示，随着天麻素 浓度的升高，荧光强度减弱，且在天麻素浓度为3μg/ml和30μg/ml时，荧光强度 明显减弱(图1)。表明，天麻素在浓度为3μg/ml和30μg/ml时，对COL1A1启动 子活性有明显的抑制作用。

《实施例2》SD大鼠胆总管结扎诱导的肝纤维化模型制备

选体重在180-220g的SD雄性大鼠19只，随机分为假手术组、模型组、天 麻素给药(500mg/kg)组，其中假手术组5只，模型组7只，天麻素组7只。动 物实验前禁食12h后，用异氟烷麻醉动物进行手术。其中模型组和给药组做胆总 管结扎(BDL)，在无菌操作下，作上腹正中切口，抬高肝缘，拉开十二指肠， 分离总胆管2-3cm。在近十二指肠处和近肝门处用000号丝线各结扎两道，从中 间剪断胆总管。假手术组仅作上腹正中切口并缝合，不做胆总管结扎。动物麻醉 清醒后，正常饮食，自由饮水，肌注青霉素3天，以防感染，实验温度(22±2)℃。 造模后第2天开始灌胃给药，分别给予生理盐水(假手术组、模型组)和天麻 素500mg/kg(天麻素给药组)，每天1次，给药14天。

《实施例3》天麻素对BDL诱导的大鼠血清ALT/AST水平升高的抑制作用

取样前禁食12h，用10％水合氯醛麻醉大鼠，取腹主动脉血。800rpm离心 5min，取血清进行谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性检测。结果 显示，天麻素能够明显抑制大鼠血清中ALT和AST的含量(表1)，表明天麻 素能够改善大鼠肝功能。

表1.天麻素对BDL诱导的大鼠血清ALT/AST水平的影响

**p<0.01与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

《实施例4》天麻素对BDL诱导的大鼠肝脏病理结构改变的抑制作用

取样前禁食12h，处死大鼠，取肝脏组织，切下肝大叶组织块放入10％福尔 马林中固定。经过脱水、石蜡包埋、切片、烤片等制作石蜡切片。利用苏木素- 伊红(HE)染色液进行染色，观察大鼠肝脏组织病理结构变化情况。结果显示， 假手术组大鼠肝脏组织肝细胞规则排列，肝小叶完整，无炎性细胞浸润和胆管增 生情况；BDL后大鼠肝脏组织病理结构发生明显改变，胆管增生十分明显，组 织坏死明显增多；天麻素给药组的大鼠肝组织结构得到明显改善，胆管增生情况 得到显著抑制，组织坏死程度明显降低(图2)。表明，天麻素能够明显改善 BDL大鼠肝脏组织的病理结构。

《实施例5》天麻素对BDL诱导的大鼠肝纤维化的抑制作用

将石蜡切片用天狼星红染色，观察大鼠肝脏组织纤维化情况。结果显示，BDL 后大鼠肝脏组织纤维化程度明显增加，天麻素给药后，纤维化程度得到明显抑制 (图3)。表明，天麻素能够明显抑制BDL诱导的大鼠肝纤维化。

《实施例6》天麻素对大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量的影响

取样前禁食12h，处死大鼠，取肝脏组织，精确称取30-100mg，按照羟脯氨 酸测试盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书进行操作。结果显示，与假手 术组大鼠相比，BDL组大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量明显升高；与BDL组相比， 给药天麻素后，大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量显著降低(图4)。表明，天麻素 能够明显降低肝脏组织中羟脯氨酸的含量，即天麻素能够明显抑制BDL大鼠中 胶原纤维的产生。

《实施例7》天麻素对BDL诱导的大鼠肝脏组织氧化应激反应的抑制作用

取样前禁食12h，处死大鼠，取肝脏组织，切成小块于液氮中暂时保存，随 后转移到-80℃保存。准确称取组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1:9的比 例加入9倍体积的预冷生理盐水，于冰浴中研磨，制备匀浆，3000-4000rpm，离 心10-15min，取10％匀浆上清待测。按照丙二醛、一氧化氮(一步法)、超氧 化物歧化酶测试盒(购自南京建成生物工程研究所)的操作步骤，检测肝组织中 的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量变化。 结果显示，与假手术组的大鼠相比，BDL组的大鼠肝脏组织中MDA与NO含量 明显升高，SOD含量明显降低；与BDL组相比，天麻素给药后，大鼠肝脏组织 中MDA与NO含量显著降低，SOD含量显著升高(图5)。表明，天麻素能够 明显抑制大鼠肝脏组织的氧化应激反应。

《实施例8》天麻粉抑制Ⅰ型胶原蛋白α1启动子活性

按照《实施例1》中所述方法，检测天麻粉(市售产品，粒度250-800目)对 Ⅰ型胶原蛋白α1启动子活性的抑制作用，其中天麻粉的浓度梯度为1μg/ml、 30μg/ml、100μg/ml。结果显示，随着天麻粉浓度的升高，荧光强度减弱，且在 天麻粉浓度为30μg/ml和00μg/ml时，荧光强度明显减弱(图6)。表明，天麻粉 在浓度为30μg/ml和00μg/ml时，对COL1A1启动子活性有明显的抑制作用。

《实施例9》天麻粉对BDL诱导的大鼠血清ALT/AST水平升高的抑制作用

按照《实验例2》及《实施例3》中的方法，检测天麻粉对BDL诱导的大 鼠血清ALT/AST水平的影响。其中，天麻粉的灌胃给药量为每只大鼠每天5g/kg。 结果显示，天麻粉能够明显抑制大鼠血清中ALS和AST的含量(表2)。表明， 天麻粉能够改善大鼠肝功能。

表2.天麻粉对BDL诱导的大鼠血清ALT/AST水平的影响

**p<0.01与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

《实施例10》天麻粉对BDL诱导的大鼠肝脏组织病理结构的影响

按照《实施例4》所述方法，观察天麻粉对BDL诱导的大鼠肝脏病理结构改 变的影响。结果显示，假手术组大鼠肝脏组织细胞规则排列，肝小叶完整，无炎 性细胞浸润和胆管增生情况；BDL后大鼠肝脏组织病理结构发生明显改变，胆 管增生十分明显，组织坏死明显增多；天麻粉给药组的大鼠肝组织结构得到改善， 组织坏死程度明显降低(图7)。表明，天麻粉明显改善BDL大鼠肝脏组织的 坏死情况。

《实施例11》天麻粉对BDL诱导的大鼠肝纤维化的影响

将石蜡切片用天狼星红染色，观察大鼠肝脏组织纤维化情况。结果显示，BDL 后大鼠肝脏组织纤维化程度明显增加，天麻粉给药后，纤维化程度得到改善，但 无统计学意义(图8)。表明，天麻粉对BDL诱导的大鼠肝纤维化有一定的抑 制作用。

《实施例12》天麻粉对大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量的影响

按照《实施例6》中所述方法，检测天麻粉对大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量 的影响。结果显示，与假手术组大鼠相比，BDL组大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含 量明显升高；与BDL组相比，天麻粉给药后，大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量降 低，但无统计学意义(图9)。表明，天麻粉对大鼠肝脏中胶原纤维的产生有一 定的抑制作用。