保留组织纹理结构使完整器官透明的方法及相应混合液

摘要

本发明公开了一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法及相应混合液，其核心是配制一种包含糖类、离液剂和抗氧化剂的混合液/混合液组合。本发明所用混合液/混合液组合是粘度较低、无刺激性挥发气味的透明液体，利用该溶液透明完整器官的方法操作简便、透明速度快、透明效果好，透明过程中无需特殊防护，透明后器官形态大小不变，器官基本维持天然本色，器官内部天然纹理结构保留，并与其他常用荧光标记技术兼容，且本发明的方法作用力强，可使体型较大成年哺乳动物的器官透明。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学和透明标本制备领域，更具体地，涉及一种保留 组织纹理结构、使完整器官透明的方法及相应混合液。

背景技术

全面准确地了解器官的内部结构及其神经血管走向情况是神经科学 乃至整个生物医学研究领域不可或缺的基础，但组织不透明阻碍了对于大 多数器官的全局式观察。

组织透明技术(特别是整脑透明技术)使得器官不必切片，即可在完 整状态下进行观察研究。现有组织透明技术包括美国专利US6472216中以 及Chiang，A.S.等人提出的FocusClear技术(参见Chiang，A.S.，et al.“Insect  NMDA receptors mediate juvenile hormone biosynthesis”，Proc Natl Acad Sci. U S A 99，37-42(2002))、Dodt，H.U.等人提出的BABB技术(参见Dodt， H.U.，et al.“Ultramicroscopy：three-dimensional visualization of neuronal  networks in the whole mouse brain”，Nat.Methods 4，331-336(2007))、PCT 专利WO2011111876A1、中国专利CN102859344A中以及Hama，H.等人提 出的Scale技术(参见Hama，H.，et al.“Scale：a chemical approach for  fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain”，Nature  neuroscience 14，1481-1488(2011))、Erturk，A.等人提出的3DISCO技术 (参见Erturk，A.，et al.“Three-dimensional imaging of solvent-cleared  organs using 3DISCO”，Nature protocols 7，1983-1995(2012))、Ke，M.T. 等人提出的SeeDB技术(参见Ke，M.T.，Fujimoto，S.&Imai，T.“SeeDB：a  simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit  reconstruction”，Nature neuroscience 16，1154-1161(2013))、PCT专利 WO2014025392A1中以及Chung，K.等人提出的CLARITY(参见Chung，K.， et al.“Structural and molecular interrogation of intact biological systems”， Nature 497，332-337(2013))。

其中，FocusClear技术使用二甲基亚砜、泛影酸、泛影葡胺等成分， 成本高昂，并且导致生物样品严重皱缩，适用于处理昆虫标本，无法使成 年哺乳动物器官透明。

BABB技术和3DISCO技术均使用有机溶剂，处理后组织透明效果很 好，但是处理后的组织严重皱缩，并且容易导致组织中荧光标记信号淬灭。 此外，这些有机溶剂带有强烈刺激性气味，操作过程中常令操作者产生头 疼、恶心等不适。

Scale技术利用恒定浓度(4M或更高)的尿素和少量表面活性剂(如 Triton X-100)组成的混合液持续浸泡器官。该方法透明需要时间较长，即 便是对于新生小鼠整脑也至少三周以上。此外，Scale技术引起组织严重 膨胀。

SeeDB技术使用浓度不断增加的梯度果糖溶液浸泡组织，最后一步必 须使用饱和浓度的果糖(质量体积分数为130％)，在透明速度和透明效果 方面均优于单纯使用尿素的方法。SeeDB技术组织形态保持良好，并与组 织内荧光标记兼容良好，但往往导致组织变为棕褐色(即棕色变)。另外， 115％以上浓度的果糖溶液非常粘稠，无论是更换溶液还是在溶液中操作组 织样品，均非常困难。特别是质量体积分数为130％的果糖溶液必须在37 度下才具有微弱流动性，若温度降低，该溶液即很快凝固或者造成果糖再 度析出，从而影响组织透明或者妨碍观察。

CLARITY技术利用电泳法去除组织中引起散射的脂类物质得以实现 透明。该方法组织透明效果很好。不过，采用该方法透明组织需要使用特 殊的水凝胶预先固定组织，并使用一套特殊的电泳装置方可实现，且水凝 胶储存与灌注过程均需低温条件，整个操作过程严格、繁琐，最优实验条 件范围很窄，难以推广使用。此外，该方法因为溶脂造成细胞膜被破坏、 组织天然纹理结构消失。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种兼具保留器官 内部天然纹理结构、保存荧光标记信号的快速简便的完整器官透明方法及 相应混合液。

为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种保留 组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，包含糖类、离液剂和抗氧化剂。

其中，所述糖类选自单糖和二糖中的至少一种。

其中，所述单糖为果糖。

其中，所述二糖为蔗糖。

其中，所述离液剂选自盐酸胍、氯化锂、尿素、硫脲中的至少一种。

其中，所述抗氧化剂选自巯基乙醇、3-巯基-1，2-丙二醇、硫辛酸中的 至少一种。

其中，所述糖类的质量体积分数为10～100％。

其中，所述离液剂的质量体积分数为5～50％。

其中，所述抗氧化剂的质量体积分数为0.5～5％。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种保留组织纹理结构、 使完整器官透明的混合液组合，所述梯度混合液组合包括N种如上任一项 所述的混合液，其中所述N种混合液的糖类浓度逐渐增加，离液剂浓度逐 渐降低，N为2-20之间的正整数。

其中，N为5-10。

其中，当N＝5时，所述N种混合液的糖类的质量体积分数分别为 10-40％、40-60％、60-80％、80-90％、100％。

其中，当N＝5时，所述N种混合液的糖类的质量体积分数分别为 10-35％、35-40％、40-60％、60-90％、100％。

作为本发明的再一个方面，本发明还提供了一种保留组织纹理结构、 使完整器官透明的方法，包括下列步骤：使用如上任一项所述的混合液组 合依次处理固定后的完整器官标本，实现透明；其中，体型较小动物的器 官可依次在所述混合液组合的各种混合液中持续浸泡，体型较大动物的器 官可依次经血管灌注所述混合液组合的各种混合液。

其中，先使用糖类浓度最小的混合液处理所述完整器官标本，再依次 逐步使用浓度更大一级的混合液处理所述完整器官标本。

其中，对于浓度为10-40％的混合液需处理1～12小时，对于浓度为 60-80％的混合液需处理1～4小时，浓度为100％的混合液需处理1～12小时。

其中，在使用所述混合液组合的各种混合液处理完所述完整器官标本 之后，再使用糖类浓度为100％的混合液浸泡12-24小时。

通过上述技术方案可知，本发明整个操作过程简单，不需要特殊实验 装置；所用混合液无刺激性气味挥发，不需要特殊防护，且透明效果确定、 透明速度较快，不会引起组织严重变形、变色；本发明方法既能与常用荧 光标记技术兼容，又能保留器官内部的天然纹理结构；此外，不仅可使体 型较小成年哺乳动物的器官透明，也可使体型较大成年哺乳动物的器官透 明。

附图说明

图1是本发明100％浓度的混合液溶液流动性测试的液面移动对比示 意图；

图2是成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的梯度混合液组合浸泡前 后的对比照片；

图3是分光光度计检测的成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的梯度 混合液组合浸泡前后的透光率对比曲线图；

图4是成年小鼠整脑标本在透明前、SeeDB方法处理后及本发明实施 例3方法处理后的颜色对比照片；

图5是成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的梯度混合液组合浸泡前 后的形态对比照片；

图6是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例3的梯度混合液组 合浸泡后的双光子显微镜图像；

图7是成年小鼠整脑标本在透明前及本发明实施例3方法处理后的高 场强磁共振扫描图像；

图8是成年兔脑标本在动脉灌注本发明实施例3的梯度混合液组合前 后的对比照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实 施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

首先需要明确的是，质量体积分数，又叫“质量体积比浓度”或简称 “质量体积比”，是指溶液中溶质的质量与溶液的体积之比，例如质量体 积分数为10％的果糖溶液，即为100克果糖溶解于水中形成1升的果糖溶 液，100克/升＝0.1千克/升，消去单位换算成百分比简写为10％。

本发明提供了一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，包 含糖类、离液剂和抗氧化剂。糖类具有较高的折射率，用其处理组织，可 以较好的匹配动物组织的折射率，使组织更透明；离液剂打破氢键，使蛋 白质发生可逆性变性，它的加入增加样品中膜蛋白的溶解性；抗氧化剂可 以很好的阻止溶液变色以致变质。其中，糖类选自单糖(如果糖)和二糖 (如蔗糖)的至少一种，糖类的质量体积分数为10～100％。离液剂选自尿 素、硫脲、盐酸胍、氯化锂等的至少一种，离液剂的质量体积分数为5～50％。 抗氧化剂可为选自3-巯基-1，2-丙二醇、巯基乙醇、硫辛酸等的至少一种， 抗氧化剂的质量体积分数为0.5～5％。

优选地，本发明的混合液包含质量体积分数为10～100％的糖类，例如 果糖，质量体积分数为5～50％的离液剂，例如尿素，以及质量体积分数为 0.5～5％的抗氧化剂，例如3-巯基-1，2-丙二醇。

进一步优选地，本发明的混合液包括不同浓度梯度组成的多种混合液 形成的一个混合液组合，优选由5～10种混合液组成，形成5～10级不同浓 度的混合液。为了描述的方便，混合液组合中每一种混合液的浓度用其所 含糖类的质量体积分数来表示。

优选地，所述混合液组合中所述各级浓度梯度组成的混合液的糖类浓 度逐渐增加，离液剂浓度逐渐降低。

再进一步优选地，本发明的混合液组合例如包括形成5级浓度梯度的 5种混合液，其中糖类的质量体积分数分别为10-35％、35-40％、40-60％、 60-90％、100％，或者10-40％、40-60％、60-80％、80-90％、100％。最优 选地，所述5级浓度梯度的5种混合液中糖类的质量体积分数分别为35％、 40％、60％、80％、100％，或者40％、60％、80％、90％、100％。离液剂 的质量体积分数分别为45％、45％、35％、25％、10％，抗氧化剂的质量 体积分数均为0.5％。更优选地，糖类选用果糖，离液剂选用尿素，以及抗 氧化剂选用3-巯基-1，2-丙二醇。

下面结合具体实例来阐述本发明的方法。本发明保留组织纹理结构的 完整器官快速透明方法包括标本制备、本发明的混合液/混合液组合的配 制、本发明的混合液/混合液组合处理器官三个步骤，下面区分体型较小和 体型较大的哺乳动物进行详细阐述：

1.体型较小的成年哺乳动物的完整脑标本制备：

成年小鼠一只，体重约20g，用1ml注射器抽取1％戊巴比妥钠溶液 0.2ml，腹腔注射麻醉。

待动物痛觉消失后，开胸充分暴露心脏，快速用装有1×PBS溶液 (pH7.4)的注射器自左心室进行心脏穿刺，5分钟内均匀推注1×PBS溶 液20ml，动物眼球、前肢及肝脏血色消失，继续灌注4％多聚甲醛溶液20ml (pH7.4，1×PBS配制)。刚开始灌注多聚甲醛时，可见到动物抽动、甩 尾，之后动物肢体和尾巴绷直，提示灌注成功。

剪开颅骨，小心分离剪断与脑相连的颅神经，取出完整动物脑标本， 浸入4％多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱内继续后固定2小时以上，最好 过夜。

其中，体型较小的哺乳动物和体型较大的哺乳动物是本领域技术人员 公知的根据经验来划分的，通常认为实验用动物中小鼠、大鼠等为体型较 小的哺乳动物，兔、犬、马、牛、猴等为体型较大的哺乳动物。

2.体型较大的成年哺乳动物的完整脑标本制备：

成年大白兔一只，体重约2kg，用5ml注射器抽取3％戊巴比妥钠溶 液2ml，耳缘静脉注射麻醉。

待动物痛觉消失后，分离双侧颈总动脉，血管夹钳夹近心端和远心端， 在中间段血管管壁剪开一小口，远心端动脉插管，动脉插管连接预先装有 1×PBS溶液(pH7.4)的输液装置，松开远心端血管夹，分离双侧颈深静 脉并剪开。动物眼球变白后，继续灌注4％多聚甲醛溶液200ml(pH7.4， 1×PBS配制)。刚开始灌注多聚甲醛时，可见到动物颈部肌肉收缩，之后 动物前肢绷直，提示灌注成功。

从颈部剪断椎骨断头，保留颈总动脉插管备用，为避免破坏血管，暂 不剪开颅骨取脑。

3.本发明的混合液和混合液组合的配制：

实施例1

对于本发明的混合液，作为一个具体实施例，例如糖类选择果糖单独 一种，离液剂选择尿素单独一种，抗氧化剂选择3-巯基-1，2-丙二醇单独一 种，配制100ml混合液，具体步骤如下：称取40克果糖、45克尿素溶解 于90ml左右的双蒸水中，并加入0.5克3-巯基-1，2-丙二醇混合均匀，静 置，待液面稳定后补加双蒸水将得到的溶液体积调整到100ml。

实施例2

对于本发明的混合液，作为另一个具体实施例，例如糖类选择1∶1的 果糖和蔗糖，离液剂选择硫脲单独一种，抗氧化剂选择硫辛酸单独一种， 配制100ml混合液，具体步骤如下：称取30克果糖和30克蔗糖、35克 硫脲溶解于90ml左右的双蒸水中，并加入0.5克硫辛酸混合均匀，静置， 待液面稳定后补加双蒸水将得到的溶液体积调整到100ml。

上述实施例1、2仅是举例说明，对于其它浓度的本发明混合液，可 以相同步骤将其溶解于双蒸水中混合均匀，静置后再调整体积到100ml。

实施例3

对于本发明的混合液组合，作为一个具体实施例，例如分为5级，每 级浓度溶液各配制100ml。其中，糖类选择果糖单独一种，离液剂选择尿 素单独一种，抗氧化剂选择3-巯基-1，2-丙二醇单独一种。称取如下表所示 重量的果糖、尿素溶解于双蒸水中，并加入给定量的3-巯基-1，2-丙二醇混 合均匀，静置待用。具体配方见下表。

实施例4

对于本发明的混合液组合，作为另一个具体实施例，分为5级，每级 浓度溶液各配制100ml。其中，糖类选择蔗糖单独一种，离液剂选择硫脲 和盐酸胍两种，抗氧化剂选择巯基乙醇单独一种。称取如下表所示重量的 蔗糖、硫脲和盐酸胍溶解于双蒸水中，并加入给定量的巯基乙醇混合均匀， 静置待用。具体配方见下表。

实施例5

对于本发明的混合液组合，作为再一个具体实施例，分为7级，每级 浓度溶液各配制100ml。其中，糖类选择果糖和蔗糖单独一种，离液剂选 氯化锂一种，抗氧化剂选择巯基乙醇单独一种。称取如下表所示重量的果 糖、蔗糖、氯化锂溶解于双蒸水中，并加入给定量硫辛酸混合均匀，静置 待用。具体配方见下表。

4.对体型较小哺乳动物的完整脑的浸泡处理

将分离好的成年小鼠完整脑标本从4％多聚甲醛溶液中取出，依次浸 泡于实施例1-5的本发明混合液/混合液组合中，其中，在浓度为35％、40％、 60％的本发明的混合液/混合液组合中各浸泡4～8小时，在浓度为80％、 100％的本发明的混合液/混合液组合中各浸泡12～24小时。

对于上述实施例1、2，均基本上能够满足试验的要求，但由于只是单 一溶液，处理后在个别性能，比如组织器官皱缩、变形上略微差强人意。

对于上述实施例3-5，效果非常理想，尤其是实施例3，整个透明过程 仅需两天半(60小时左右)，与SeeDB梯度溶液的处理时间(100小时左 右)相比，缩短约40％。而成年小鼠脑标本经本发明实施例3-5的混合液 组合浸泡处理后，透明效果优于SeeDB浸泡处理。无需进行切片，可直接 用于双光子显微镜观察研究。并且，本发明实施例3-5的混合液组合的浸 泡不损害组织内荧光标记信号，不会导致组织严重变形、变色，不破坏器 官内部的天然纹理结构。

5.对体型较大哺乳动物的完整脑的灌注处理

将保留有颈总动脉插管的兔头置入干净容器中，将动脉插管连接注射 泵，依次灌注实施例1-5的本发明的混合液/混合液组合，其中，浓度为 35％、40％的本发明混合液/混合液组合各灌注1～12小时，浓度为60％、 80％的本发明混合液/混合液组合各灌注1～4小时，浓度为100％的本发明 混合液/混合液组合灌注1～12小时。

本发明混合液/混合液组合灌注结束后，剪开颅骨，小心分离剪断与脑 相连的颅神经，取出完整动物脑标本，放入浓度为100％的本发明混合液 中继续浸泡12～24小时。

对于上述实施例1、2，均基本上达到试验目标，但由于只是单一溶液， 处理后在个别性能，比如组织器官皱缩、变形上略微差强人意。

对于上述实施例3-5，效果非常理想，尤其是实施例3，成年兔脑标本 经本发明实施例3的混合液组合灌注处理后，透明效果较好，肉眼即可见 到脑深部结构。因溶液组成成分完全一样，灌注方式显著加强本发明梯度 混合液组合的透明效果之外，不会带来其他副作用。

下面结合附图对本发明实施例3的混合液组合的技术效果进一步阐 述。

图1是溶液流动性测试的液面移动对比示意图，其中左侧竖立塑料管 盛放的是最高浓度的本发明的混合液，右侧竖立塑料管盛放的是最高浓度 的本发明的混合液(100％质量体积分数的果糖、10％质量体积分数的尿素 和0.5％质量体积分数的3-巯基-1，2-丙二醇)，黑色箭头指示液体平面。上 排两幅图片显示温度在18℃时的测试结果，右侧的本发明混合液在150 秒内流空，而左侧的饱和果糖几乎无流动；下排两幅图片显示温度在37℃ 时的测试结果，右侧的本发明混合液在90秒内流空，而左侧的饱和果糖 几乎无流动。两种温度条件下均显示本发明混合液的流动性好、粘度低。

图2是成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的混合液组合浸泡前后的 对比照片，右侧图片显示出成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的梯度混 合液组合浸泡后呈现透明状态，在肉眼观察下即可看到标本后面的格子 线。

图3是分光光度计检测的成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的混合 液组合浸泡前后的透光率对比曲线图，其中左右两图的横坐标均为测试光 的波长，纵坐标均为成年小鼠半脑标本透光率(左右两图纵坐标数值相差 10倍)。左图显示透明前的半脑透光率均很低并且几乎无差别，右图显示 两种方法处理后的半脑透光率具有显著差别。与SeeDB方法相比，本发明 实施例3的混合液组合浸泡处理的成年小鼠半脑标本透光率更好。其中， 实心点线代表本发明方法，空心点线代表SeeDB方法。

图4是成年小鼠整脑标本在透明前、SeeDB方法处理后及本发明实施 例3的方法处理后的颜色对比照片，显示出成年小鼠整脑标本在透明前与 经过不同透明方法处理后的颜色变化。其中，左图为透明前鼠脑；中图为 SeeDB方法处理后经1×PBS漂洗的鼠脑；右图为本发明实施例3的方法 处理后经1×PBS漂洗的鼠脑。本发明实施例3的方法比SeeDB方法更能 有效防止成年小鼠整脑发生棕色变，处理的标本更接近于天然本色。

图5是成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的混合液组合浸泡前后的 形态对比照片，显示出成年小鼠半脑标本形态大小在本发明混合液浸泡处 理前后基本一致，其中栅格为5mm×5mm。

图6是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例3的混合液组合浸 泡后的双光子显微镜图像，显示出双光子显微镜下检测荧光蛋白转基因小 鼠整脑标本的荧光信号。经本发明实施例3的混合液组合浸泡处理后，转 基因小鼠脑内荧光标记明亮，神经元形态饱满，纤维突起清楚。其中，激 发波长为920nm。

图7是成年小鼠整脑标本的高场强磁共振扫描图像，显示出成年小鼠 整脑标本的高场强磁共振扫描图像。其中，上排两幅图表示CLARITY方 法处理前后；下排两幅图表示本发明实施例3的方法处理前后。本发明实 施例3的方法处理后，天然组织纹理依然保留，脑内结构清晰可辨。 CLARITY方法处理后脑内呈现均匀高亮信号，组织纹理消失。其中，场 强为9.4特斯拉。

图8是成年兔脑标本在动脉灌注本发明实施例3的混合液组合前后的 对比照片。经动脉灌注本发明实施例3的混合液组合后，肉眼可见脑内深 部结构，例如海马。

由于时间和篇幅的问题，仅仅贴出了本发明实施例3的混合液组合的 具体实验效果图，但通过实验和肉眼观察证明，实施例1、2、4、5也均 能基本上达到实验目的，解决本发明的技术问题。

通过上述附图可见，本发明的方法还具有以下优点：

1、本发明所用混合液不必使用质量体积分数为130％的饱和果糖溶 液，因此粘度大为降低(如图1所示)，无论是更换溶液还是在溶液中处 理组织样品，都比单纯使用饱和果糖的方法更容易操作；

2、本发明可使器官透明(如图2所示)，并且透明效果明显好于单纯 使用果糖的方法(如图3所示)；

3、本发明的透明速度明显快于单纯使用果糖的方法；

4、本发明比单纯使用果糖的方法更有效防止组织器官棕色变(如图4 所示)；

5、本发明可以控制形变，透明前后器官形态大小基本一致(如图5 所示)；

6、本发明可与其他常用荧光标记技术兼容(如图6所示)；

7、本发明可以在透明完整器官的同时，保留其内部天然纹理结构(如 图7所示)；

8、本发明透明作用能力强，可使体型较大哺乳动物的器官(例如兔 脑)透明(如图8所示)，以往组织透明方法均无证据显示具备此能力。

综上所述，本发明使用的梯度混合液制备工艺及样品处理程序操作简 便，透明效果确定、透明速度较快，不会引起组织严重变形、变色；既能 与常用荧光标记技术兼容，又能保留器官内部的天然纹理结构；此外，不 仅可使体型较小成年哺乳动物的器官透明，也可使体型较大成年哺乳动物 的器官透明。因此，本发明可广泛用于生物医学特别是神经科学领域的研 究。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行 了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的只体实施例而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。