一种制备外源环状RNA的方法及定量检测内源环状RNA的方法

摘要

本发明公开了一种制备外源环状RNA的方法及定量检测内源环状RNA的方法。本发明将人工合成的DNA基因进行克隆，增殖，之后转录DNA基因为线性RNA，将RNA末端修饰后，首尾连接，制备成外源环状RNA分子。将外源环状RNA分子按特定比例加入总RNA中，作为内源环状RNA实时定量检测时的参考基因，首次实现了对内源环状RNA的实时定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种制备外源环状RNA的方法及定 量检测内源环状RNA的方法。

背景技术

生物体内大部分的RNA(Ribonucleic acid，核糖核酸)为线性，但有少部 分RNA首尾连接形成环状，称之为环状RNA。近年来，环状RNA迅速成为 RNA世界研究的热点，这是因为环状RNA被发现与重要生物学功能及疾病等 密切相关。另外，高通量测序技术被应用于检测环状RNA，极大地加快了对环 状RNA的发现及对环状RNA功能的分析。

对于RNA来说，其表达量是一个十分重要的属性。RNA是否表达以及表 达量的多少，都决定着RNA的生物学功能。例如，很多疾病的产生就是因为 RNA表达量的异常造成的。要衡量RNA的表达量，就需要一个在各种状态下 表达量相对恒定的RNA作为参考基因。经过大量的研究发现，线性肌动蛋白 (Actin)等基因的表达量相对恒定，常常作为线性RNA表达的参考基因。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

已知的恒定表达基因均为线性RNA分子，不能作为环状RNA分子的参考 基因，使得不同样品间的环状RNA表达量比较缺乏参考标准，因而缺乏有效的 环状RNA检测技术，极大地限制了环状RNA的研究与应用。

发明内容

为了解决现有技术中缺乏环状RNA的参考基因的问题，本发明实施例提供 了一种制备外源环状RNA的方法及定量检测内源环状RNA的方法。所述技术 方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种制备外源环状RNA的方法，所述方法包 括：

选择外源线性RNA基因；

将所述外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源线性 RNA基因；

将所述克隆的外源线性RNA基因在体外转录，合成外源线性RNA；

去除所述外源线性RNA的5’端的三磷酸结构，并在所述外源线性RNA的 5’端合成羟基；

对5’端为羟基的所述外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5’端经磷酸化修 饰的所述外源线性RNA；

将所述5’端经磷酸化修饰的外源线性RNA的5’端和3’端连接，合成外源环 状RNA；

切掉未环化成功的所述外源线性RNA，得到外源环状RNA。

具体地，所述外源线性RNA基因对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO:1 所示。

具体地，采用RNA酶R切掉未环化成功的所述外源线性RNA。

另一方面，本发明提供了一种定量检测内源环状RNA的方法，所述方法包 括：

采用上述的方法制备外源环状RNA；

对所述外源环状RNA进行质量控制；

向待检样本和对照样本的总RNA中加入所述外源环状RNA，所述总RNA 与所述外源环状RNA的质量比为2000:1，得到所述外源环状RNA与所述总RNA 的混合物；

利用实时定量PCR方法分别检测所述外源环状RNA与所述总RNA的混合 物中的目标环状RNA和所述外源环状RNA的含量；

以所述外源环状RNA作为参考基因确定所述待检样本中所述目标环状 RNA的表达量。

具体地，所述对所述外源环状RNA进行质量控制包括：

利用随机引物对合成的所述外源环状RNA进行逆转录，合成外源cDNA；

利用第一引物和第二引物分别对所述外源线性cDNA和所述外源环状 cDNA进行实时定量PCR扩增，分别获得C_T1值和C_T2值，所述第一引物包括 如序列表中SEQ ID NO:2所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID NO:3所示 的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ ID NO:4所示的第二正向 引物和如序列表中SEQ ID NO:5所示的第二反向引物；

通过C_T1值和C_T2值以及公式计算合成的所述外源环状 RNA的环化比例，并选用环化比例超过90％的所述外源环状RNA。

具体地，所述向待检样本的总RNA中加入所述外源环状RNA，所述总RNA 与所述外源环状RNA的质量比为2000:1，得到所述外源环状RNA与所述总RNA 的混合物，包括：

提取并纯化所述待检样本与所述对照样本的总RNA；

测量纯化后的所述总RNA的质量浓度；

根据所述待检样本和所述对照样本的总RNA的质量浓度按照所述总RNA 与所述外源环状RNA的质量比为2000:1的比例与所述外源环状RNA混合，得 到所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物。

进一步地，利用分光光度计测量所述待检样本与所述对照样本的总RNA的 质量浓度。

具体地，所述利用实时定量PCR方法分别检测所述外源环状RNA与所述 总RNA的混合物中的目标环状RNA和所述外源环状RNA的含量，包括：

利用所述随机引物对加入了所述外源环状RNA的所述总RNA进行逆转录， 得到逆转录产物，所述逆转录产物包括目标环状cDNA和所述外源环状cDNA；

利用第三引物分别对所述待测样本与所述对照样本的所述目标环状cDNA 进行定量PCR检测，扩增后分别获得C_T3值和C_T4值，利用所述第二引物分别 对所述待测样本与所述对照样本的所述外源环状cDNA进行定量PCR检测，扩 增后分别获得CT₅值和CT₆值；

所述第三引物与所述第二引物的扩增产物均跨越了环状RNA的环化结点。

进一步地，根据公式计算所述待检样本中所述目标 环状RNA的比例。

进一步地，所述实时定量PCR的扩增程序为：95℃20秒；95℃3秒，60℃ 20秒，共40个循环。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一 种制备外源环状RNA的方法，其获得的外源环状RNA可作为内源环状RNA的 参考基因，解决了内源环状RNA由于缺乏参考基因而无法进行实时定量PCR 检测的缺陷，有助于环状RNA的研究与应用。本发明实施例提供的定量检测内 源环状RNA的方法，将制备的外源环状RNA加入待检样本与对照样本的总 RNA中，并与待检样本与对照样本的总RNA一同进行扩增与检测。因而，外 源环状RNA实质上已经等同于了稳定表达的内源环状RNA，可以作为不同样 本间检测内源环状RNA表达量的参考基因，解决了没有内源环状RNA参照基 因的难题，从而实现了对内源环状RNA表达量检测的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的制备外源环状RNA的方法流程图；

图2是本发明实施例二提供的制备外源环状RNA的方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式 作进一步地详细描述。

实施例一

本发明实施例提供了一种制备外源环状RNA的方法，如图1所示，该方法 包括：

步骤101：选择外源线性RNA基因；

步骤102：将外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源 线性RNA基因；

步骤103：将克隆的外源线性RNA基因在体外逆转录，合成外源线性RNA；

步骤104：去除外源线性RNA的5’端的三磷酸结构，并在外源线性RNA 的5’端合成羟基；

步骤105：对5’端为羟基的外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5’端经磷 酸化修饰的外源线性RNA；

步骤106：将5’端经磷酸化修饰的外源线性RNA的5’端和3’端连接，合成 外源环状RNA；

步骤107：切掉未环化成功的所述外源线性RNA，得到外源环状RNA；

步骤108：纯化外源环状RNA。

具体地，本发明实施例提供的待检样本为莱茵衣藻，且该莱茵衣藻的品系 为CC503(购自于衣藻资源中心，网址为：http://chlamycollection.org/)。

步骤101：选择外源线性RNA基因，该外源线性RNA基因对应的DNA序 列如序列表SEQ ID NO:1所示。上述SEQ ID NO:1及其互补链由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。通过NCBI的BLAST程序检索，没有发现生物中 存在外源线性RNA基因的同源性高的基因。选择的外源线性RNA基因的长度 不超过1000bp。在外源线性RNA基因的5’端和3’端分别添加了ctcgag和aagctt 序列，该ctcgag和aagctt序列分别为限制性内切酶XhoI和HindIII的酶切位点， 便于将外源线性RNA基因克隆进入原核表达载体，在外源线性RNA基因的5’ 端连接的taatacgactcactata序列为T7转录酶的启动子序列，其余序列为可转录的 序列，且在taatacgactcactata序列之后连接有ggg序列，ggg序列能够增加T7转 录酶的转录效率。

步骤102：将外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源 线性RNA基因，包括：

所选用的克隆载体为pBluescript II SK(+)(该克隆载体从长沙赢润生物技 术有限公司购买，货号为VKS0288)，采用内切酶XhoI(购买自NEB公司，货 号为R0146)和内切酶HindIII(购买自NEB公司，货号为R0104)对pBluescript II SK(+)载体进行双酶切。具体地，在20μl的反应体系中，包含有10μg pBluescript II SK(+)载体、20U的内切酶HindIII、20U的内切酶XhoI和2× 的NEBuffer 2.1(由NEB公司提供)。将上述反应体系混合均匀，经短暂离心， 于37℃保温1小时后，经80℃20分钟将酶灭活，并获得线性pBluescript II SK (+)载体，该线性pBluescript II SK(+)载体的浓度为10/20＝0.5μg/μl。

将外源线性RNA基因的DNA序列(如序列表SEQ ID NO:1所示)及其互 补链用无菌水溶解后，分别配制成浓度为0.5μg/μl的溶液，按体积比1：1混合 均匀，于PCR仪中依次经历94℃10分钟；65℃10分钟；37℃10分钟，形成 外源双链DNA基因。

在20μl的反应体系中包括线性的pBluescript II SK(+)载体10μl、外源双 链DNA基因1μl、400U的T4DNA连接酶(购买自NEB公司，货号为M0202) 和1×T4DNA连接酶缓冲液(随T4DNA连接酶一起购买自NEB公司)，16℃ 温育过夜后，65℃10分钟，T4DNA连接酶经热失活，获得含有外源线性RNA 基因的pBluescript II SK(+)质粒载体。

利用热激法将含有外源线性RNA基因的pBluescript II SK(+)质粒载体转 化进入大肠杆菌，具体方法如下：取50μl感受态细胞(由北京全式金生物技术 有限公司生产，目录号为CD501)在冰浴中自然解冻，加入含有外源线性RNA 基因的pBluescript II SK(+)质粒载体，轻轻混匀，在冰浴上孵育30分钟，42℃ 热激30秒，快速转移至冰浴中冰浴3分钟，该过程中不要摇动离心管，然后加 入300μl不含抗生素的无菌LB液体培养基(LB液体培养基成份：牛肉膏0.5g， 蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，pH7.2～7.5)，于37℃200转/分钟， 复苏1小时，取复苏后的菌液200μl均匀涂布于含氨苄青霉素抗性的LB固体培 养基(LB固体培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L 和琼脂粉15g/L)上，待菌液完全吸收后倒置于37℃恒温培养箱中，暗培养过 夜。挑取LB固体培养基上长出来的单克隆至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养 基中，经37℃200转/分钟，摇菌扩增繁殖6-8小时，制备成感受态细胞。

利用天根生化科技(北京)有限公司生产的快速质粒小提试剂盒(货号为 DP105)从上述感受态细胞中，提取并纯化含有外源线性RNA基因的pBluescript  II SK(+)质粒载体的DNA，提取与纯化的方法按照随试剂盒提供的说明书进 行。利用分光光度计(美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中的双链DNA 程序，检测纯化后的pBluescript II SK(+)质粒的质量浓度。利用外源线性RNA 基因的PCR引物从纯化后的pBluescript II SK(+)质粒上扩增外源线性RNA基 因。具体地，20μl的扩增体系包括：纯化后的pBluescript II SK(+)质粒50ng、 10μl Q5高保真扩增混合物(购自于NEB公司，货号为M0492)和10μM的外 源线性RNA基因的PCR引物(该PCR引物为正向引物与反向引物的等摩尔比 混合物)。扩增程序如下：98℃30秒；98℃8秒，56℃20秒，72℃20秒， 共30个循环。将PCR产物利用乙醇沉淀进行纯化，纯化产物溶解于10μl无酶 水中，获得外源线性RNA基因的PCR产物，利用Q5000(美国Quawell公司生 产，型号为Q5000)中的双裢DNA定量程序对PCR产物进行定量检测，检测 结果表明：本次扩增获得的外源线性RNA基因的PCR产物浓度为560ng/μl。 将外源线性RNA基因的PCR产物送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认 克隆的外源线性RNA基因的正确性，从而获得带有正确克隆的外源线性RNA 基因的pBluescript II SK(+)质粒。

其中，外源线性RNA基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQ ID NO:9 所示，外源线性RNA基因的PCR引物的反向引物如序列表中SEQ ID NO:10 所示。序列表中SEQ ID NO:9中的多聚T序列是为了在转录时获得多聚A，用 于模拟生物RNA的多聚A尾巴，具有多聚A尾巴的RNA可以被Poly(T)引 物逆转录成cDNA。同时，多聚A尾巴也可用于纯化RNA。

步骤103：将克隆的外源线性RNA基因在体外转录，合成外源线性RNA， 包括：

采用T7RNA快速高效合成试剂盒(购自于NEB公司，货号为E2050)转 录合成外源线性RNA。该试剂盒中的成份包括：无酶水、含有NTP的缓冲液混 合物和T7RNA聚合酶混合物，该反应体系中包括：1μg上述外源线性RNA基 因的PCR产物、10μl含有NTP的缓冲液混合物和2μl T7RNA聚合酶混合物， 加水补足20μl混合均匀，并短暂离心，经37℃保温2小时后，加入30μl无酶 水和2μl DNase I(购自于NEB公司，货号为M0303)，混合均匀后，经37℃保 温15分钟，去除DNA模板。再利用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(由ABI公 司生产，货号为61006)进行纯化，并用50μl无酶水溶解纯化产物，获得纯化 的外源线性RNA。

步骤104：去除外源线性RNA的5’端的三磷酸结构，并在外源线性RNA 的5’端合成羟基。因体外合成的外源线性RNA的5’端为三磷酸结构，使得外源 线性RNA的5’端无法与3’端连接形成环状，所以必须去除该5’端的三磷酸结构， 再在5’端加上单磷酸结构，这样外源线性RNA的首尾才能相连成环状，具体步 骤包括：

采用小牛肠碱性磷酸酶(购自于NEB公司，货号为M0290)去除外源线性 RNA的5’端的三磷酸结构，配制如下反应体系：20μg纯化的外源线性RNA和 7U的小牛肠碱性磷酸酶，用水补足20μl后混合均匀，经短暂离心，于37℃保 温1小时，获得去除5’端三磷酸结构的外源线性RNA。利用Dynabeads mRNA 纯化试剂盒(由ABI公司生产，货号为61006)纯化去除了5’端三磷酸结构的 外源线性RNA，得到5’端为羟基的外源线性RNA。

步骤105：对5’端为羟基的外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5’端磷酸 化修饰的外源线性RNA，包括：

利用T4PNK激酶(由NEB公司，货号为M0201)修饰该5’端为羟基的外 源线性RNA。随酶一起提供的有10×T4PNK激酶缓冲液。在50μl的反应体 系中，包含如下成份：1×T4PNK激酶缓冲液、1mM ATP、10U T4PNK激酶、 以及上述获得的5’端为羟基的外源线性RNA，用水补足50μl并混合均匀，经 短暂离心，于37℃保温30分钟。利用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(由ABI 公司生产，货号为61006)进行纯化，操作方法按该试剂盒的说明书进行，获得 5’端磷酸化修饰的外源线性RNA。

步骤106：将5’端磷酸化修饰的外源线性RNA的5’端和3’端连接，合成外 源环状RNA，包括：

利用T4RNA连接酶I(NEB公司生产，货号为M0204)对该5’端磷酸化 修饰的外源线性RNA的5’端与3’端进行连接。随该T4RNA连接酶I一起提供 的成份还包括：10×T4RNA连接酶反应缓冲液、10mM ATP和PEG 8000。在 20μl的反体系中包含如下成份：1×T4RNA连接酶反应缓冲液、10U/μl的T4 RNA连接酶1μl、10U/μl的RNA酶抑制剂0.5μl、浓度为10％的PEG8000、 20-50μM的ATP和上述获得的5’端磷酸化修饰的外源线性RNA，用水补足20μl 并混合均匀，经短暂离心，于PCR仪中于16℃过夜，经95℃2分钟终止反应， 得到外源环状RNA。

纯化外源环状RNA，具体地，向得到的含有外源环状RNA的混合物中加 入以下成份：5M的醋酸铵(Ambion公司生产，货号为AM9071)10μl、浓度 为100％的乙醇200μl和水80μl，混合均匀，经短暂离心，置于-80℃冰箱(海 尔公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分钟；取出后经14000rpm 4℃离 心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液，向沉淀中加入300μl浓度为 70％的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm 4℃离心5分钟后吸去上层清液， 于室温下，空气中干燥10分钟，用于去除残留的乙醇，再用10μl无酶水溶解沉 淀，获得纯化的外源环状RNA。

步骤107：利用RNA酶R切掉未环化成功的外源线性RNA，得到外源环状 RNA，具体步骤包括：

在获得的纯化的外源环状RNA中，还有部分未环化成功的外源线性RNA， 利用RNA酶R(由Epicentre公司生产，货号为RNR07250)切掉未环化成功的 外源线性RNA。随该RNA酶R一起提供的还有10×RNA酶R反应缓冲液，向 获得的纯化的外源环状RNA中加入2μl 10×RNA酶R反应缓冲液、1μl 20U/ μl的RNA酶R和水7μl并混合均匀，经短暂离心后于40℃保温1小时，获得 去除了外源线状RNA的外源环状RNA。

步骤108：纯化去除了外源线状RNA的外源环状RNA，包括：

向获得的去除了外源线状RNA的外源环状RNA中加入以下成份：5M的醋 酸铵(Ambion公司生产，货号为AM9071)10μl、浓度为100％的乙醇200μl 和水80μl并混合均匀，经短暂离心，置于-80℃冰箱(海尔公司生产，型号为 DW-86L626)中放置30分钟，取出后经14000rpm 4℃离心25分钟，用移液器 的枪头小心吸去上层清液，向沉淀中加入300μl浓度为70％的乙醇，用于清洗 沉淀，再经14000rpm 4℃离心5分钟后吸去上层清液，于室温下，空气中干燥 10分钟，用于去除残留的乙醇，用50μl无酶水溶解沉淀，获得纯化的外源环 状RNA。

本发明实施例提供的制备外源环状RNA的方法，为了确定内源环状RNA 的表达量人工合成外源环状RNA作为参考基因，按比例加入总RNA中，以模 拟体内稳定表达的内源环状RNA。在本发明实施例提供的人工合成外源环状 RNA中，首先，所设计的外源环状RNA与外源线性RNA在体内应该没有相同 序列以及同源性高的序列，因为加入总RNA后，是无法将外源RNA与内源RNA 区分开的，若二者存在重叠，将与“参考基因恒定表达”这一实时定量基本假 设矛盾，直接影响后期定量的准确性。此外，外源基因长度也不能太长，否则 影响环化效率。考虑到合成的RNA量较大，且需要经常使用，本发明实施例将 RNA对应的DNA序列转入质粒中，质粒转入大肠杆菌中，随着大肠杆菌增殖 而增殖质粒，同时，增加了相应的DNA的量，从而灵活获得大量DNA序列。 再通过体外转录，将质粒DNA变为RNA。为此，在DNA前端设计了体外转录 启动子序列。转录成的RNA需要纯化，为了实现这一目的，又在DNA的未端 设计了寡聚T，转录后形成寡聚A尾巴，寡聚A可用于纯化RNA。合成的外源 RNA是线状，需要环化后才能成为环状RNA。由于合成时的RNA的5’端为三 磷酸基团，而连接时，需要的是单磷酸基团，为此，去掉了外源RNA的三磷酸 基团后，再加上单磷酸基团这一步，从而合成能够环化成环的前体RNA的状态， 最终将该RNA的首尾连接，闭合成环，制备成为外源环状RNA分子。将制备 的外源环状RNA加入待检样本的总RNA中，并与待检样本的总RNA一同进行 扩增，因而，可以作为内源环状RNA的参考基因，用于衡量内源环状RNA的 表达量，从而用于内源环状RNA定量检测。

实施例二

本发明实施例提供了一种定量检测环状RNA的方法，如图2所示，该方法 包括：

步骤100：采用本发明实施例一提供的方法制备外源环状RNA。

步骤200：对外源环状RNA进行质量控制。

步骤300：向待检样本与对照样本的总RNA中加入外源环状RNA，总RNA 与外源环状RNA的质量比为2000:1，得到外源环状RNA与总RNA的混合物。

步骤400：利用实时定量PCR方法分别检测外源环状RNA与总RNA的混 合物中的目标环状RNA和外源环状RNA的含量。

步骤500：以外源环状RNA为参考基因，确定待检样本中的目标环状RNA 的相对表达量。

其中，本发明实施例提供的待测样本是在实时定量PCR检测中需要检测表 达变化的样本，对照样本是实时定量PCR检测待测样本中基因表达变化时的参 照样本。

在前期研究中，利用高通量测序的方式发现在莱茵衣藻中一个表达量较高 的环状RNA，命名为环状cRNA006，cRNA006的线性序列如序列表中SEQ ID  NO:8所示，将线性的cRNA006的5’端与3’端首尾相连，便形成了环状 cRNA006。通过高通量测序等技术分析表明：与正常生长条件(对照样本：生 长温度为25℃)比较，莱茵衣藻在低温生长条件下(待测样本：生长温度为5℃， 且待测样本与对照样本的其他条件均相同)，环状cRNA006的表达量下降了2 倍以上，表明cRNA006是一个低温响应的环状RNA分子，可能具有耐冷的生 物学功能，值得进一步研究，因而，需要进一步确认其表达变化趋势。本实施 例利用所制备的外源环状RNA为参考基因，验证了cRNA006在低温条件下的 下调表达趋势。

步骤200：对外源环状RNA进行质量控制，包括：

1、利用随机引物对合成的外源环状RNA进行逆转录，合成外源cDNA， 具体地，利用分光光度计(美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中RNA定 量程序，测定并获得纯化的外源环状RNA的质量浓度，本实施例提供的外源环 状RNA的质量浓度为355ng/μl。

取获得纯化的外源环状RNA 0.5μg，与下列成分混合：5μl浓度为1μM的 6碱基随机逆转录引物(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)、2μl浓 度为10mM的dNTP、20U的逆转录酶(美国Invitrigen公司生产，货号为 18064-014)、5μl浓度为100mM的DL-二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT， 随逆转录酶一起由美国Invitrigen公司提供)和10μl 5×逆转录反应缓冲液(随 逆转录酶一起由美国Invitrigen公司提供)，用水补足50μl混匀后，经42℃保温 2小时，75℃保温15分钟，使酶失活，合成外源cDNA。

2、利用第一引物和第二引物分别对外源线性cDNA和外源环状cDNA进行 实时定量PCR扩增，并分别获得C_T1值和C_T2值，第一引物包括如序列表中SEQ  ID NO:2所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID NO:3所示的第一反向引物， 所述第二引物包括如序列表中SEQ ID NO:4所示的第二正向引物和如序列表中 SEQ ID NO:5所示的第二反向引物；其中，第一引物的扩增产物不跨越外源环状 RNA的环化连接点，使得该第一引物既可扩增外源线性cDNA，又可扩增外源 环状cDNA；第二引物或其扩增产物均跨越外源环状RNA的环化连接点，使得 该第二引物只能扩增外源环状cDNA。实时定量PCR包括两类扩增，一类利用 第一引物扩增，另一类利用第二引物扩增，两类扩增平行进行，除引物不同外， 其他所有其它反应成份与条件均相同。具体扩增过程如下：取2μl上述外源 cDNA、3μl浓度为1μM的第一引物、10μl定量PCR混合物(由Toyobo公 司生产，货号为QPS-201)和0.4μl 50倍的ROX荧光校正染料(由Toyobo公 司随QPS-201一起提供)混合均匀后，经短暂离心，在ABI StepOne实时定量 PCR仪中按如下扩增程序进行实时定量PCR扩增：95℃20秒；95℃3秒， 60℃20秒，后二步(95℃3秒，60℃20秒)共40个循环，在每一次循环的 最后一步收集荧光信号，该荧光信号的强弱用于衡量表达量的多少。

3、通过C_T1值和C_T2值以及公式计算合成的外源环状RNA 的环化比例，当环化比例超过90％时，外源环状RNA可以使用。具体步骤包括： 通过第一引物扩增获得C_T1值，该C_T1值为21.55，且第二引物采用同样的方法 进行扩增，并获得C_T2值，该C_T2值为21.45，将C_T1值和C_T2值代入公式计算 外源环状RNA的环化比例为：$2^{[C_{T}2-C_{T}1]}\times 100\%=2^{[21.45-21.55]}\times 100\%=93.30\%,$根据 外源环状RNA的环化比例超过90％时，该外源环状RNA可以使用，若外源环 状RNA的环化比例未超过90％时，则证明外源环状RNA的环化不合格，即不 能使用，需要重新制备外源环状RNA。判断该外源环状RNA的环化比例是根 据实验的经验作出的，该环化比例可以根据具体的实验要求进行调整。

步骤300：向待检样本与对照样本的总RNA中加入外源环状RNA，总RNA 与外源环状RNA的质量比为2000:1，得到外源环状RNA与总RNA的混合物， 包括：

1、提取并纯化待检样本的总RNA，包括：取对数生长期的莱茵衣藻5ml， 且所取的莱茵衣藻的数目少于4000万个，若超过4000万个，则相应减少取样 体积，经4000rpm常温离心1分钟，倒去上层的培养液后，利用Trizol试剂(由 Invirtigen公司生产，货号为15596-018)提取莱茵衣藻的总RNA并溶解于50μ l无核酸酶的水中，总RNA的提取与纯化的方法按照Trizol试剂的操作手册进 行。

2、测量纯化后的总RNA的质量浓度，包括：利用分光光度计(分光光度 计由美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中RNA定量程序，测定并获得上 述提取的莱茵衣藻的总RNA的质量浓度。在本实施例中，测定莱茵衣藻在低温 条件下(5℃)(待测样本)和正常生长条件下(25℃)(对照样本)的总RNA 的质量浓度分别为1.52μg/μl和2.00μg/μl。由此计算，提取的莱茵衣藻在低 温条件下(5℃)和正常生长条件下(25度)的总RNA的量分别为76μg和100 μg。

3、根据待检样本与对照样本的总RNA的质量浓度按照总RNA与外源环状 RNA的质量比为2000:1与外源环状RNA混合，得到外源环状RNA与总RNA 的混合物。将外源环状RNA混入总RNA后，外源环状RNA实质等同于了内源 环状RNA，因此，外源环状RNA可以作为定量检测的参考基因。1/2000的混 合比例既保证了有足够的外源环状RNA可以用于检测，也不会占用太多的内源 环状RNA的比例，对检测造成浪费。具体步骤包括：

总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1。具体地，向76μg低温 条件下(5℃)生长的衣藻总RNA和100μg正常条件下(25℃)生长的衣藻 总RNA中分别加入38ng和50ng外源环状RNA，加入后混合均匀，经短暂离 心，分别得到外源环状RNA与总RNA的混合物一(混有外源环状RNA的待测 样本)和混合物二(混有外源环状RNA的对照样本)。

步骤400：利用实时定量PCR方法分别检测外源环状RNA与总RNA的混 合物中的目标环状RNA和外源环状RNA的含量，包括：

1、利用随机引物逆转录步骤300中所述的混合物一和混合物二，分别得到 逆转录产物一和逆转录产物二，逆转录产物中包括目标环状cDNA和外源环状 cDNA。这两类逆转录仅是逆转录的对象不同，其他反应条件均相同，两类反应 同时且平行进行。

逆转录反应过程为：取0.5μg步骤300中得到的混合物一作为模板，并与 下列成分混合：5μl浓度为1μM的6碱基随机引物(由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成)、2μl浓度为10mM的dNTP、20U的逆转录酶(美国 Invitrigen公司生产，货号为18064-014)、5μl浓度为100mM的DTT(随逆转 录酶一起提供)和10μl 5×逆转录反应缓冲液(随逆转录酶一起提供)，用水补 足50μl混匀后，于42℃保温2小时，75℃保温15分钟，使酶失活。所获得的 逆转录产物为逆转录产物一。除模板换为步骤300中得到的混合物二外，按相 同的方法，获得逆转录产物二。逆转录产物一与逆转录产物二中，均包括目标 环状cDNA与外源环状cDNA。

2、利用第三引物分别对逆转录产物一和逆转录产物二中的目标环状cDNA 进行检测；利用第二引物分别对逆转录产物一和逆转录产物二中的外源环状c DNA进行检测。为避免线性RNA分子的干扰，第二引物与第三引物的扩增产 物均跨越了外源环化RNA的环化连接点，只能对环状RNA分子进行扩增。第 三引物包括如序列表中SEQ ID NO:6所示的第三正向引物和如序列表中SEQ ID  NO:7所示的第三反向引物，第三引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合 成。

该实时定量PCR包括四类：第一类为第三引物对逆转录产物一中的目标环 状cDNA进行定量PCR检测，扩增后获得C_T3值；第二类为第三引物对逆转录 产物二中的目标环状cDNA进行定量PCR检测，扩增后获得C_T4值；第三类为 第二引物对逆转录产物一中的外源环状cDNA进行PCR扩增，扩增后获得C_T5 值；第四类为第二引物对逆转录产物二中的外源环状cDNA进行PCR扩增，扩 增后获得C_T6值。在四类实时定量PCR过程中，除以上引物及逆转录产物不同 外，其它成份均完全一样，且这四类反应同时并平行进行。

进一步地，第一类实时定量PCR反应：取2μl逆转录产物一作为模板、3 μl浓度为1μM的第三引物(正向引物和反向引物的混合物)、10μl定量PCR 混合物(由日本Toyobo公司生产，货号为QPS-201)和0.4μl 50倍的ROX荧 光校正染料(由日本Toyobo公司生产，并且随定量PCR混合物一起提供)。将 以上混合物混合均匀，短暂离心，在ABI StepOne实时定量PCR仪中按如下程 序进行实时定量PCR检测：95℃20秒；95℃3秒，60℃20秒，共40个循 环，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，荧光信号的强弱用于衡量cDNA 量的多少。通过以上程序，获得C_T3值为22.01。按照第一类实时定量PCR反 应进行其余三类反应，并获得C_T4值为25.45、C_T5值为27.33、C_T6值为29.56。

步骤500：待检样本中的目标环状RNA的比例为：

$2^{[C_{T}3+C_{T}6-C_{T}5-C_{T}4]}\times 100\%=2^{[22.01+29.56-27.33-25.45]}\times 100\%=43.23\%.$从这一结果来看， 本发明实施例中的莱茵衣藻经低温处理后，其中的环性cRNA006比在正常温度 下生长的莱茵衣藻中的环形cRNA006的表达量下降了43.22％。这一值与前期研 究中利用高通过量测序表明低温处理下降了2倍的结果相吻合，表明本方案可 以用于正确评价内源环状RNA表达量的变化。

本发明实施例提供的定量检测内源环状RNA的方法，将制备的外源环状 RNA加入待检样本与对照样本的总RNA中，并与待检样本与对照样本的总RNA 一同进行扩增与检测。因而，外源环状RNA实质上已经等同于了稳定表达的内 源环状RNA，可以作为不同样本间检测内源环状RNA表达量时的参考基因， 解决了没有内源环状RNA参照基因的难题，从而实现了对内源环状RNA表达 量检测的目的。本发明首次实现了内源环状RNA实时定量PCR检测，以外源 环状RNA作为参考基因用于准确检测内源环状RNA表达量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。