基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法。本发明从光合作用能流角度出发，采用叶绿素荧光作为光合作用的探针，提出一种浮游植物叶绿素荧光的可变光脉冲诱导方法，将复杂的光合作用能流过程分段，通过分析不同诱导模式下叶绿素荧光动力学曲线，分段获得主导光合作用能流效率的光合参数；在此基础上，根据生物膜能流过程，建立基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率的定量分析方法，实现浮游植物光合作用状态和生长潜能的实时快速检测，为发展现场原位测量技术提供方法基础。

说明书

技术领域

本发明属于环境科学领域，具体涉及一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合速 率快速检测方法。

背景技术

浮游植物是自然水体初级生产者，其光合组织虽然不到全球总植被生物量的 1％，但其生产力约占总植物生产力45％，光合固碳量占全球总固碳量40％^[1]，对 维持水体生态系统的正常运转至关重要。近些年随着我国水质富营养化程度加 剧，浮游植物过量繁殖，水华和赤潮灾害频发，特别是自20世纪70年代以来， 水华和赤潮发生频率以每10年增加3倍的速度不断上升，已经严重危害生态环 境，极大地影响了渔业、旅游业、水产养殖业的发展，实时快速监测浮游植物的 生长潜能是预测、防治水华和赤潮灾害的关键。浮游植物光合速率是其生长潜能 和光合作用状态的指示剂，实时快速测量浮游植物光合速率对研究水体初级生长 力、防治水华和赤潮灾害具有重要的现实意义。

目前，浮游植物光合速率是通过测量光合作用过程中反应物消耗速率或产物 生成速率间接获得，包括光合放氧测定法、CO₂吸收测定法和有机物积累分析法 等。然而，这些传统光合速率分析方法大多采用现场采样后离线分析方式，测量 周期长、效率低、时效性差且手续繁琐。更为重要的是传统方法离线分析过程已 经改变浮游植物生长环境，影响了浮游植物生理状态，只能获得实验模拟环境下 的光合速率，难以对自然条件下浮游植物光合速率进行快速准确测量。

发明内容

针对浮游植物光合作用状态和生长潜能的实时快速监测需求，本发明从光合 作用能流角度出发，以叶绿素荧光作为浮游植物光合作用的探针，利用可变光脉 冲诱导叶绿素荧光，分段研究浮游植物光合作用能流过程，获取主导光合作用能 流效率的光合参数，建立基于叶绿素荧光的光合速率的定量分析方法，实现浮游 植物光合速率的实时快速检测，为发展现场原位测量技术提供方法基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法，包括以下步骤：

(1)设计快速可变光脉冲激发策略，实现光合作用能流过程的分段

浮游植物细胞经暗适应后，参与Calvin循环的几种酶失去活性，重新照光 后需要经过一个光合诱导期才能正常运行；在光合诱导期内，所有的电子受体均 可以接收电子被还原，却不能及时给出电子被氧化，存在一个单电子周转期，不 同电子受体单周转的周期不同；在单周转期内，强光照射促使能够接收电子的电 子受体数快速减少至零，电子传递链被阻塞，叶绿素荧光快速上升至最大；单周 转期后，电子受体再氧化给出电子，叶绿素荧光开始弛豫下降；

Q_A、Q_B和PQ单周转周期分别为100μs、1ms和10-20ms，是电子传递链中的 容易产生电子阻塞的三个电子受体，本发明采用快速可变的光脉冲作激发光源， 通过调节光脉冲振幅、频率、占空比和激发时序，设计不同的激发策略，选择性 还原Q_A、Q_B和PQ，获取不同诱导模式下的叶绿素荧光动力学曲线；

①Q_A饱和快相荧光动力学曲线

在不造成光损伤的情况下，采用占空比大的高强度快速光脉冲，在Q_A单电子 周转内产生足够高的能量累积，将其全部还原，打断光合作用的电子传递链，获 得Q_A饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与Q_A之前光合能流过程有关；

②Q_B饱和快相荧光动力学曲线

Q_A单周转期后，电子向后传递给Q_B；通过降低脉冲光瞬时光强和占空比，在 Q_B单周转期内使Q_A发生更多氧化还原反应，将电子传递到Q_B，将其全部还原，阻 塞电子传递链，获得Q_B饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与Q_B之前光合能流 过程有关；

③PQ饱和快相荧光动力学曲线

再次降低脉冲光瞬时光强和占空比，在PQ单周转期内使Q_B发生更多氧化还 原反应，将电子传递到PQ，将其全部还原，阻塞光电子传递链，产生PQ饱和快 相荧光动力学曲线，该曲线取决于PQ之前光合能流过程；

④PQ饱和弛豫荧光动力学曲线

PQ电子饱和后，关闭饱和光脉冲，使用微弱探测光脉冲激发，为了减小探测 光对光合作用过程影响，探测光脉冲需要保持较低光强和占空比；PQ饱和模式 下，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单周转期结束，PQ 重新被氧化，电子向后传递，探测光脉冲诱导荧光出现弛豫下降过程，该过程仅 与PQ后光合能流过程有关；

(2)分析叶绿素荧光动力学曲线，获取主导光合作用能流效率的光合参数

在浮游植物光合诱导期内，强光照射促使能够接收电子的电子受体数快速减 少至零，叶绿素a分子吸收的激发能就不再参与光化学反应，表现为叶绿素荧光 的快速上升；过了光合诱导期后，Calvin循环得以正常运行，叶绿素荧光开始 弛豫下降；根据浮游植物光合作用能量传递模型，该叶绿素荧光动力学过程f(t) 可以表示为激发光能I(t)、功能吸收截面σ_PSII、光化学反应电荷分离效率η和 电子受体再氧化动力学过程的函数；

$f\left(t\right)=F_0+(F_m-F_0)C\left(t\right)\frac{\eta }{1-C\left(t\right)(1-\eta )}---\left(1\right)$

F_o为所有PSII反应中心都打开时的初始荧光，F_m为PSII反应中心全部关闭 时的最大荧光，C(t)是t时刻PSII反应中心关闭比例或关闭状态。C(t)取决于 激发光能I(t)至PSII的传递速率和Q_A的再氧化速率，可由下式表示：

$C\left(t\right)={\sigma }_{\mathrm{PSII}}{\int }_0^{t}I\left(v\right)\frac{1-C\left(v\right)}{1-C\left(v\right)(1-\eta )}g(t-v)\mathrm{dv}---\left(2\right)$

函数g(t)描述了t时刻Q_A的再氧化动力学过程，取决于其后的电子传递速 率可由下式表示：

然而，由于公式(1)-(3)非线性很强，不存在能够描述叶绿素荧光信号与激 发信号之间函数关系的解析解。在本发明专利中，采用快速光脉冲和高速采样率 测量叶绿素荧光动力学曲线，公式(1)-(3)可离散化为公式(4)-(6)的递归形式：

$f_n=F_0+(F_m-F_0)C_n\frac{\eta }{1-C_n(1-\eta )}---\left(4\right)$

f_n为第n个光脉冲的叶绿素荧光采样值，C_n为第n个脉冲时PSII反应中心 关闭状态，表示如下：

$C_n=C_{n-1}{\Sigma }_{k=1}^4{A}_{n,k}+I_n{\sigma }_{\mathrm{PSII}}\frac{1{-C}_{n-1}{\Sigma }_{k-1}^1{A}_{n,k}}{1-(1-\eta )C_{n-1}{\Sigma }_{k-1}^4{A}_{n,k}}---\left(5\right)$

I_n为第n个光脉冲的激发能量，A_n,k取决于Q_A及其后的电子受体的再氧化动 力学过程：

α_k和分别是各电子受体的再氧化幅值常数和电子传递速率，Δt是光脉冲 周期；理论上通过(4)-(6)式对f_n进行拟合，便可反演得到之前列举的所有的荧 光参数；

然而，(4)-(6)式中共有功能吸收截面、电子传递速率等7个光合参数，直 接进行荧光动力学曲线拟合仍无法得到准确的数值解；因此，在本发明中，通过 分析Q_A、Q_B和PQ饱和模式下的快相荧光和弛豫荧光，分段研究光合作用过程， 以减少拟合参数个数，使拟合函数对某个或几个参数更加敏感，获得准确有效的 光合参数；

①Q_A饱和快相荧光分析

QA饱和模式下，电荷在Q_A处累积，电子传递链中断，荧光快速上升，得到 PSII的最大荧光产率F_m、初始荧光产率F_o；该快相荧光过程与Q_A后的电子传递 过程无关，(4)-(6)式得以简化：

$f_n=F_0+(F_m-F_o)C_n\frac{\eta }{1-C_n(1-\eta )}---\left(7\right)$

$C_n=C_{n-1}+I_n{\sigma }_{\mathrm{PSII}}\frac{1-C_{n-1}}{1-(1-\eta )C_{n-1}}---\left(8\right)$

通过(7)、(8)式对Q_A饱和模式的快相荧光进行曲线拟合，可得到有效吸收截 面σ_PSII和电荷分离效率η。同时,可计算出最大光量子效率Δφ＝(F_n-F₀)/F_m；

②Q_B饱和快相荧光分析

Q_B饱和模式下，电荷在Q_B处累积，该快相荧光过程与Q_B后的电子传递过程无 关，Fo、Fm、σ_PSII和η保持不变且已知，通过(4)-(6)式分析Q_B饱和下的快相荧 光曲线能够准确得到Q_A到Q_B间电子传递速率

③PQ饱和快相荧光分析

PQ饱和模式下，电荷在PQ处累积，该快相荧光过程与PQ后的电子传递过程 无关，同理通过Q_B饱和下的快相荧光分析可准确得到Q_B到PQ间电子传递速率

④PQ饱和弛豫荧光分析

PQ电子饱和后，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单 周转期结束，PQ再氧化过程开启，在PQ处累积的电荷向后传递，光合作用正向 电子传递效率非常高，逆向电子传递过程可以忽略，荧光呈现弛豫下降过程，该 过程仅与PQ后光合能流过程有关。通过(5)式，即可拟合出PQ至PSI电子传递 速率和PSI至Fd的电子传递速率

(3)结合生物膜能流理论，建立浮游植物光合速率叶绿素荧光分析方法

浮游植物光合速率是活体细胞对光能吸收、转化和利用效率，即参与光化学 反应能量占激发光能量的比例；根据生物膜能流理论，浮游植物光合速率与最大 光量子效率，光能的吸收效率σ_PSII，电荷分离效率η，以及Q_A、Q_B、PQ、PSI和 Fd等主要电子受体间的电子传递速率等光合参数线性相关，具 体可由(9)式计算：

通过(9)式建立基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率的定量分析方法，实 现浮游植物光合作用状态和生长潜能的实时快速检测。

本发明基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法也可用于高等植 物光合速率快速测定。

本发明基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法，为发展自然条件 下浮游植物光合速率的现场原位监测技术提供方法基础。本发明的有益效果如 下：

(1)从光合作用能流角度出发，以叶绿素荧光作为浮游植物光合作用的探 针，分析光合作用过程能流效率，直接快速获得浮游植物光合速率。该方法与传 统光合放氧、CO₂吸收和植物生长分析法相比，具有分析简便、快速、无需样品 预处理、无污染和无破坏性等特点，是浮游植物光合速率现场原位测量的新途径；

(2)浮游植物荧光动力学受诸多的光合作用参数影响，现有叶绿素荧光技 术难以全面解析复杂的光合作用过程，准确获得光合作用能流效率。本发明专利 提出一种浮游植物叶绿素荧光的可变光脉冲诱导方法，将复杂的光合作用能流过 程分段，通过分析不同诱导模式下叶绿素荧光动力学曲线，分段实现浮游植物光 合作用信息准确有效检测。

附图说明

图1为本发明浮游植物光合作用能量传递模型图；图中光合作用捕光色素 LHCII吸收光能激发叶绿素a分子，激发态叶绿素a分子共有三种去活化途径， 参与光化学反应、以热能形式耗散H和向外辐射荧光F。其中光化学反应是利用 激发能进行原初电荷分离，产生的电子经原初电子受体Q_A和次级电子受体Q_B、PQ 并最终转化为植物生长需要的化学能P，参与Calvin循环。

具体实施方式

一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法，包括以下步骤：

(1)设计快速可变光脉冲激发策略，实现光合作用能流过程的分段

浮游植物细胞经暗适应后，参与Calvin循环的几种酶失去活性，重新照光 后需要经过一个光合诱导期才能正常运行；在光合诱导期内，所有的电子受体均 可以接收电子被还原，却不能及时给出电子被氧化，存在一个单电子周转期，不 同电子受体单周转的周期不同；在单周转期内，强光照射促使能够接收电子的电 子受体数快速减少至零，电子传递链被阻塞，叶绿素荧光快速上升至最大；单周 转期后，电子受体再氧化给出电子，叶绿素荧光开始弛豫下降；

Q_A、Q_B和PQ单周转周期分别为100μs、1ms和10-20ms，是电子传递链中的 容易产生电子阻塞的三个电子受体，本发明采用快速可变的光脉冲作激发光源， 通过调节光脉冲振幅、频率、占空比和激发时序，设计不同的激发策略，选择性 还原Q_A、Q_B和PQ，获取不同诱导模式下的叶绿素荧光动力学曲线；

①Q_A饱和快相荧光动力学曲线

在不造成光损伤的情况下，采用占空比大的高强度快速光脉冲，在Q_A单电子 周转内产生足够高的能量累积，将其全部还原，打断光合作用的电子传递链，获 得Q_A饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与Q_A之前光合能流过程有关；

②Q_B饱和快相荧光动力学曲线

Q_A单周转期后，电子向后传递给Q_B；通过降低脉冲光瞬时光强和占空比，在 Q_B单周转期内使Q_A发生更多氧化还原反应，将电子传递到Q_B，将其全部还原，阻 塞电子传递链，获得Q_B饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与Q_B之前光合能流 过程有关；

③PQ饱和快相荧光动力学曲线

再次降低脉冲光瞬时光强和占空比，在PQ单周转期内使Q_B发生更多氧化还 原反应，将电子传递到PQ，将其全部还原，阻塞光电子传递链，产生PQ饱和快 相荧光动力学曲线，该曲线取决于PQ之前光合能流过程；

④PQ饱和弛豫荧光动力学曲线

PQ电子饱和后，关闭饱和光脉冲，使用微弱探测光脉冲激发，为了减小探测 光对光合作用过程影响，探测光脉冲需要保持较低光强和占空比；PQ饱和模式 下，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单周转期结束，PQ 重新被氧化，电子向后传递，探测光脉冲诱导荧光出现弛豫下降过程，该过程仅 与PQ后光合能流过程有关；

(2)分析叶绿素荧光动力学曲线，获取主导光合作用能流效率的光合参数

在浮游植物光合诱导期内，强光照射促使能够接收电子的电子受体数快速减 少至零，叶绿素a分子吸收的激发能就不再参与光化学反应，表现为叶绿素荧光 的快速上升；过了光合诱导期后，Calvin循环得以正常运行，叶绿素荧光开始 弛豫下降；根据浮游植物光合作用能量传递模型，该叶绿素荧光动力学过程f(t) 可以表示为激发光能I(t)、功能吸收截面σ_PSII、光化学反应电荷分离效率η和 电子受体再氧化动力学过程的函数；

$f\left(t\right)=F_0+(F_m-F_0)C\left(t\right)\frac{\eta }{1-C\left(t\right)(1-\eta )}---\left(1\right)$

F_o为所有PSII反应中心都打开时的初始荧光，F_m为PSII反应中心全部关闭 时的最大荧光，C(t)是t时刻PSII反应中心关闭比例或关闭状态。C(t)取决于 激发光能I(t)至PSII的传递速率和Q_A的再氧化速率，可由下式表示：

$C\left(t\right)={\sigma }_{\mathrm{PSII}}{\int }_0^{t}I\left(v\right)\frac{1-C\left(v\right)}{1-C\left(v\right)(1-\eta )}g(t-v)\mathrm{dv}---\left(2\right)$

函数g(t)描述了t时刻Q_A的再氧化动力学过程，取决于其后的电子传递速 率可由下式表示：

然而，由于公式(1)-(3)非线性很强，不存在能够描述叶绿素荧光信号与激 发信号之间函数关系的解析解。在本发明专利中，采用快速光脉冲和高速采样率 测量叶绿素荧光动力学曲线，公式(1)-(3)可离散化为公式(4)-(6)的递归形式：

$f_n=F_0+(F_m-F_0)C_n\frac{\eta }{1-C_n(1-\eta )}---\left(4\right)$

f_n为第n个光脉冲的叶绿素荧光采样值，C_n为第n个脉冲时PSII反应中心 关闭状态，表示如下：

$C_n=C_{n-1}{\Sigma }_{k=1}^4{A}_{n,k}+I_n{\sigma }_{\mathrm{PSII}}\frac{1{-C}_{n-1}{\Sigma }_{k-1}^1{A}_{n,k}}{1-(1-\eta )C_{n-1}{\Sigma }_{k-1}^4{A}_{n,k}}---\left(5\right)$

I_n为第n个光脉冲的激发能量，A_n,k取决于Q_A及其后的电子受体的再氧化动 力学过程：

α_k和分别是各电子受体的再氧化幅值常数和电子传递速率，Δt是光脉冲 周期；理论上通过(4)-(6)式对f_n进行拟合，便可反演得到之前列举的所有的荧 光参数；

然而，(4)-(6)式中共有功能吸收截面、电子传递速率等7个光合参数，直 接进行荧光动力学曲线拟合仍无法得到准确的数值解；因此，在本发明中，通过 分析Q_A、Q_B和PQ饱和模式下的快相荧光和弛豫荧光，分段研究光合作用过程， 以减少拟合参数个数，使拟合函数对某个或几个参数更加敏感，获得准确有效的 光合参数；

①Q_A饱和快相荧光分析

QA饱和模式下，电荷在Q_A处累积，电子传递链中断，荧光快速上升，得到 PSII的最大荧光产率F_m、初始荧光产率F_o；该快相荧光过程与Q_A后的电子传递 过程无关，(4)-(6)式得以简化：

$f_n=F_0+(F_m-F_o)C_n\frac{\eta }{1-C_n(1-\eta )}---\left(7\right)$

$C_n=C_{n-1}+I_n{\sigma }_{\mathrm{PSII}}\frac{1-C_{n-1}}{1-(1-\eta )C_{n-1}}---\left(8\right)$

通过(7)、(8)式对Q_A饱和模式的快相荧光进行曲线拟合，可得到有效吸收截 面σ_PSII和电荷分离效率η。同时,可计算出最大光量子效率Δφ＝(F_n-F₀)/F_m；

②Q_B饱和快相荧光分析

Q_B饱和模式下，电荷在Q_B处累积，该快相荧光过程与Q_B后的电子传递过程无 关，Fo、Fm、σ_PSII和η保持不变且已知，通过(4)-(6)式分析Q_B饱和下的快相荧 光曲线能够准确得到Q_A到Q_B间电子传递速率

③PQ饱和快相荧光分析

PQ饱和模式下，电荷在PQ处累积，该快相荧光过程与PQ后的电子传递过程 无关，同理通过Q_B饱和下的快相荧光分析可准确得到Q_B到PQ间电子传递速率

④PQ饱和弛豫荧光分析

PQ电子饱和后，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单 周转期结束，PQ再氧化过程开启，在PQ处累积的电荷向后传递，光合作用正向 电子传递效率非常高，逆向电子传递过程可以忽略，荧光呈现弛豫下降过程，该 过程仅与PQ后光合能流过程有关。通过(5)式，即可拟合出PQ至PSI电子传递 速率和PSI至Fd的电子传递速率

(4)结合生物膜能流理论，建立浮游植物光合速率叶绿素荧光分析方法

浮游植物光合速率是活体细胞对光能吸收、转化和利用效率，即参与光化学 反应能量占激发光能量的比例；根据生物膜能流理论，浮游植物光合速率与最大 光量子效率，光能的吸收效率σ_PSII，电荷分离效率η，以及Q_A、Q_B、PQ、PSI和 Fd等主要电子受体间的电子传递速率等光合参数线性相关，具 体可由(9)式计算：

通过(9)式建立基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率的定量分析方法，实 现浮游植物光合作用状态和生长潜能的实时快速检测。