一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法

摘要

本发明公开了一种利用悬浮细胞MO7e评价促血小板生成素受体（TPO受体）激动剂体外活性的分析方法。该方法通过评价样品对细胞的促增殖发育能力来反映样品与TPO受体结合活性以及促血小板生成活性。本发明一方面解决了现有技术中BaF3-hMpl细胞系构建难度大耗时长，检测结果不稳定的问题；另一方面解决了悬浮细胞MTT法显色时间长并且产生不溶性甲臜产物，导致结果重现性差、准确度低的问题；同时采用优于存活率评价指标的四参数数据处理方法，可直接定义样品活性值。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质医药生物工程与技术领域，具体涉及一种新颖的利用悬浮细胞MO7e评价促血小板生成素受体（TPO受体）激动剂体外活性的分析方法。

背景技术

促血小板生成素受体（TPO受体）激动剂特异性与TPO受体c-Mpl结合，促进巨核细胞增殖发育，进而产生血小板，通常用于治疗化疗引起的血小板减少或血小板减少性紫癜。此类生物制品包括重组人血小板生成素（rhTPO）、聚乙二醇修饰的重组人巨核细胞生长和发育因子（PEG-rhMG-DF）、TPO肽类模拟物，另外还有TPO非肽类模拟物。它们均可结合并活化TPO受体（Mpl）从而发挥生物学效应。

第一代TPO受体激动剂以重组人血小板生成素rhTPO（特比澳等）为代表，其与内源性TPO的氨基酸序列相同，能与巨核细胞表面TPO受体Mpl结合进而引起巨核细胞增殖，进而产生血小板。

TPO模拟肽-Fc融合蛋白（罗米司亭等）为一种新型重组蛋白，属于第二代TPO受体激动剂，是一种长效TPO受体激动剂。该蛋白是在抗体Fc片段羧基端连接了两段TPO模拟肽，该模拟肽可以与TPO受体特异结合，诱导骨髓中的造血干细胞分化为巨核细胞，并促进巨核细胞的生长、成熟和分化，使巨核细胞最终释放血小板。

艾曲波帕为口服非肽类小分子TPO受体激动剂，可特异结合TPO受体，引起受体二聚化，激活酪氨酸激酶-信号转导及转录激活（JAK-STAT）等信号通路，进而引起巨核细胞增殖分化，产生血小板。

由于TPO受体激动剂具有刺激细胞增殖的作用，因此通常采用相关细胞进行体外生物学活性评价。有文献报道使用BaF3-hMpl细胞进行rhTPO或罗米司亭体外活性分析。但是这种方法所用细胞系BaF3-hmpl细胞是在原细胞基础上导入c-mpl基因，进而在细胞表面表达TPO的受体Mpl，细胞系的构建时间长，受体数量不均一，细胞稳定性较差。活性检测结果容易受到细胞稳定性的影响而有较大变动。此方法采用MTT比色法，产生的甲臜产物不易溶解，需加入DMSO溶解甲臜产物，且往往因溶解不全而对实验结果造成影响。此方法采用存活率指标来评价不同浓度rhTPO或罗米司亭对BaF3-mpl细胞增殖的影响，但是计算存活率的方法不能换算成样品活性值。

本发明人过潜心研究发现采用从白血病患者外周血中分离所得的MO7e细胞株能够特异性地表达TPO受体Mpl，无需任何改造，简单方便实用。相比现有技术中采用BaF3-mpl细胞株更均一，性质更加稳定。采用MO7e细胞株进行体外活性检测，评价结果的重现性和准确度均有大幅度提高，同时大大缩短构建和筛选细胞株所需的3个月～5个月，提高了生产效率，降低了生产成本。

另外，本发明人发现联合采用一种新型显色剂-CCK-8（cell counting 8）进行活性评价能够进一步解决现有技术中存在采用有机溶剂，安全性低，测试结果不准确的缺陷。此试剂利用了Dojindo开发的水溶性四唑盐-WST-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。CCK-8比色法无需裂解细胞，可直接进行比色，该方法步骤简便，显色时间仅需2小时（MTT法需要过夜显色），并且准确性和重复性得到了明显提高。

根据中华人民共和国药典三部（2010版）附录X，多种细胞因子活性采用细胞增殖法/MTT比色法测定，实验数据采用四参数法进行处理，最终计算出样品生物学活性。据此，根据本发明测定方法可以通过四参数法处理数据，能够直接计算出TPO受体激动剂活性值，较以往的存活率评价方法更直观体现TPO受体激动剂的体外活性。

本发明人根据长期研究和实践，建立了一种新型的利用悬浮细胞（MO7e）评价TPO受体激动剂体外活性的分析方法：细胞与TPO受体激动剂孵育一段时间后，加入显色试剂CCK-8对吸光度值进行检测，进而将检测值进行四参数回归分析。结果在一定范围内使得TPO受体激动剂的浓度对数值与MO7e细胞增殖量呈现良好的线性关系，可以准确真实地反映出体外活性的情况。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，此方法中涉及的MO7e细胞本身表达TPO受体，与传统检测方法相比，无需单独在细胞表面表达受体，细胞稳定性强。此检测方法简便、稳定性好，用时短，成本低，重现性高。 

 为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：

利用悬浮细胞MO7e进行促血小板生成素受体激动剂体外活性的评价。

其中，该方法含有如下步骤：

（1）     细胞复苏及传代；

（2）     细胞活力评价；

（3）     标准品及样品制备；

（4）     样品活性检测；

（5）     显色方法；

（6）     原始数据处理。

进一步地，该方法的详细步骤如下所示：

（1）细胞复苏及传代：

将细胞株从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻震摇使其快速融解；在超净台中将其移入离心管中，加入浓度为10%-20%的FBS+1640培养基重悬细胞；800-1000rpm离心3-10min后弃去上清，加入细胞培养基及生长因子重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF，吹打混匀，移至细胞培养瓶中；瓶壁上标明细胞名称、操作日期、细胞代次；

将处于对数生长期的细胞吹打混匀，取100 μl细胞悬液测定活细胞浓度、细胞存活率；将细胞悬液用新鲜细胞培养基稀释至细胞浓度约为5×104个/ml～10×104个/ml，每瓶15ml；轻轻摇匀，37℃，5%- 10%CO2条件下培养；复苏后最多传至20代弃用；

（2）细胞活力评价：

取50～100 μl细胞悬液与0.4%台盼蓝等体积混合；于细胞计数仪测定活细胞浓度、细胞存活率；细胞传代浓度为5×104个/ml～10×104个/ml，每3～4天传代一次；

（3）标准品及样品制备

取一支TPO受体激动剂，注射用水溶解至蛋白浓度为0.02～0.07mg/ml，用浓度为10%-20%的 FBS+1640培养基进行5～10倍梯度稀释，配制7～9个浓度的活性标准品溶液；

（4）样品活性检测：

取处于对数生长期的MO7e细胞，吹打混匀，800-1000rpm离心；上清液高速离心后加入空白对照孔；沉淀细胞用无血清1640培养基洗涤两次；再用浓度为10%-20%的 FBS+1640培养基重悬；用细胞计数仪计数后调整细胞浓度至1.5×105～2.2×105个/ml；样品及空白对照50μl/孔，细胞150μl/孔加入96孔板中，37℃，5%- 10% CO2条件下培养48～72小时；

（5）显色方法：

将CCK-8试剂用浓度为10%-20%的 FBS+1640培养基等体积稀释；加入96孔板中；每孔20μl，摇匀，放入CO2培养箱中孵育2h，用酶标仪测定450nm和600nm处吸光度；

（6）原始数据处理

以标准品溶液和样品溶液的稀释倍数为x值，以对应的吸光度为y值，用Gen5 1.10软件作四参数回归曲线；Y=（A-D）/（1+（X/C）＾B） + D；

其中：A：曲线上渐近线估值即最大吸光度值；

　　  B：曲线的斜率； 

　　  C：最大有效量一半时对应的浓度；

　　  D：曲线下渐近线估值即最小吸光度值；

       将标准品溶液四参数曲线的（A+D)/2代入标准品与样品方程，得到标准品Er与样品Es；

       其中：A：标准品最大吸光度值即为450nm扣除600nm吸光度，再减去空白对照；

D：标准品最小吸光度值即为450nm扣除600nm吸光度，再减去空白对照；

       其中：样品活性/比活性计算公式：供试品活性/比活性计算公式：

供试品活性（U/ml）=Pr× ；

供试品比活性（U/mg)= ；

其中：

Pr：标准品活性，U/ml；

Ds：样品预稀释倍数；

Dr：标准品预稀释倍数；

Es：样品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er：标准品半效量的稀释倍数。

其中，步骤（1）中所使用的培养基是完全培养基，且添加的MO7e生长所依赖的GM-CSF终浓度为5～10ng/ml。 

其中，步骤（2）中进行细胞活力评价时，用于样品检测的细胞活力范围为：活细胞浓度7×10⁵ 个/ml～12×10⁵ 个/ml，细胞存活率≥90%。

其中，步骤（3）中标准品和样品的浓度范围为：0.00005ng/ml～5000ng/ml，采用5～10倍梯度稀释对样品进行处理。

其中，步骤（4）中样品活性检测过程使用培养基不含有MO7e细胞复苏和传代时所依赖的生长因子，而是加入一定浓度待检测的TPO受体激动剂。

其中，步骤（5）中的显色方法为细胞培养48～72小时后加入CCK-8显色试剂。

其中，步骤（6）中的原始数据处理采用四参数计算法。

其中，促血小板生成素受体激动剂含有重组人全长血小板生成素rhTPO或聚乙二醇修饰的重组人巨核细胞生长和发育因子PEG-rhMG-DF或TPO/IL3融合蛋白或TPO肽类模拟物或TPO非肽类模拟物和抗体类小分子TPO受体激动剂中的任意一种。

本发明的有益效果在于：

（1）  省去了构建细胞系及筛选细胞系的2～5个月的时间；

（2）  本细胞株可稳定表达TPO受体，大大提高了检测结果的稳定性、重复性；

（3）  本方法使用CCK-8进行显色，与传统MTT法相比，显色时间仅1～4小时，节省传统方法中需要过夜放置的时间，并且在悬浮细胞显色不会出现沉淀；

（4）  本检测方法采用四参数回归计算法处理原始数据，与传统存活率计算方式相比，数据结果更可靠、直观。

附图说明

图1为TMP-Fc 四参数拟合曲线。

图2为重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白（TMP-Fc）四参数拟合曲线（5倍稀释梯度）。

图3为重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白（TMP-Fc）四参数拟合曲线（10倍稀释梯度）。

图4为罗米司亭体外活性检测四参数拟合曲线。

图5为人重组血小板生成素rhTPO体外活性检测四参数拟合曲线。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将其理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。显然，根据本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换和变更。

 实施例一  重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白（TMP-Fc）体外活性评价（5倍稀释梯度）

（1）细胞复苏及传代

将细胞株从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻震摇使其快速融解。在超净台中将其移入离心管中，加入10% FBS+1640培养基重悬细胞。800rpm离心5min后弃去上清，加入细胞培养基及生长因子重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），终浓度10ng/ml，吹打混匀，移至细胞培养瓶中。瓶壁上标明细胞名称、操作日期、细胞代次。

将处于对数生长期的细胞吹打混匀，取100 μl细胞悬液测定活细胞浓度、细胞存活率等。将细胞悬液用新鲜细胞培养基稀释至细胞浓度约为10×10⁴个/ml，每瓶15ml。轻轻摇匀，37℃，8% CO₂条件下培养。复苏后最多传至第4代用于本次检测。

（2）细胞活力评价

取100 μl细胞悬液与0.4%台盼蓝等体积混合，于细胞计数仪测定活细胞浓度11×10⁵个/ml、细胞存活率95.3%。

（3）标准品及样品制备

取一支TMP-Fc，注射用水溶解至蛋白浓度为0.025mg/ml，用10% FBS+1640培养基进行5倍梯度稀释，配制9个浓度的样品溶液

（4）样品活性检测

取处于对数生长期的MO7e细胞，吹打混匀，800rpm离心。上清液高速离心后加入空白对照孔。沉淀细胞用无血清1640培养基洗涤两次，再用10% FBS+1640培养基重悬。用细胞计数仪计数后调整细胞浓度至1.8×10⁵个/ml。样品及空白对照50μl/孔，细胞150μl/孔加入96孔板中，37℃，8% CO₂条件下培养60小时。

（5）显色方法

将CCK-8试剂用10% FBS+1640培养基等体积稀释（现用现配），加入96孔板中。每孔20μl，摇匀，放入CO₂培养箱中孵育2h，用酶标仪测定450nm和600nm处吸光度。

（6）原始数据处理

以标准品溶液和样品溶液的浓度为x值，以对应的吸光度（450nm扣除600nm吸光度，再减去空白对照）为y值，用Gen5 1.10软件作四参数回归曲线。

Y=（A-D）/（1+（X/C）＾B） + D

A：曲线上渐近线估值 （最大吸光度值） 　　    B：曲线的斜率 　　    C：最大有效量一半时对应的浓度 　　    D：曲线下渐近线估值（最小吸光度值）

    将标准品溶液四参数曲线的（A+D)/2代入标准品与样品方程，得到待测样品半数有效浓度。

结果如图2所示，在 TMP-Fc浓度为0.0032ng/ml ～1250ng/ml的范围内，MO7e细胞增殖量与 TMP-Fc浓度的以10为底的对数呈现出良好的线性关系，R² =0.998。TMP-Fc半效浓度为2.8ng/ml。

 实施例二  重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白（TMP-Fc）体外活性评价（10倍稀释梯度）

细胞复苏及传代、细胞活力评价、样品检测、显色方法、数据处理详细步骤见案例一,样品制备采用10倍梯度稀释，配制9个浓度的样品溶液

结果如图3所示，在TMP-Fc浓度为0.0005ng/ml ～5000ng/ml的范围内，MO7e细胞增殖量与TMP-Fc浓度的以10为底的对数呈现出良好的线性关系，R² =0.999。TMP-Fc半效浓度为3.0ng/ml。

 实施例三罗米司亭体外活性评价

细胞复苏及传代、细胞活力评价、样品检测、显色方法、数据处理详细步骤见案例一。

样品制备：取罗米司亭样品，用10% FBS+1640培养基稀释蛋白浓度至0.05mg/ml， 采用10倍梯度稀释，配制9个浓度的样品溶液。

结果如图4所示，在罗米司亭浓度为0.0005ng/ml ～5000ng/ml的范围内，MO7e细胞增殖量与罗米司亭浓度浓度的以10为底的对数呈现出良好的线性关系，R² =0.995。罗米司亭浓度半效浓度为3.0ng/ml。

 实施例四 rhTPO细胞活性评价

细胞复苏及传代、细胞活力评价、样品检测、显色方法、数据处理详细步骤见案例一。

样品制备：取人重组血小板生成素rhTPO样品，用10% FBS+1640培养基稀释蛋白浓度至512ng/ml， 采用2倍梯度稀释，配制9个浓度的样品溶液。

结果如图5所示，rhTPO浓度在0～256ng/ml之间浓度曲线呈上升状态，rhTPO浓度为256ng/ml时，MO7e细胞增殖达到平台期。rhTPO半效浓度为51.2ng/ml。

 比较例  （MTT及CCK-8显色方法的比较）

分别采用MTT显色法及CCK-8显色法检测TMP-Fc对MO7e细胞的增殖效果，样品与细胞孵育72小时后进行显色，其中MTT显色法每孔加入100μl DMSO后过夜放置，次日发现蓝紫色结晶甲臜仍未完全溶解，无法检测其吸收值；CCK-8法加入显色剂10μl，放置2小时检测450nm/600nm吸收值。

   MTT法显色形成甲臜沉淀，需要再加入DMSO过夜溶解，而CCK-8显色后直接形成水溶性甲臜染料，省去甲臜溶解时间，操作简便，显色时间短（2h）。根据文献报道，CCK-8法检测的OD值与活细胞数的相关度要优于MTT法，是一种灵敏度高、重复性好的细胞活性检测方法。基于上述原因，选择CCK-8法作为该发明的显色方法。

 验证例

（1）  线性与范围

                        样品浓度范围                      线性R²    

       实例一       0.0032ng/ml ～1250ng/ml        0.998

       实例二       0.0005ng/ml ～5000ng/ml        0.999

       实例三       0.0005ng/ml ～5000ng/ml        0.997

（2）  重现性

根据发明内容中具体步骤及线性与范围要求稀释TMP-Fc样品，重复测定6次计算RSD，表1结果显示，采用该方法检测TMP-Fc体外活性的重现性RSD= 8.1% ，RSD≤20%，符合一般生物制品活性检测精密度要求。

表 1 TMP-Fc样品重复性验证试验结果

样品       比活性值 U/mg       平均值 U/mg      RSD

1            447897

2            435795

3            389073                       400933             9.5%

4            409427

5            345565

6            377843

（3）  准确度

TMP-Fc样品与TMP-Fc标准品按照一定比例混合，分别制成50%、100%、150%添加回收率样品，按发明内容中具体步骤测定未添加对照、50%、100%及150%添加回收率样品的活性，并与理论添加值比较，回收率在70%～130%范围内满足本方法准确度要求。

TMP-Fc样品50%、100%、150%添加试验结果如表2所示，在添加样品中，50%、100%、150%添加回收率测定值范围为80%～120%之间，因此该方法准确度符合要求。

表 2 TMP-Fc样品准确度验证试验结果