一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法

摘要

本发明提供了一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188,CGMCC No.8400以及一种用该菌株提纯高纯度的维生素甲萘醌-7的高收率方法。该方法包括以下步骤：1)将所述纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液；2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏；3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，收集液浓缩，得到甲萘醌-7粗品；4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。

说明书

本申请要求2014年03月31日提交的中国专利申请号为201410129217.2， 发明名称为“一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方 法”的发明专利申请的优先权。

技术领域

本发明涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188， CGMCC No.8400，以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法。

背景技术

由于维生素K具有促进凝血的作用,又被称为凝血维生素。近半个世纪以 来，人们对维生素K的认识仅限于其对凝血系统的影响，直到1960年 Bouckaert发现维生素K可以促进兔子的骨折愈合。1975年，Pettifor等首次 提出维生素K参与人体骨代谢的假说之后，人们对维生素K在骨骼新陈代谢 的作用才有了深入的认识。

维生素K族包括数个脂溶性的2-甲基-1,4-萘醌衍生物。天然的维生素K 包括维生素K1(即叶绿醌)和维生素K2(即甲萘醌类)，其以在2-甲基-1,4- 萘醌环状结构的3号位置上的亲脂性侧链为特征。叶绿醌的侧链是确定长度 的不饱和烃链，甲萘醌的侧链则是不确定长度的不饱和烃链。(维生素K1 即叶绿醌为一种化合物，维生素K2为一系列化合物)。

维生素K2不单有促进凝血、改善动脉硬化的作用，国外也有作者在研 究其对肝癌和白血病的作用。现在我国已进入老龄化社会，骨质疏松患者发 病率较高。大量资料研究表明，维生素K2缺乏可导致老年人髋骨骨折和骨密 度降低。维生素K2缺乏，血清未羧化骨钙蛋白水平降低，血清羧化骨钙蛋白 水平也可能降低，从而可能导致老年人骨密度降低发生髋骨骨折危险。

维生素K2作为一种营养物质，并可以作为骨代谢调整物质，覆盖全身 的作用；副作用较少，呈脂溶性，可以饭后服用，不论什么年龄都适宜使用。 (邹志强，维生素K2的研究进展，中国骨质疏松杂志，2005，11(3)：389-392)

1995年日本开始将维生素K2制剂作为改善骨量减少、疼痛的骨质疏松 症的药物销售。(王理明，维生素K2与骨质疏松，2007，26(4)：293-295)

维生素K2(2-甲基-3-全反式-聚戊烯-1,4-萘醌)或甲萘醌类是一族异戊烯 基衍生物。由5个碳原子组成的异戊二烯残基的数量可用于区分甲萘醌系化 合物。其命名规则是基于异戊二烯基的数量，例如“甲萘醌”或“MK”之后 加上基团的数量。尽管甲萘醌侧链上已经被发现最多达到15个异戊二烯基， 但在人类和动物组织中出现的只有含有2到13个异戊二烯基的甲萘醌。脱甲 基化的甲萘醌，即在2号碳原子位点上未结合的甲萘醌也已经被发现。

维生素K2的一般性名称或常用名为甲萘醌，其基本成分为甲萘醌-4 (MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一 种。

叶绿醌及2种常见的甲萘醌结构图如下所示。

维生素K1

                                                  分子量：450

甲萘醌-4

      分子量：444

甲萘醌-7

                                                  分子量：649

然而目前，还没有一种能够简单、高效的提纯维生素K2的方法，尤其 是提纯维生素K2的MK-7的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto) ST188,CGMCC No.8400以及一种用该菌株提纯维生素甲萘醌-7(MK-7)的 方法。该方法简单高效，并且能够获得维生素MK-7较高的纯度和收率。

本发明所提供的纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188，保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏日期：2013年10月31日，保藏号为:CGMCC No. 8400。

本发明提供的提纯维生素甲萘醌-7的方法包括以下步骤：

1)将纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉， 获得浸溶液，所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188， 保藏号为:CGMCC No.8400；

2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏；

3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，将收集 液浓缩，得到甲萘醌-7粗品；

4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7 纯品。

美国大豆出口理事会(USSEC)定义纳豆为发酵大豆制品。亚洲部分国 家的日常食物均为发酵大豆制品，包括酱油、味噌、腐乳、纳豆、天贝、豆 豉、霉豆渣、酱糗子等。发酵大豆制品的不同之处在于，大豆作为酶解基质 有时与谷物结合使用，参与发酵过程的微生物亦有所不同。而纳豆是完全以 大豆经过芽孢杆菌或纳豆枯草杆菌发酵而来的。本申请所述的纳豆菌发酵液 是以黄豆粉经过纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)发酵而获得的发 酵液。所述纳豆枯草芽孢杆菌可以从市购的日本传统食品纳豆中分离获得。

根据本发明的一个实施方式，所述纳豆菌发酵液可以为将所述纳豆枯草 芽孢杆菌ST188接种在含有10-50g/1000mL黄豆粉和5-45g/1000mL蔗糖的 培养基中，在30-40℃，经过20-48小时发酵获得纳豆菌发酵液，其中所述 纳豆枯草芽孢杆菌ST188的接种浓度为5-20％。

根据本发明的一个实施方式，在喷雾干燥(本发明中简称：喷干)所述 纳豆菌发酵液之前，通过向所述纳豆菌发酵液中添加大豆油，可以有效保护 所述纳豆菌发酵液中维生素MK-7不被喷干过程的高温破坏，因此，有助于 提高MK-7的收率。

根据本发明的一个实施方式，只要向所述纳豆菌发酵液中添加的大豆油 即可有利于提高维生素MK-7的收率。优选情况下，向纳豆菌发酵液中添加 0.1-1重量％的大豆油，更有利于提高维生素MK-7的收率。

根据本发明的一个实施方式，在步骤1)中，将喷干水分控制在3％以下， 从而有利于MK-7的提取。同时，采用喷干粉来提取，比发酵液直接用有机 溶剂萃取，可以减少80％的有机溶剂的用量，同时因为含水少而有利于减压 浓缩。

根据本发明的一个实施方法，在步骤1)中，用溶剂提取或浸溶纳豆菌 发酵液喷干粉的条件包括：将纳豆菌发酵液喷干粉与溶剂按1：3-8的质量比 混合，更优选以1：3-6的质量比混合，在15-40℃的温度下，以20-60rpm 搅拌速率搅拌20-40min，固液分离，所得清液即为浸溶液。其中，固液分离 可以采用本领域技术人员已知的任意一种固液分离方式，例如静置沉淀、过 滤、离心分离等方法中的任意一种或多种结合的方式。此外，对于所得固体 可以进行多次提取或浸溶(多次提取或浸溶可以尽可能提高收率)。

根据本发明的一个实施方式，在步骤1)中，所述溶剂选自甲醇、石油 醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯和75-100体 积％乙醇中的一种或多种。更优选情况下，所述溶剂选自石油醚、丙酮、二 氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯和75-100体积％乙醇中的一种或多种。

根据本发明的一个实施方式，在步骤2)和步骤3)中，所述浓缩可以为 减压浓缩或蒸发浓缩。本发明优选减压浓缩。所述减压浓缩的条件包括：温 度为40-95℃，真空度小于3000Pa。

根据本发明的一个实施方案，将步骤2)获得的浸膏以湿法上柱脱色包 括：将硅胶和石油醚按1:1.5-2质量比混匀后装柱，再将步骤2)获得的浸膏 和石油醚按1:0.5-1质量比混匀后上柱。

根据本发明的一个实施方案，在步骤3)中，所述柱层析的方法包括： 首先将步骤2)获得的浸膏以湿法上柱脱色，并以第一淋洗剂洗脱；然后将 脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化，即先以湿法装柱，再将脱 色后的产物以干法装柱的方式装填于湿法装柱的上层，并以第二淋洗剂洗脱， 其中湿法干法混合上柱的柱中，湿法装柱与干法装柱的体积比为1：0.2-2。

根据本发明的一个实施方式，在步骤3)中，所述第一淋洗剂为非极性 溶剂，优选为石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种。所述第一淋洗剂的 用量为层析柱体积的2-3倍。

根据本发明的一个实施方式，将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式 进行纯化包括：先将硅胶和石油醚以1：1.5-2的质量比混匀后装柱；再将脱 色后的产物与硅胶和石油醚以1：3-4：4-5的质量比混合、阴干后装填在先以 湿法装填的柱中。

根据本发明的一个实施方式，所述在湿法干法混合上柱的柱中，所述湿 法装柱与所述干法装柱的体积比为1：0.2-2(即1-10：2)时，即可有利于提 高维生素MK-7的收率，优选情况下，所述湿法装柱与所述干法装柱的体积 比为1：0.5-1(即1-2：1)，更有利于提高维生素MK-7的收率。本发明通过 采用湿法干法混合上柱的柱层析，可以更有效的吸附杂质，分离效果更好， 并且适当的提高湿法装柱与干法装柱的体积比可以提高产品纯度；另外， MK-7纯度与收率较高的同时填料用量也较少。

根据本发明的一个实施方式，所述柱层析可以为硅胶柱层析、大孔树脂 柱层析、Sephadex LH20凝胶柱层析和聚酰胺柱层析中的任意一种或其组合。

根据本发明的一个实施方式，所述湿法装柱和所述干法装柱中使用的硅 胶可以为本领域技术人员已知的能够用于层析柱的硅胶。优选情况下，所述 硅胶为100-400目之间，小孔(例如，比表面积≥550m²/g，孔容≤0.7mL/g)、 中孔(例如，比表面积为大于300m²/g至小于550m²/g，孔容为大于0.7mL/g 至小于0.9mL/g)或粗孔(例如，比表面积为200m²/g至小于300m²/g，孔 容为≥0.85mL/g)的硅胶。

根据本发明的一个实施方式，在步骤3)中，柱层析分离的方法可以采 用本领域技术人员已知的方法，本发明没有特别要求。例如柱层析分离可以 在低压(小于0.5MPa)、中压(0.5-5MPa)或高压(大于5MPa至40MPa) 下进行分离。

根据本发明的一个实施方式，在步骤3)中，所述第二淋洗剂选自石油 醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、正丁醇、 丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和水中的一种或多种。更优选情况下，所述第二淋 洗剂选自石油醚、体积比为1：9的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为 1：9的三氯甲烷和石油醚的混合物。所述第二淋洗剂的用量为：所述石油醚 的用量为层析柱体积的10-15倍，所述体积比为1：9的二氯甲烷和石油醚的 混合物的用量为层析柱体积的4-5倍，所述体积比为1：9的三氯甲烷和石油 醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍。

根据本发明的一个实施方式，在步骤4)中，将所述甲萘醌-7粗品结晶 提纯包括：将所述甲萘醌-7粗品用溶剂进行结晶以及重结晶。优选情况下， 所述溶剂可以选自石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙 酯、异丙醇、正丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和水中的一种或多种。

根据本发明的一个实施方式，在步骤4)中，可以采用蒸发结晶或冷却 结晶，结晶的温度可以为-10℃至95℃。优选地，在结晶析出过滤后，洗涤 结晶，并进行重结晶，以提高最终获得的甲萘醌-7的纯度。

根据本发明的方法，能够获得纯度和收率较高的维生素MK-7。优选情况 下，通过向纳豆菌发酵液中添加0.1-1重量％的大豆油，有效保护了所述纳豆 菌发酵液中维生素MK-7不被喷干过程的高温破坏，从而提高了纳豆菌发酵 液中维生素MK-7的量，提高了维生素MK-7的收率；同时，通过湿法上柱 脱色以及湿法干法混合上柱纯化的方式，简化了纯化步骤，提高了效率，并 且提高了维生素MK-7的纯度。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与 下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在 附图中：

图1是根据本发明实施例1的方法获得的产物的液相色谱图。

图2是根据本发明实施例1的方法获得的产物的H谱。

图3是根据本发明实施例1的方法获得的产物的C谱。

图4是根据本发明实施例1的方法获得的产物的DEPT135谱。

图5是根据本发明实施例1的方法获得的产物的COSY谱。

图6是根据本发明实施例1的方法获得的产物的HSQC谱。

图7是根据本发明实施例1的方法获得的产物的HMBC谱。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明 内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明技术特征所作的 等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

以下实施例中所用试剂均来自商购。

核磁共振谱通过Bruker Avance III-600MHz核磁共振波谱仪获得。

维生素MK-7的纯度通过美国waters公司高效液相色谱仪测量。

维生素MK-7的收率通过下式计算：

MK-7的收率＝MK-7纯品纯度×MK-7纯品重量×100％/(发酵液中 MK-7浓度×发酵液体积)

实施例1

制备纳豆菌发酵液：

将纳豆(购自日本生物科技公司)用无菌水溶解、稀释后涂抹在琼脂糖- 纤维蛋白平板(制作方法参见：魏华、赵祥颖、刘建军，纳豆激酶的活性测 定[J].山东轻工业学院学报，2007,21(1)60-63.)上，在37℃培养18h后产生 透明圈，选择透明圈较大的菌落利用紫外线(15s)多代诱变，得到纳豆枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188(菌种保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏 日期：2013年10月31日，保藏号为:CGMCC No.8400)。

将500mL所得纳豆枯草芽孢杆菌ST188接种在含有185g黄豆粉和185g 蔗糖的10000mL培养基中，在37℃，经过24小时发酵获得纳豆菌发酵液。

(1)向1000g纳豆菌发酵液中添加5g的大豆油然后在90℃喷干，用 240g的甲醇浸溶40g纳豆菌发酵液喷干粉，所述浸溶在20℃以40rpm搅 拌速率搅拌30min的条件下进行，固液分离后获得浸溶液；将获得的固体采 用相同的浸溶条件进行第二次浸溶；

(2)将步骤(1)获得的浸溶液过滤后在55℃，2600Pa下减压浓缩， 得到浸膏；

(3)先将8g硅胶与石油醚按1：2质量比混匀后装柱，再将步骤(2) 获得的8g浸膏与石油醚以1：1的质量比湿法装柱，并用40g石油醚作为第 一淋洗剂进行洗脱(在0.1MPa)1次；

(4)先将硅胶和石油醚以1：2的质量比混匀后湿法装柱，再将步骤(3) 用第一淋洗剂洗脱获得的脱色产物与硅胶和石油醚以1：3：4的质量比混合、 阴干后装填在先以湿法装填的柱中，湿法装柱与干法装柱的体积比为1：1， 并用80g体积比为1：9三氯甲烷和石油醚的混合物作为第二淋洗剂进行洗 脱(在1MPa下)1次，通过此操作可以一步纯化就得到纯度为40％的维生 素MK-7；

(5)将步骤(4)获得的混合物用其30倍质量的正丁醇溶解，然后蒸发 结晶，对获得的晶体进行重结晶，最终获得的产物经高效液相色谱仪获得的 色谱图如图1所示、产物的氘代氯仿溶液的H谱如图2所示、C谱如图3所 示、DEPT135谱如图4所示、COSY谱如图5所示、HSQC谱如图6所示， 以及HMBC谱如图7所示。

¹H NMR(600.13MHz,CDC13)：δ1.563(6H,s),δ1.92(12H,s),δ1.676 (3H,s),δ1.677(3H,s),δ1.901-2.104(24H,m),δ2.188(3H,s),δ3.350-3.394 (2H,d),δ4.992-5.146(7H,m),δ7.658-7.710(2H,m),δ8.052-8.110(2H, m)；¹³C NMR(150.92MHz,CDC13):δ12.68,16.02,16.43,17.69,25.70,26.01, 26.50,26.67,26.70,26.77,39.73,119.06,123.84,124.14,124.26，124.40,126.19, 126.31,131.25,132.15,132.18,133.27,133.33,134.89,134.92,135.23,137.56, 143.35,146.16,184.52,185.46。

根据谱图解析，可认为该产物核磁共振氢谱、碳谱及化学位移相关谱与 维生素甲萘醌-7的结构式相符，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

另外，由图1可以看出最终获得的产物中含有大量的维生素MK-7。经色 谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为95％，所得维生素MK-7的收率为 93％。

实施例2

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是， 在步骤(4)中，湿法装柱与干法装柱的体积比为2：1。

最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY 谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为99％，所得维生素 MK-7的收率为93％。

实施例3

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是， 在步骤(4)中，湿法装柱与干法装柱的体积比为1：2。

最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY 谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为93％，所得维生素 MK-7的收率为92％。

实施例4

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是， 在步骤(4)中，先将硅胶和石油醚以1：1.5的质量比混匀后湿法装填柱的 部分，再将步骤(3)获得的混合物脱色后与硅胶和石油醚以1：4：5的质量 比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。

最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY 谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为94％，所得维生素 MK-7的收率为93％。

实施例5

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是， 在步骤(1)中，向1000g纳豆菌发酵液中添加10g的大豆油。

最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY 谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为96％，所得维生素 MK-7的收率为95％。

实施例6

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是， 在步骤(1)中，向1000g纳豆菌发酵液中添加1g的大豆油。

最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY 谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为95％，所得维生素 MK-7的收率为90％。

实施例7

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是， 在步骤(1)中，向纳豆菌发酵液中不添加大豆油。

最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY 谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为93％，所得维生素 MK-7的收率为80％。

实施例8

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是， 在步骤(4)中，层析柱直接采用干法装柱即步骤(3)所获得产物与硅胶和 石油醚按1：4：4质量比混匀后阴干，再装柱，用10倍柱床体积的石油醚淋 洗，一步纯化后的MK-7纯度为30％。为了获得较高的产物纯度，进行3次 重复。

最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY 谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。

同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为90％，所得维生素 MK-7的收率为90％。

通过以上实施例可以看出，采用本发明提供的提纯维生素MK-7的方法， 能够获得纯度较高，收率较高的维生素MK-7。

本申请包括但不限于以上实施例，凡是在本申请精神的原则下进行的任 何等同替代或局部改进，都将视为在本申请的保护范围之内。