茜草科类型环肽用作为TAK1抑制剂和其制备方法

摘要

本发明提供茜草科类型环肽用作为TAK1抑制剂和其制备方法。具体涉及用茜草科类型环肽化合物RA‐V(1)作为TAK1抑制剂，以其为活性成分的药物组合物，此类化合物的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用。与现有技术相比，本发明的方法提高了提取效率，能较快分离得到环肽，样品损失少，成本较低，操作方便，可控性和重现性好，溶剂可以反复回收利用，适用于工业生产。

说明书

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地，涉及一类茜草科类型环肽用作为TAK1 抑制剂，以其为有效成分的药物组合物，其制备方法及其在制备抗炎药物中的应 用。

背景技术

TAK1(Transforming growth factor‐βactivated kinase 1)，即转化生长因子β激 活激酶，于1995年由Matsumoto及其同事在酵母双杂交实验中发现，它能被 TGF‐β(转化生长因子β)和BMP(bone morphogenetic protein，骨形态形成蛋白) 所激活，属于色氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPKKK家族成员之一。从发现至今将 近三十年，TAK1在固有免疫中的关键生物学功能得到全面而深入地阐明：TAK1 是宿主抵抗病源微生物入侵的关键信号分子，是诱导机体相关炎症反应的细胞信 号转导通路的核心的上游激酶，在机体免疫细胞中发挥重要调控功能。例如：IL‐1、 TNF‐α和TLRs等可以直接激活TAK1，活化后的TAK1再激活MKK3/4‐P38/JNK‐AP‐1 或IKK‐NF‐κB通路，动态调节机体免疫炎症反应，从而影响肿瘤的发生与发展等 重要的生理与病理过程。

TAK1的异常活化或表达与炎症有着密切的关系，在一定程度上能导致炎症 相关疾病。已有研究表明，在类风湿性关节炎、炎症性肠病、肾脏性疾病和心血 管疾病等相关组织中，TAK1均有着不同程度的异常活化和表达。鉴于此，TAK1 已成为新的炎症治疗靶标，故其抑制剂的开发亦具有较为重要的现实意义。已报 道的该类抑制剂较少，有5Z‐7‐Oxozeaenol，thiophene carboxamide，oxindole  derivatives，epoxyquinol B等，其中5Z‐7‐Oxozeaenol(IC₅₀＝9nM)活性最强，能 通过与TAK1激酶区域的ATP结合位点共价结合而抑制其激酶活性，已成为TAK1 相关研究中应用最广泛的工具分子。截至目前，尚未有以TAK1为靶标的药物用 于临床，所以发现结构新颖的TAK1抑制剂用于治疗该激酶异常活化或表达导致 的炎症相关疾病，具有十分重要的学术意义和很好的应用前景。

现有技术中未见有茜草科类型环肽作为TAK1抑制剂的报道；此外，茜草科 类型环肽的抗炎活性也未见报道。

从茜草属植物中分离茜草科类型环肽较为困难，主要原因是茜草属植物中蒽 醌类色素含量较高且极性分布范围广，环肽类成分与其分离较为困难，难以得到 纯度较高的环肽类成分。近年来，从茜草属植物中分离环肽类成分已有若干种方 法公开发表，这些方法普遍存在提取效率低，样品损失量大，可控性和重复性差 等缺点，如邝彬等报道，用70％工业甲醇提取茜草科大叶茜草的根茎后，得甲醇 浸膏，加温水混悬后依次用乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，乙酸乙酯部分反复利 用正反相硅胶柱层析、Sephadex LH‐20凝胶柱层析富集得到总环肽部分，再结合 各种层析材料包括HPLC对环肽部位进行分离纯化，得到一系列环肽。参见：邝 彬等，大叶茜草中环肽类成分研究，中国中药杂志，2012，37(17)，2563-2570。 其缺点在于过程复杂，样品损失大，分离成本高且可控性和重现性不好。

发明内容：

针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一类茜草科类型 环肽化合物用作为新型TAK1抑制剂；提供制备该类化合物的方法；本发明的目 的还在于提供以茜草科类型环肽化合物为有效成分的药物组合物；以及在制备抗 炎药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

以下述结构式所示的茜草科类型环肽RA‐V(1)或其药理学上容许的盐为有 效成分的TAK1抑制剂，

抗炎药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的茜草科类型环肽RA‐V(1)或 其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

用茜草科植物中的茜草科类型环肽RA‐V(1)作为TAK1抑制剂。

所述的茜草科类型环肽RA‐V(1)或其药理学上容许的盐在制备TAK1抑制剂 中的应用。

所述的茜草科类型环肽RA‐V(1)或其药理学上容许的盐在制备抗炎药物中 的应用。

用茜草科植物中的茜草科类型环肽RA‐V(1)作为炎症抑制剂。

所述的茜草科类型环肽RA‐V(1)或其药理学上容许的盐在制备炎症抑制剂 中的应用。

制备所述的茜草科类型环肽化合物的方法，取茜草属植物的根和根茎，经干 燥、粉碎及甲醇浸泡过夜后，通过甲醇回流充分提取，得甲醇浸膏；结合环肽的 TLC检测方法，利用硅胶、RP‐18和Sephadex LH‐20等各种分离材料和技术进行 分离纯化，即得到茜草科类型环肽。

更具体地制备所述的茜草科类型环肽化合物RA‐V(1)的方法为，取茜草科植 物大叶茜草(Rubia schumanniana P.)的根和根茎，经干燥、粉碎及甲醇浸泡过夜 后，利用甲醇热回流提取3‐4次，每次时间为2‐4小时，提取液经减压浓缩得甲 醇浸膏；甲醇浸膏经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(100:0，95:5，9:1，8:2，7:3， 0:100)梯度洗脱，结合环肽TLC检测方法，确定含环肽馏分并合并为总环肽部 位；以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来进行分离纯化；总环肽部位经 硅胶柱层析，用100:1-8:2的氯仿/甲醇梯度洗脱，根据环肽点的不同合并为四个 组分Fr.1-Fr.4；对Fr.1组分经硅胶柱层析，石油醚/丙酮(10:1-0:1)为洗脱剂，分 离得三个亚组分Fr.1‐1–Fr.1‐3；其中Fr.1‐1亚组分经Sephadex LH‐20凝胶柱层析， 氯仿/甲醇(1:1)为洗脱剂，所富集的含有环肽的部分再经RP‐18柱层析，20％-90％ 的甲醇/水梯度洗脱，含有环肽部分再经硅胶H柱层析，石油醚/丙酮(1:1)为洗 脱剂，分离得到RA‐V(1)。

本发明对茜草科植物大叶茜草进行了环肽化学成分研究，利用多种分离纯化 手段，包括硅胶柱层析，RP‐18和Sephadex LH‐20凝胶柱层析，从中获得了茜草 科类型环肽RA‐V(1)。之后，对环肽RA‐V(1)在人肾上皮细胞系293T细胞上利用 放射性同位素标记自显影技术检测对TAK1激酶的抑制活性，发现该环肽为TAK1 激酶抑制剂；在293T细胞和人宫颈癌细胞(Hela)上利用Real‐time PCR检测该环 肽对相关炎症因子基因表达的影响，发现该环肽对炎症因子的基因表达具有很强 的抑制活性，为一类新型的炎症抑制剂。

本发明的所述茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐，可以列举例如与盐 酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、 柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对-苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸等有机酸，锂， 钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。

本发明所述的治疗炎症相关疾病的药物组合物，由茜草科类型环肽化合物与 药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻 干剂或粉针剂等。由于茜草科类型环肽可从大叶茜草以及同属植物中提取分离， 而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本 领域的常规知识。因此，由茜草科类型环肽化合物与相应载体制备的各种药物剂 型也能够由本领域技术人员实现。

上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀 释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸 收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土； 润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物 中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的 方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片 剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、 酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本 发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性 成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，最优选含 有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病 的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5 mg/kg体重。可以一次或多次施用。

本发明茜草科类型环肽提取方法的优益性在于，首先提取分离思路清晰，成 功利用色谱层析技术最大限度的富集了环肽部位并分离得到高纯度的目标环肽。 概括地说，样品干燥和粉碎后经甲醇浸泡过夜，能提高样品出膏率；甲醇浸膏直 接经硅胶柱层析，简化分离过程，减少样品损失，最大限度的获得总环肽部位； 通过正相硅胶柱层析和Sephadex LH‐20凝胶柱层析能较好的去除色素，同时快速 富集环肽；另外，本方法仅利用实验室或工业上常规的层析材料，包括正相硅胶、 Sephadex LH‐20和RP‐18。总之，本发明提取分离方法提取效率高，样品损失少， 可控性和重现性好，成本较低，操作方便，可快速分离得到目标环肽，溶剂可以 反复回收利用，也适用于工业生产。

附图说明：

图1为本发明的茜草科类型环肽化合物的制备方法流程图；

图2为本发明的茜草科类型环肽化合物抑制TAK1激酶活性实验；

图3为本发明的茜草科类型环肽化合物抑制炎症相关因子基因表达实验。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并 不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范 围。

实施例1：

茜草科类型环肽化合物RA‐V(1)制备方法：

取茜草科植物大叶茜草的根和根茎(10kg)，经干燥、粉碎及甲醇浸泡过夜 后，利用甲醇热回流提取3次(30L×3次)，时间为3h、3h和2h。提取液经 减压浓缩得甲醇浸膏(3.6kg)；甲醇浸膏经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(100:0， 95:5，9:1，8:2，7:3，0:100)梯度洗脱，结合环肽TLC检测方法，确定含环肽馏 分并合并为总环肽部位(79.2g)；以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来 进行分离纯化；总环肽部位经硅胶柱层析，用100:1-8:2的氯仿/甲醇梯度洗脱， 根据环肽点的不同合并为四个组分Fr.1-Fr.4；对Fr.1(32.6g)组分经硅胶柱层析， 石油醚/丙酮(10:1-0:1)为洗脱剂，分离得三个亚组分Fr.1‐1–Fr.1‐3；其中Fr.1‐1(3.4 g)亚组分经Sephadex LH‐20凝胶柱层析，氯仿/甲醇(1:1)为洗脱剂，所富集的 含有环肽的部分(1.4g)再经RP‐18柱层析，20％-90％的甲醇/水梯度洗脱，含 有环肽部分(458mg)再经硅胶H柱层析，石油醚/丙酮(1:1)为洗脱剂，分离得 到RA‐V(1)(240mg)。

实施例2:

本发明的茜草科类型环肽RA‐V(1)在人肾上皮细胞系293T细胞上利用放射 性同位素标记自显影技术检测对TAK1激酶的抑制活性。实验原理、方法和结果 如下：

实验原理：TAK1为MAPKKK家族成员，能磷酸化激活其底物MKK6，其被磷 酸化的程度即可反映TAK1的激酶活性。因此，在含有[γ‐³²P]ATP体外激酶反应体 系中，通过检测MKK6磷酸化条带的放射性强弱即可反映化合物抑制TAK1磷酸 化MKK6水平的强弱，从而评价其抑制TAK1激酶活性的能力。

实验方法：(1)细胞培养：293T细胞使用含有10％胎牛血清(Gibco)及含 50U/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的DMEM(Invotrogen)。培养条件为37℃、 5％的CO₂，每两天传代一次；(2)磷酸钙法转染：将293T细胞铺于10cm细胞 培养皿中，待达到60％左右的汇合度即可转染Flag‐TAK1和HA‐TAB1各4μg，6‐8 小时更换新鲜培养液，24h后细胞长满，弃去培养液，用PBS将细胞离心收集于 EP管中；(3)富集TAK1：将(2)中细胞冰上裂解，离心后收上清，加入Anti‐flag 2μl，4℃孵育过夜，然后加入20μl蛋白A/G beads，4℃孵育2h后，洗净beads 上残余液体并将其残液除尽；(4)激酶反应：将配好的激酶反应缓冲液加入到上 述beads，同时加入已纯化好的底物蛋白6×His MKK6、[γ‐³²P]ATP和一定浓度的 RA‐V(1)，最终反应体系为40μl，30℃振荡孵育30min；(5)同位素放射自显影： 在(4)体系中加入10μl5×loading，95℃加热10min，上样于10.5％SDS‐PAGE， 然后将胶抽干，磷屏压片2h后，扫描，通过Multi Gauge V3.0软件进行图像分 析。

实验结果见图2。

实验结果表明，环肽RA‐V(1)能抑制TAK1激酶活性，且呈浓度依赖性，说 明茜草科类型环肽为一类新型的TAK1天然抑制剂。

实施例3:

本发明的茜草科类型环肽RA‐V(1)在人肾上皮细胞系293T细胞和人宫颈癌 细胞Hela上利用Real‐time PCR检测该环肽对相关炎症因子mRNA水平的影响。 实验原理、方法和结果如下：

实验原理：Real‐time PCR是检测基因表达最为常用的方法。通过检测化合物 对炎症相关因子的基因表达的影响来评价化合物的抗炎能力。

实验方法：(1)细胞培养：293T细胞和Hela细胞使用含有10％胎牛血清 (Gibco)及含50U/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的DMEM(Invotrogen)。培 养条件为37℃、5％的CO₂，每两天传代一次；(2)化合物处理：将293T细胞或 Hela细胞铺于6孔板中，待细胞达到60％左右的汇合度时加入不同浓度的RA‐V(1) 处理24h，随后移去培养基，加入新鲜的含有10ng/ml TNF‐α培养基继续培养2h； (3)细胞总RNA的提取：吸净培养基，每孔加0.5mL Trizol，充分振荡15min， 待细胞完全裂解，将Trizol转移到EP管；再根据Trizol(Invitrogen)提取RNA的标 准操作方法抽提总RNA，并测定浓度；(4)Real‐time PCR：取1μg总RNA，以 oligo dT为引物，逆转录得cDNA。以该cDNA为模板，使用Power SYBR GREEN PCR  MASTER MIX(ABI)试剂进行实时荧光定量PCR，GADPH的含量作为内参，炎症相 关基因引物由上海杰李生物技术有限公司合成。

实验结果见图3。

实验结果表明，RA‐V(1)能显著抑制IL‐8、MCP‐1和E‐selectin等炎症相关 基因的表达，说明茜草科类型环肽具有较强的抗炎活性，为一类新型的炎症天然 抑制剂。

实施例4：

实施例1所得化合物1，加入4％的硫酸乙醇溶液，PH＝4，过滤，干燥，制 成硫酸盐化合物1。

实施例5：

实施例1所得化合物1，加入4％的盐酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成盐 酸盐化合物1。

实施例6：

实施例1所得化合物1，加入4％的酒石酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成 酒石酸盐化合物1。

实施例7：

实施例1所得化合物1，加入4％的柠檬酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成 柠檬酸盐化合物1。

实施例8：

片剂：实施例1所得化合物1或实施例4‐7所得的盐10mg，乳糖180mg， 淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的 混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg， 化合物含量为10mg。

实施例9：

安瓿剂：实施例1所得化合物1或实施例4‐7所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶 液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例10：

注射用冻干剂：实施例1所得化合物1或实施例4‐7所得的盐10mg，碳酸 氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min 除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1 N盐酸调节PH为5.0‐7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞， 轧盖，即得。

实施例11：

胶囊剂：实施例1所得化合物1或实施例4‐7所得的盐10mg，乳糖187mg， 硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合 物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

TAK1作为MAP3K家族成员之一，是促炎反应和细胞应激信号转导中的关键 调节蛋白，其异常活化或表达与炎症有着密切的关系。本发明首次报道了RA-V(1) 不仅能用作为TAK1抑制剂，丰富了TAK1抑制剂的种类和数目，而且能用作为抗 炎药物，开发了RA-V(1)的新用途。此外，本发明提供的RA-V(1)制备方法， 能最大限度的快速分离并富集到高纯度的目的环肽，该法提取效率高，样品损失 少，可控性和重现性好，亦适用于工业生产。