超高效液相色谱法检测血清中9种脂溶性维生素的分析试剂盒

摘要

本发明公开了一种超高效液相色谱法检测血清中9种脂溶性维生素的分析试剂盒，所述的9种脂溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；所述试剂盒包括如下试剂：洗脱液A、洗脱液B、洗脱液C、标准品母液、稀释液1、稀释液2、萃取液、质控品QC(L)、QC(M)、QC(H)。本发明试剂盒与现有技术相比具有如下优势：本发明试剂盒适用于超高效液相色谱法检测血清中9种脂溶性维生素的分析方法；该方法可以节省样品、节约时间、节约成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，属于分 析检测技术领域。

背景技术

脂溶性维生素泛指可溶于脂肪及脂溶剂的一类维生素。本发明主要针对其中对人体 正常生长代谢及机能调节至关重要的9种维生素进行分析，包括维生素A、α-生育酚、 γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素。

其中，维生素A对于良好的视力、胚胎和婴儿的正常发育、免疫系统的功能、生长、 骨骼的形成、繁殖及伤口的愈合都是必不可少的；α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚是维 生素E的三种常见形式，它们是高度活跃的自由基清除剂，保护脂质膜不被氧化，α– 生育酚阻抑了蛋白酶C的活性，γ–生育酚作为活性氮氧化物，是一种对抗在体内引发疾 病的化合物的强大后卫；胡萝卜素中比较重要的β-胡萝卜素可以转换成维生素A，胡萝 卜的摄入有助于消除动脉硬化、癌症、眼疾等疾病的发生；蕃茄红素是目前被发现的最 强抗氧化剂之一，它可以有效防治因衰老、免疫力下降引起的各种疾病；辅酶Q10是一 种强还原剂，能防止脂质过氧化；叶黄素是一种性能优异的抗氧化剂，可抵御氧自由基 在人体内造成细胞与器官损伤，另外对于保护视力、降低白内障的发生率、延缓动脉硬 化、抗癌等都有非常重要的意义。

上述这些脂溶性维生素与人体正常生长发育，代谢功能都息息相关，其在血清中含 量的检测对考察这些物质在体内的代谢途径、探查疾病机理以及考察某些药物的作用效 果等等都有着指导意义。目前尚未见同时检测这9种物质的方法及试剂盒的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够利用超高效液相色谱技术同时测定血 清中9种脂溶性维生素的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种超高效液相色谱法检测血清中9种脂溶性维生素的分析试剂盒，所述的9种脂 溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜 素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；

所述试剂盒包括如下试剂：

(1)洗脱液：

洗脱液A：0.1％v/v三氟乙酸水溶液；

洗脱液B：乙醇；

洗脱液C：0.1％v/v三氟乙酸甲醇溶液；

(2)标准品母液：含有维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β- 胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素标准品的乙醇溶液；

(3)稀释液：

稀释液1：空白血清基质溶液；

稀释液2：乙醇；

(4)萃取液：正己烷；

(5)质控品：含有维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡 萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素标准品的空白血清基质溶液，分高中低三个浓度 分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。

其中，标准品母液为含有7.04μg/mL维生素A、14.58μg/mLα-生育酚、8μg/mLγ-生 育酚、4μg/mLδ-生育酚、4μg/mLα-胡萝卜素、6.85μg/mLβ-胡萝卜素、9.8μg/mL辅酶Q10、 3.6μg/mL番茄红素和1.96μg/mL叶黄素标准品的乙醇溶液。

表1 9种脂溶性维生素质控品对应浓度(单位μg/mL)

其中，所述的空白血清基质溶液为40mg/mL牛血清蛋白的水溶液。

QC(L)，QC(M)，QC(H)中9种脂溶性维生素的浓度见表1。

其中，所述的血清为人或动物的血清。

上述试剂盒的制备方法，包括

(1)洗脱液：

洗脱液A：配制0.1％v/v三氟乙酸水溶液；

洗脱液B：乙醇；

洗脱液C：配制0.1％v/v三氟乙酸甲醇溶液；

(2)标准品母液：

分别称取维生素A 8.8mg、δ-生育酚10mg、γ-生育酚10mg、α-生育酚9.11mg，分 别加入1mL含有0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另称取α-胡萝卜素10mg、 β-胡萝卜素17.12mg、蕃茄红素10mg、辅酶Q105mg、叶黄素20mg分别定容于2mL、 10mL、1mL、1mL、10mL正己烷中，分别得到各自标准品母液；分别从维生素A、α- 生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚母液中移取40μL、80μL、40μL、20μL标准品母液用乙醇 定容至1000μL得到校正液A，分别从α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、蕃茄红素、辅酶Q10、 叶黄素母液中移取40μL、200μL、20μL、100μL、50μL标准品母液用正己烷定容至1000μL 得到校正液B，分别取A、B各20μL用乙醇定容至1000μL，得到9种维生素标准品混 合母液C，即得；

(3)稀释液：

稀释液1：将4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得；

稀释液2：乙醇；

(4)萃取液：正己烷；

(5)质控品：取标准品母液40μL、100μL、400μL分别用空白血清基质溶液定容 至1000μL得到QC(L)、QC(M)和QC(H)。

上述试剂盒在利用超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素中的应用。

具体应用方法为：采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶 性维生素，通过样品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量， 具体色谱条件为：

(1)色谱柱型号：BEH C18 1.7μm*2.1μm*50mm；

(2)流动相：

流动相A：洗脱液A；

流动相B：洗脱液B；

流动相C：洗脱液C；

流动相梯度见表2，流动相按照表2中的梯度保留时间均匀变化；

表2 流动相梯度洗脱参数

表3 波长切换参数

(3)流速：初始流速0.2mL/min，匀速提升至4.51分钟时升到0.3mL/min，8.51分 钟再匀速下降，至8.6分钟时降至0.2mL/min；；

(4)柱温：30℃；

(5)采用可调紫外可见光检测器，进行多波长切换，具体波长切换条件见表3；

(6)进样量：1μL。

其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清加入1.5mL 离心管中，向其中加入200μL冷冻稀释液2(所述的冷冻稀释液2为在－20℃条件下放 置30min以上)涡漩2min，加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己 烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，取出上清液，离心后的沉淀部分 加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min， 3000rpm离心20min，合并上清液，氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻稀释液2(所 述的冷冻稀释液2为在－20℃条件下放置30min以上)复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。

其中，所述的标准品按如下方法处理得到：分别取标准品母液(也就是9种维生素 标准品混合母液C)中的12.5μL、25μL、50μL、200μL、500μL用稀释液1定容至1000μL， 得到5个浓度标准校正点S1、S2、S3、S4、S5，具体数值见表4；将上述所得S1、S2、 S3、S4、S5五个浓度标准校正点各取200μL转移至1.5mL离心管中，向其中加入200μL 稀释液2，涡旋数秒，加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液， 1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，待离心结束后，取出上清液，离心后的沉 淀部分加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩 10min，3000rpm离心20min，合并上清液，在氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻 稀释液2(所述的冷冻稀释液2为在－20℃条件下放置30min以上)复溶涡旋60s，过 0.2μm滤膜。

表4 9种维生素对应线性浓度范围单位μg/mL

有益效果：本发明试剂盒与现有技术相比具有如下优势：本发明试剂盒适用于超高 效液相色谱法检测血清中9种脂溶性维生素的分析方法；该方法可以

1、节省样品，200微升样品，可以实现9种脂溶性维生素分析；

2、节约时间，将最佳吸收波长不同的九种目标组分整合在一个方案中在12.5分钟 内可以完成分离分析；

3、节约成本，避免大量有机试剂消耗及仪器损耗。

附图说明

图1为试剂盒内部模拟图。

图2为9种脂溶性维生素标准品色谱图。

图3为血清样品中9种脂溶性维生素色谱图。

图4为9种脂溶性维生素标准品的线性曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

以下实施例所用的仪器和材料来源如下：

(1)仪器：超高效液相色谱仪(UPLC，美国Waters公司，H-class型)；医用高速 冷冻离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；超纯水仪(成都优普超纯科技有限公司)； 多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；快速混匀器(姜堰市康泰医疗器材厂)；氮 吹仪(MD200，杭州奥盛仪器有限公司)；可调移液器(Thermo Scientific 5～50μL，10～ 100μL，20～200μL，100～1000μL)；玻璃仪器、烧杯、量筒等。

(2)试剂耗材：甲醇(HPLC级，Tedia High Purity Solvent Company.Inc)；乙醇 (HPLC级，Anaqua Chemicals Supply)；正己烷(HPLC级，Scharlab S.L)；三氟乙酸 (Sigma-Aldrich)；超纯水；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(Sigma-Aldrich)； BSA(Sigma-Aldrich)；BEH-C18色谱柱(Waters公司)；

(3)标准品：维生素A、δ-生育酚、γ-生育酚、α-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜 素、蕃茄红素、辅酶Q10、叶黄素(分别购自国药生物制品检定所和Sigma公司)。

实施例1：

分析试剂盒中各组分见表5。

表5 9种维生素分析试剂盒组分的制备

上述试剂盒的制备方法：

，包括

(1)洗脱液：

洗脱液A：配制0.1％v/v三氟乙酸水溶液；

洗脱液B：乙醇；

洗脱液C：配制0.1％v/v三氟乙酸甲醇溶液；

(2)标准品母液：

分别称取维生素A 8.8mg、δ-生育酚10mg、γ-生育酚10mg、α-生育酚9.11mg，分 别加入1mL含有0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另称取α-胡萝卜素10mg、 β-胡萝卜素17.12mg(纯度99.9％)、蕃茄红素10mg(纯度90％)、辅酶Q105mg(纯 度98％)、叶黄素20mg(纯度98％)分别定容于2mL、10mL、1mL、1mL、10mL正己 烷中，分别得到各自标准品母液；分别从维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚母 液中移取40μL、80μL、40μL、20μL标准品母液用乙醇定容至1000μL得到校正液A， 分别从α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、蕃茄红素、辅酶Q10、叶黄素母液中移取40μL、200μL、 20μL、100μL、50μL标准品母液用正己烷定容至1000μL得到校正液B，分别取A、B 各20μL用乙醇定容至1000μL，得到9种维生素标准品混合母液C，即得；

(3)稀释液：

稀释液1：将4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得；

稀释液2：乙醇；

(4)萃取液：正己烷；

(5)质控品：取标准品母液40μL、100μL、400μL分别用空白血清基质溶液定容 至1000μL得到QC(L)、QC(M)和QC(H)。

试剂盒内部的模拟包装参考图1。试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置洗 脱液A、B、C，左下方分别放置4*1mL安瓿瓶，分别为标准液和质控品；右边分别放 置10mL稀释液1、20mL稀释液2和100mL萃取液。

实施例2：

采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶性维生素，通过样 品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量，具体色谱条件为：

(1)色谱柱型号：BEH C18 1.7μm*2.1μm*50mm；

(2)流动相：

流动相A：洗脱液A；

流动相B：洗脱液B；

流动相C：洗脱液C；

流动相梯度见表2，流动相按照表2中的梯度保留时间均匀变化；

(3)流速：初始流速0.2mL/min，匀速提升至4.51分钟时升到0.3mL/min，8.51分 钟再匀速下降，至8.6分钟时降至0.2mL/min；

(4)柱温：30℃；

(5)采用可调紫外可见光检测器，进行多波长切换，具体波长切换条件见表3；

(6)进样量：1μL。

其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清加入于1.5mL 离心管中，向其中加入200μL冷冻稀释液2(所述的冷冻稀释液2为在－20℃条件下放 置30min以上)涡漩2min，加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己 烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，取出上清液，离心后的沉淀部分 加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min， 3000rpm离心20min，合并上清液，氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻稀释液2(所 述的冷冻稀释液2为在－20℃条件下放置30min以上)复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。

其中，所述的标准品按如下方法处理得到：分别取标准品母液(也就是9种维生素 标准品混合母液C)中的12.5μL、25μL、50μL、200μL、500μL用稀释液1定容至1000μL， 得到4个浓度标准校正点S1、S2、S3、S4、S5，具体数值见表3；将上述所得S1、S2、 S3、S4、S5五个浓度标准校正点各取200μL转移至1.5mL离心管中，向其中加入200μL 稀释液2，涡旋数秒，加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液， 1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，待离心结束后，取出上清液，离心后的沉 淀部分加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩 10min，3000rpm离心20min，合并上清液，在氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻 稀释液2(所述的冷冻稀释液2为在－20℃条件下放置30min以上)复溶涡旋60s，过 0.2μm滤膜。

其中，所述的质控品按如下方法处理得到：分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H) 各200μL,转移至1.5mL离心管中，向其中加入200μL稀释液2，涡旋数秒，加入800μL 冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm 离心20min，待离心结束后，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻0.4g/L 2， 6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合 并上清液，在氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻稀释液2(所述的冷冻稀释液2为 在－20℃条件下放置30min以上)复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。质控品用于检测人员 快速检验方法的准确性，当QC(L)，QC(M)和QC(H)的检测浓度与真实浓度误差在5％ 以内，证明本检测方法可以比较准确的用于检测。

实施例3：性能验证。

1.标准品分离谱图：9种脂溶性维生素完全分离，峰型比较对称，基本上没有杂峰 干扰，说明在此条件下能够得到良好的分离，色谱图见图2。

表6 批内精密度试验结果

表7 批间精密度试验结果

2.血清样品分离谱图：血清样品中9种脂溶性维生素完全分离，有部分杂峰，但 对于目标峰来说没有影响，血清中9种脂溶性维生素对应的色谱图见图3。

3.精密度试验：取正常人血清样品一次重复处理6批，以外标法定量测定9种脂 溶性维生素浓度，批内精密度(CV％)范围为0.487％～3.942％，结果见表6；另外取 正常人血清样品分10批进行重复处理，以外标法定量测定9种脂溶性维生素浓度，计 算批间精密度(CV％)范围为1.40％～6.93％。结果见表7。

4.线性范围试验：按照配制好不同浓度的标准品溶液，以浓度为横坐标(X)，对应 的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，9种脂溶性维生素的线性回归方程及相关系数见 表8，在对应浓度(见表4)范围内线性良好(线性曲线见图4，表8)，相关系数为0.9985～ 1.000，平行测定6次相对标准偏差小于4％。

表8 9种脂溶性维生素线性回归方程及线性相关系数

本方法通过单通道在不同时间多波长之间切换来实现一次进样同时分离并检测9种 脂溶性维生素，即保证了检测灵敏度，又可以节省大量有机试剂，在前处理提取方面也 可以提高分析效率，在准确度、精密度方面均可以达到我们对脂溶性维生素检测的要求， 可作为人体血清中脂溶性维生素检测分析的可靠方法。

从不同批次处理的结果来看，批内与批间都有不同程度的差异性，因部分维生素如 维生素A对氧、酸、紫外线敏感，胡萝卜素类像番茄红素易被氧化，辅酶Q10见光易 降解，这些影响因素均会导致测试结果偏差，为尽量排除外界环境干扰，在整个处理过 程中，都要在暗室中进行操作，提取液中要加入抗氧化剂且尽量冷冻试验过程中所用试 剂，排除溶解氧的干扰。

本方法实现9种脂溶性维生素同时提取，试剂用量少，灵敏度高，分析时间12.5min， 稳定性好，是准确、快速、稳定、可靠的分析方法。