基于纳米材料复合物的溶胶凝胶分子印迹电化学传感器检测丙烯酰胺的方法

摘要

一种基于纳米材料复合物的溶胶凝胶分子印记电化学传感器检测丙烯酰胺的方法，该方法是将碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖的复合物覆于玻碳电极表面后，将其置于含模板分子、功能单体、交联剂的溶胶凝胶溶液中进行电化学沉积，反应完成后除去模板分子，得到的分子印迹电化学传感器直接对样品中的丙烯酰胺进行检测。上述碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖的复合物是将碳纳米管表面的-COOH经过修饰后带上-SH，利用纳米金和-SH间的强化学作用使金纳米粒子与碳纳米管形成稳定的化合物，然后将得到的化合物和壳聚糖混合制得。本发明方法简单，且样品前处理操作简单，检测速度快，成本低廉。此外，本方法具有好的选择性和重现性，回收率符合要求，可直接对薯片等油炸食品中的丙烯酰胺进行检测，具有重要的实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及食品有害成分的检测和电化学传感器领域，具体的是涉及一种检测丙烯酰胺的溶胶凝胶分子印迹的电化学传感器方法。 

背景技术

丙烯酰胺(acrylamide,AM)是一种白色晶体物质，室温下稳定，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂。AM对人体有明显毒性，可造成人体神经系统的损害。动物实验和体外细胞实验都证明AM可导致遗传物质改变和癌症的发生。AM被国际癌症研究机构(IARC)列为2A类致癌物(ⅡA)。 

2002年4月，食品中首次发现AM，以薯条为代表的富含碳水化合物的高温加工食品中尤为丰富。研究表明，食品中的AM主要是由于马铃薯和谷类食品原料中的天冬酰胺通过美拉德反应在经过高温烹调后生成。2005年，WHO与FAO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)第64次会议对AM进行了系统的危险性评估，并警告公众关注食品中的AM，呼吁采取措施减少食品中AM含量，以确保食品安全。我国将食品中丙烯酰胺的检测列为“十五”国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题，卫生部食品安全计划也将食品中丙烯酰胺的检测方法的建立和我国食品中AM分布调查作为一个重要内容。 

目前，食品中丙烯酰胺含量的检测主要是应用现代色谱技术(GC,LC)等与质谱法(MS)串联，如液-质联用法(LC-MS)、气-质联用法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱分析法(LC-MS/MS)等方法。该些方法在分析时间、成本及普及性方面各有长短，但是样品前处理比较复杂，操作繁琐，检测时间长，成本高，且这些分析方法仪器设备贵重，需专业人员进行操作。 

发明内容

本发明的目的是，针对目前现有食品中丙烯酰胺的检测方法中存在的样品 前处理复杂，操作繁琐，检测时间长、成本高的问题，提供一种基于纳米材料复合物的溶胶凝胶分子印迹电化学传感器检测丙烯酰胺的方法，该方法具有良好的灵敏度，特异性，重现性和回收率，可用于实际食品样品中丙烯酰胺的检测。 

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于纳米材料复合物的溶胶凝胶分子印迹电化学传感器检测丙烯酰胺的方法，该方法是将修饰有碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖的复合物的玻碳电极，置于含有丙烯酰胺的溶胶凝胶溶液中进行电化学沉积，制得分子印迹电化学传感器，用该传感器对样品中的丙烯酰胺直接进行检测。 

上述溶胶凝胶分子印迹传感器直接检测丙烯酰胺的具体过程如下，结合参见图1： 

1、金钠米粒子溶液的制备：按1ml 1％HAuCl₄溶液加99ml超纯水的比例，将HAuCl₄溶液和超纯水混合，在150-250r/min，220℃下，于磁力搅拌器加热至沸腾后，再按100ml0.01％HAuCl₄溶液加2.4ml1％柠檬酸三钠溶液的比例，迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热8-12min，待溶液由灰色到透亮的红色后停止加热，再搅拌8-12min，冷却至室温,就制得所需的金纳米粒子溶液。将得到的金纳米粒子溶液置于4℃冰箱中备用。 

2、碳纳米管(MWNT)的活化：将碳纳米管置于混酸(浓硫酸和浓硝酸按体积比3:1混合)中超声处理3-4h(每25mg碳纳米管需加4ml混酸)，将得到的碳纳米管溶液用超纯水离心(9000-11000r/min，4-6min)冲洗至中性，即可得到羧基化的碳纳米管(MWNT-COOH)。 

3、碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖复合物的制备：在室温下，将活化后的MWNT先在体积比为1:1的50mg/mLEDC和50mg/mL NHS的混合液中孵化0.5-1.5h(每1mg活化后的碳纳米管加1ml混合液)，再于半胱胺中孵化0.5-1.5h(每1mg活化后的碳纳米管加1ml半胱胺)，使其表面带有巯基，再用超纯水冲洗， 在室温下干燥后与上述金纳米粒子溶液混合0.5-1.5h(1mg带巯基的碳纳米管加1ml金纳米粒子溶液)，得到碳纳米管与金纳米粒子的复合物。然后按体积比1:2的比例将碳纳米管与金纳米粒子的复合物与2.0wt％壳聚糖溶液混合均匀。 

4、溶胶凝胶溶液的制备：按0.4g-0.6g丙烯酰胺加4-5mL的四氢呋喃溶液的比例，将丙烯酰胺加入到四氢呋喃溶液中溶解，再于溶解液中按0.4g-0.6g丙烯酰胺加0.2mL功能单体3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的比例加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，以250-350r/min搅拌反应10-15min，最后于溶解液中按0.4g-0.6g丙烯酰胺加0.8mL交联剂四乙氧基硅烷(TEOS)和0.3mL 0.1mol/L的氨水的比例加入四乙氧基硅烷和氨水，以250-350r/min搅拌反应2h，即得。 

5、传感器的构建：取10-15μL碳纳米管、金纳米和壳聚糖的复合物滴涂到玻碳电极上，室温干燥，将修饰好的电极置于制得的溶胶凝胶溶液中，在三电极体系下利用循环伏安法扫描30圈进行电沉积。将印迹完的电极置于室温下干燥过夜后再用纯乙醇溶液振荡洗脱，将洗脱后的电极继续置于室温下干燥后，置于含有5.0mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合液及0.1M KCl的5mL 0.1M PBS(pH 7.4)的溶液中，采用差分脉冲伏安法对样品中的丙烯酰胺进行直接检测。 

本发明是先通过将碳纳米管表面的-COOH经过氨基偶联的方法，使其表面连有-SH，利用金纳米和-SH间的强化学作用使金纳米粒子与碳纳米管形成稳定的聚合物，然后将得到的聚合物和壳聚糖混合制得复合物，再将纳米材料与分子印迹凝胶-溶胶技术相结合。 

与现有技术相比，本发明的优点如下： 

1、本发明将碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖的复合物覆于玻碳电极表面，利用碳纳米管、金纳米粒子的双重强导电性，提高了电流的敏感性，利用壳聚糖的黏附性，增强了溶胶凝胶分子印记膜在玻碳电极上的稳定性，使得该传感器既具有较好的灵敏度和较强的稳定性，最低检测限为0.028μg/mL。 

2、本发明有效地将碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖的复合物与分子印迹溶 胶-凝胶技术相结合。通过分子印迹溶胶-凝胶技术在该修饰了碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖复合物的玻碳电极表面，制备了丙烯酰胺的分子印迹膜进行丙烯酰胺的检测。该技术不仅操作条件温和，容易制备，还可明显提高分子印迹的选择性和材料的稳定性。此外该传感器检测速度快，成本低廉，样品前处理操作简单，具有良好的特异性、重现性和回收率，直接对食品中的丙烯酰胺进行检测，具有重要的实际应用价值。 

附图说明

图1为本发明的传感器构建示意图。 

图2为本发明的特异性对比图。 

图3为本发明检测丙烯酰胺的标准曲线和线性关系图。 

具体实施方式

实施例1本发明构建的传感器特异性实验 

将同一浓度(1μg mL^-1)的AM、丙酮、天门冬酰胺、乙酸分别在本发明制得的分子印迹电化学传感器上孵育30min，再进行差分脉冲伏安法测量，对比检测结果。取丙酮、丙醛、乙酸分别和AM进行混合后，使其终浓度为1μg mL^-1，分别在本发明制得的分子印迹电化学传感器上进行孵育30min，再进行差分脉冲伏安法测量，对比检测结果。结果表明，本发明构建的传感器有较好的特异性，结合参见图2。 

实施例2检测丙烯酰胺标准曲线的建立 

将本发明构建好的传感器置于含有5.0mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合液及0.1M KCl的5mL 0.1M PBS(pH7.4)的溶液中，对不同浓度的丙烯酰胺(0-15.0μg/mL，n＝3)进行测量进行测定，建立检测丙烯酰胺的标准曲线，其线性范围为0.05-5μg mL^-1，最低检测限为0.028μg/mL，见图3。 

实施例3加标回收实验 

薯片样品：薯片经高效液相色谱法进行检测，获知其所含丙烯酰胺的含量， 然后取适量丙烯酰胺标样添加到样品中，设置0.1，0.2、1、2、4μg/mL 5个浓度，每个浓度设3个重复，进行测定。 

样品前处理：取5g左右薯片样品置于研钵中研碎，向样品中加入不同质量的丙烯酰胺标准品，然后将样品转移到50mL离心管中，加入10mL正己烷除脂，氮吹仪吹干，然后加入20mL超纯水超声提取15min，用0.22μm的水系过滤膜过滤备用。 

实验结果见表1，薯片回收率实验回收率为81.4-94.8％，变异系数为2.06-4.28％，回收率在允许范围内。 

表1 回收率实验结果 

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