用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了一种用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒及其使用方法，用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒；包括非离子去垢剂Ⅰ、离子去垢剂Ⅰ、离子去垢剂Ⅱ、高渗溶液、低渗溶液、等渗溶液、核酸去除剂和组织疏松剂。本发明提供的试剂盒及使用该试剂盒的方法能够在短时间内能够获取多器官和组织的去细胞支架，同时保留细胞外基质的结构和大部分结构，从而再生医学和组织工程的研究和运用提供产品材料。

说明书

技术领域

本发明涉及获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒，具体涉及用于去除不同器官和组织抗原成分的试剂盒。本发明还设计使用所述试剂盒获得多器官和组织支架的方法。

背景技术

近几年去细胞组织工程发展迅速，目前多种组织来源的去细胞支架已成功运用到在组织工程和再生医学中，如皮肤，血管，神经，小肠粘膜下层以及肝脏等。除了上述较成熟的去细胞组织外，许多动物的全器官去细胞支架也已成功制备，比如心脏，肝脏，肾脏，肺脏，脊髓等，在组织器官移植需求紧张的现状下，为异体移植打下了扎实的基础。但是每种全器官或组织去细胞支架的制备方法复杂多样，所用的试剂也较为杂乱，缺乏系统的整理。

程远等人公开了一种制备肝脏去细胞的试剂盒及其使用方法，尽管上述试剂盒依次利用溶栓液、灌注液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ依次对肝脏进行灌注能够制得去细胞肝脏支架，但是其试剂盒只能应用于制备部分动物的肝脏的去细胞支架，而且步骤比较繁琐，并且由于方法和试剂的较为单一无法满足其他器官和组织去细胞的要求，因此应用范围过于狭小；柴家科等人公开了无细胞毒性去细胞真皮基质的制备及应用，在不利用洗涤剂的前提下提供了效果良好的去细胞方案，然而最终检测可看出DNA残留量很大，因此抗原性的增强势必对其在体实用性产生巨大的影响。现有的去细胞方法以及去细胞试剂盒仅应用于一种器官或组织，面向市场的范围很狭小，商业价值较低。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明提出了一种用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒及其使用方法。

用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒，包括非离子去垢剂Ⅰ、离子去垢剂Ⅰ、离子去垢剂Ⅱ、高渗溶液、低渗溶液、等渗溶液、核酸去除剂和组织疏松剂。

所述的非离子去垢剂采用的溶质为TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)，溶剂为等渗无菌的PBS缓冲溶液，其体积比为0.1%～10%；

所述的离子去垢剂Ⅰ采用的溶质为十二烷基硫酸钠SDS，溶剂为等渗无菌的PBS缓冲溶液，其体积比为0.1%～10%；

所述的离子去垢剂Ⅱ采用的溶质为脱氧胆酸钠，溶剂为等渗无菌的PBS缓冲溶液，其体积比为0.1%～10%；

所述的等渗溶液的浓度为0.01M的PBS缓冲溶液，并经过高温高压灭菌；

所述的高渗溶液浓度为0.2M的PBS缓冲溶液，并经过高温高压灭菌；

所述的低渗溶液浓度为0.005M的PBS缓冲溶液，并经过高温高压灭菌；

所述的核酸去除剂采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液；

所述的组织疏松剂为由EDTA(乙二胺乙二酸)和胰酶溶于无菌等渗PBS配制，其中EDTA浓度为3.2%，胰酶浓度为4%；

用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒的使用方法， 

目标对象为神经组织，置于-80℃～-20℃的低温冰箱1～2h，1～2h后在25℃～45℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液或生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，离子去垢剂中I振荡处理4～8h，然后置于高渗溶液中震荡4～8h，核酸酶去除剂处理30min～60min，等渗溶液冲洗2～24h，即可制备得到神经组织类去细胞支架。试剂处理的优选振荡速度为100～300rpm/min，试剂处理均连续进行，振荡速度的选择与不同物种来源的组织有关，以振荡速度不实质性地损伤组织完整性为宜，例如人的脊髓去细胞振荡速度为100rpm/min，振荡时可以采取相似的速度。

目标对象功能型复杂的全器官去细胞的流程，置于-80℃～-20℃的低温冰箱12～48h，12～48h后在25-45℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液或生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，在低渗溶液中灌注组织疏松剂15min～60min，非离子去垢剂中灌注组织疏松剂处理6～24h，然后用PBS粉末配制的低渗溶液中灌注组织疏松剂15min～60min，核酸酶去除剂处理30min～60min，等渗溶液冲洗2～24h，即可制备得到上述器官的去细胞支架，上述有脉管系统的器官均灌注去细胞，肝脏以门静脉灌注，肾脏以肾动脉灌注，优选的灌注速度为1～500ml/min,所有步骤均连续进行，灌注速度的选择与不同物种来源的器官有关，以灌注速度不实质性地损伤支架为宜，例如人肾脏的去细胞灌流速度为15ml/min，灌注时可以采用相似的速度。上述去垢剂第一次灌注时，会使器官从土黄色变成乳白色，去垢剂第二次灌注时，逐渐会使器官变成透明。

目标对象为功能单一的全器官的去细胞的流程，置于-80℃～-20℃的低温冰箱12～48h，12～48h后在25℃～45℃的等渗无菌PBS缓冲溶液中解冻，用等渗溶液或生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，用低渗溶液中灌注组织疏松剂15min～60min，非离子去垢剂中灌注组织疏松剂处理6～24h，核酸酶去除剂处理30min～60min，等渗溶液冲洗2～24h，即可制备得到上述器官的去细胞支架上述有脉管系统的器官均灌注去细胞，心脏以冠状动脉灌注，胰腺以胆管灌注，肺脏以肺动脉灌注。优选的灌注速度为1～500ml/min,所有步骤均连续进行，灌注速度的选择与具体的动物器官以及种类有关，以灌注速度不实质性地损伤支架为宜，例如猪胰腺的去细胞灌流速度为6ml/min。经去垢剂灌注后，器官会变透明。

目标对象为结缔组织，由于自身结构致密的特点，处理时间、去垢剂浓度较上述其他组织有所增加,具体步骤如下：置于-80℃～-20℃的低温冰箱1～2h，1～2h后在25℃～45℃的等渗溶液中解冻，该过程可以根据组织的致密程度适当重复，冲洗完全后在离子去垢剂中振荡处理4～48h，然后置于低渗溶液中震荡4～48h，在离子去垢剂II中再振荡处理4～48h，然后放入低渗溶液中震荡4～48h，核酸酶去除剂处理60min～120min，无菌等渗PBS冲洗6～24h，即可制备得到上述组织去细胞支架。在无菌条件下取出目标组织后，试剂处理的优选振荡速度为100～300rpm/min，试剂处理均连续进行，振荡速度的选择与具体的动物有关，以振荡速度不实质性地损伤组织完整性为宜。例如兔的软骨制备的振荡速度为150rpm/min,振荡时可以采取相似的速度。

对于需要灌注法去细胞器官，离体前对器官灌注疏栓液；

本发明提供的试剂盒及使用该试剂盒的方法能够在短时间内能够获取多器官和组织的去细胞支架，同时保留细胞外基质的结构和大部分结构，从而再生医学和组织工程的研究和运用提供产品材料。更为重要的是本发明可有效便捷的获取各个靶向器官和组织细胞外优质基质蛋白和各类细胞因子，为相关疾病治疗、美容整形以及健康保健方面等提供原料获取方法。其中的非离子去垢剂（Triton X-100）能够破坏脂质与脂质及脂质和蛋白质的相互作用，有效地破坏细胞膜；离子去垢剂（SDS，DOC）能够有效地破坏蛋白与蛋白之间的相互作用。冻融过程可以通过形成细胞内冰晶破坏细胞膜从而有效地使细胞溶解，而低渗（高渗）溶液可以使细胞皱缩破坏细胞膜进而溶解细胞，再结合能够专一性地水解有抗原性的核酸的核酸酶，最终可以获得良好的去细胞支架。（上面有提到的几类去细胞试剂都要讲）。

附图说明

图1为本发明中实施例1猪心脏去细胞支架的结构图；

图2为本发明中实施例1猪心脏去细胞支架的HE图片；

图3为本发明中实施例1猪心脏去细胞支架的SEM（扫描电镜）；

图4为本发明中实施例1猪心脏去细胞支架的DNA含量前后比较柱状图；

图5为本发明中实施例1猪肝脏去细胞支架的结构图；

图6为本发明中实施例1猪肝脏去细胞支架的HE图片；

图7为本发明中实施例1猪肝脏去细胞支架的SEM（扫描电镜）；

图8为本发明中实施例1猪肝脏去细胞支架的DNA含量前后比较柱状图；

图9为本发明中实施例1猪脊髓去细胞支架的结构图；

图10为本发明中实施例1猪脊髓去细胞支架的HE图片；

图11为本发明中实施例1猪脊髓去细胞支架的SEM（扫描电镜）；

图12为本发明中实施例1猪脊髓去细胞支架的DNA含量前后比较柱状图；

图13为本发明中实施例1牛关节软骨去细胞支架的结构图；

图14为本发明中实施例1牛关节软骨去细胞支架的HE图片；

图15为本发明中实施例1牛关节软骨去细胞支架的SEM（扫描电镜）；

图16为本发明中实施例1牛关节软骨去细胞支架的DNA含量前后比较柱状图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此，本发明可运用任何不同物种来源的具有细胞成分的组织和器官结构。

如图1、图2、图3、图4所示，猪心脏去细胞实施例1. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为0.1%的非离子去垢剂、低渗溶液、等渗溶液、组织疏松剂和核酸去除剂。

离体将心脏经升主动脉用疏栓液冲出残留血液，置于-80℃的低温冰箱12～4h，12h后在25℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液冲洗3次，每次持续20分钟，用低渗溶液中灌注组织疏松剂15min，非离子去垢剂中灌注组织疏松剂6h，核酸酶去除剂处理30min，等渗溶液冲洗2h，灌注速度为1ml/min,所有步骤均连续进行；制备得到的猪心脏细胞细胞支架，心脏脱细胞支架外观透明包膜完整保留了心脏的形态肉眼可见心脏内脉管系统，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

猪心脏去细胞实施例2. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为3%的非离子去垢剂、低渗溶液、等渗溶液、组织疏松剂和核酸去除剂。

离体将心脏经升主动脉用疏栓液冲出残留血液，置于-40℃的低温冰箱30h，30h后在30℃的等渗无菌PBS缓冲溶液中解冻，用生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，在低渗溶液中灌注组织疏松剂40min，非离子去垢剂中灌注组织疏松剂15h，核酸酶去除剂处理45min，等渗溶液冲洗15h，灌注速度为200ml/min,所有步骤均连续进行；制备得到的猪心脏细胞细胞支架，心脏脱细胞支架外观透明包膜完整保留了心脏的形态肉眼可见心脏内脉管系统，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

猪心脏去细胞实施例3. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为10%的非离子去垢剂、低渗溶液、等渗溶液、组织疏松剂和核酸去除剂。

离体将心脏经升主动脉用疏栓液冲出残留血液，置于-20℃的低温冰箱48h12～48h后在45℃的等渗无菌PBS缓冲溶液中解冻，用等渗溶液或生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，用低渗溶液中灌注组织疏松剂60min，非离子去垢剂中灌注组织疏松剂24h，核酸酶去除剂处理60min，等渗溶液冲洗24h，灌注速度为500ml/min,所有步骤均连续进行；制备得到的猪心脏细胞细胞支架，心脏脱细胞支架外观透明包膜完整保留了心脏的形态肉眼可见心脏内脉管系统，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

如图5、图6、图7、图8所示，猪肝脏去细胞实施例1. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为0.1%的非离子去垢剂、低渗溶液、等渗溶液、组织疏松剂和核酸去除剂。

置于-80℃的低温冰箱12，12h后在25的等渗溶液中解冻，用等渗溶液冲洗3次，每次持续20分钟，在低渗溶液中灌注组织疏松剂15min，非离子去垢剂中灌注处理6h，然后在低渗溶液中灌注组织疏松剂15min，核酸去除剂处理30min，等渗溶液冲洗2h，即可制备得到上述器官的去细胞支架，灌注速度为1ml/min,所有步骤均连续进行，制备得到的猪肝脏细胞细胞支架，整体颜色透明，肉眼血管清晰可见，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

猪肝脏去细胞实施例2. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为5%的非离子去垢剂、低渗溶液、等渗溶液、组织疏松剂和核酸去除剂。

置于-40℃的低温冰箱20h，20h后在30℃的等渗溶液中解冻，用生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，在低渗溶液中灌注组织疏松剂30min，非离子去垢剂中灌注处理15h，然后在低渗溶液中灌注组织疏松剂140min，核酸去除剂处理45min，等渗溶液冲洗15h，即可制备得到上述器官的去细胞支架，优选灌注速度为200/min,所有步骤均连续进行，制备得到的猪肝脏细胞细胞支架，整体颜色透明，肉眼血管清晰可见，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

猪肝脏去细胞实施例3. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为10%的非离子去垢剂、低渗溶液、等渗溶液、组织疏松剂和核酸去除剂。

置于-20℃的低温冰箱48h， 48h后在45℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液冲洗3次，每次持续20分钟，在低渗溶液中灌注组织疏松剂60min，非离子去垢剂中灌注处理24h，然后在低渗溶液中灌注组织疏松剂60min，核酸去除剂处理60min，等渗溶液冲洗24h，即可制备得到上述器官的去细胞支架，灌注速度为500ml/min,所有步骤均连续进行，制备得到的猪肝脏细胞细胞支架，整体颜色透明，肉眼血管清晰可见，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

如图9、图10、图11、图12所示，猪脊髓去细胞实施例1. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为0.1%的离子去垢剂I、高渗溶液、等渗溶液和核酸去除剂。

置于-80℃的低温冰箱1h，1h后在25℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液冲洗3次，每次持续20分钟，离子去垢剂I中振荡处理4h，然后置于高渗溶液中震荡4h，核酸去除剂处理30min，等渗溶液冲洗2h，即可制备得到神经组织类去细胞支架。试剂处理的优选振荡速度为100rpm/min，试剂处理均连续进行，制备得到的猪脊髓细胞细胞支架，整体颜色较原来组织透明，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

猪脊髓去细胞实施例2. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为6%的离子去垢剂I、高渗溶液、等渗溶液和核酸去除剂。

置于-40℃的低温冰箱1.5h，1.5h后在30℃的等渗溶液中解冻，用生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，离子去垢剂I中振荡处理6h，然后置于高渗溶液中震荡6h，核酸去除剂处理40min，等渗溶液冲洗15h，即可制备得到神经组织类去细胞支架。试剂处理的优选振荡速度为200rpm/min，试剂处理均连续进行，制备得到的猪脊髓细胞细胞支架，整体颜色较原来组织透明，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

 猪脊髓去细胞实施例3. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为10%的离子去垢剂I、高渗溶液、等渗溶液和核酸去除剂。

置于-20℃的低温冰箱2h， 2h后在45℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液冲洗3次，每次持续20分钟，离子去垢剂I中振荡处理8h，然后置于高渗溶液中震荡8h，核酸去除剂处理60min，等渗溶液冲洗24h，即可制备得到神经组织类去细胞支架。试剂处理的优选振荡速度为300rpm/min，试剂处理均连续进行，制备得到的猪脊髓细胞细胞支架，整体颜色较原来组织透明，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

如图13、图14、图15、图16所示，牛关节软骨去细胞实施例1. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为0.1%的非离子去垢剂、溶质与溶剂体积比为0.1%的离子去垢剂II、低渗溶液、等渗溶液和核酸去除剂。

置于-80℃的低温冰箱1h，1h后在25℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液冲洗3次，每次持续20分钟，在非离子去垢剂中振荡处理4h，然后置于低渗溶液中震荡4h，在离子去垢剂II中再振荡处理4h，然后放入低渗溶液中震荡4h，核酸酶去除剂处理60minmin，无菌溶液冲洗6h，即可制备得到上述组织去细胞支架。振荡速度为100rpm/min，制备得到的牛关节软骨去细胞支架，整体颜色较原来组织透明，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

牛关节软骨去细胞实施例2. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为3%的非离子去垢剂、溶质与溶剂体积比为0.1%的离子去垢剂II、低渗溶液、等渗溶液和核酸去除剂。

置于-60℃的低温冰箱1.5h，1.5h后在30℃的等渗溶液中解冻，用生理盐水冲洗3次，每次持续20分钟，在非离子去垢剂中振荡处理25h，然后置于低渗溶液中震荡30h，在离子去垢剂II中再振荡处理20h，然后放入低渗溶液中震荡20h，核酸酶去除剂处理90min，无菌等渗PBS冲洗15h，即可制备得到上述组织去细胞支架，振荡速度为200rpm/min，试剂处理均连续进行，制备得到的牛关节软骨去细胞支架，整体颜色较原来组织透明，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。

牛关节软骨去细胞实施例3. 

取用于获取多器官和组织细胞外基质的试剂盒中溶质与溶剂体积比为10%的非离子去垢剂、溶质与溶剂体积比为0.1%的离子去垢剂II、低渗溶液、等渗溶液和核酸去除剂。

置于-20℃的低温冰箱2h， 2h后在45℃的等渗溶液中解冻，用等渗溶液冲洗3次，每次持续20分钟，在非离子去垢剂中振荡处理48h，然后置于低渗溶液中震荡48h，在离子去垢剂II中再振荡处理48h，然后放入低渗溶液中震荡48h，核酸酶去除剂处理120min，无菌等渗PBS冲洗24h，即可制备得到上述组织去细胞支架。振荡速度为300rpm/min，试剂处理均连续进行，制备得到的牛关节软骨去细胞支架，整体颜色较原来组织透明，HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留，扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留，在DNA定量检测中几乎不含有DNA成分。