一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法

摘要

本发明属于动物生物医药工程领域，具体公开了一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法。本发明制备出的亚单位疫苗直接作为口服疫苗免疫小鼠，能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答。该疫苗在胃肠部不易降解，免疫效果显著，制备工艺简单，对减轻猪流行性腹泻病毒对养猪业的危害起到积极的作用，对促进养猪业健康发展具有重要的实践意义。

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物医药工程领域，更具体地，涉及一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是一种单股、正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronviridae)，冠状病毒属(Coronavims)。感染PEDV是猪病毒性腹泻的主要原因之一，主要的特征为严重的肠炎、呕吐、水样腹泻和体重减轻等，仔猪死亡率的居高不下使得PEDV感染成为中国养猪业损失的一大因素。

PEDV在被发现后直至今日，不但没有被有效控制，反而成了影响全世界养猪业的重大病毒，造成巨大的经济损失。PED在亚洲的爆发引起极高的死亡率，有研究显示日本1993～1994年爆发PED时，5个猪场仔猪死亡数就超过一万，死亡率在30%～60%；据报道从2010年2月到2011年11月，我国爆发PED引起的仔猪死亡数在五万以上，死亡率高达90%～100%。2013年，美国也首次报道了PEDV的存在，2014年持续爆发与流行。

目前对于PED的预防主要是接种疫苗，虽然国内PEDV的灭活苗及弱毒活疫苗得到了广泛的推广和应用，在一定程度上减少了PED的发病率，但仍无法完全控制。原因在于PEDV主要通过肠道感染猪，具有很明显的肠道组织噬性。粘膜sIgA抗体对经消化道、呼吸道、生殖入侵的粘膜感染病毒具有中和作用。因此开发产生粘膜sIgA抗体的疫苗对预防PEDV有重要的作用。

针对此特点，国内开发的刺激肠道粘膜，产生粘膜抗体的主要疫苗为弱毒苗、基因重组的活菌疫苗以及亚单位疫苗。弱毒苗存在弱毒反强的风险，有可能造成二次危害，重组菌活疫苗的难点在于不易把控活菌的数量，容易失活，而亚单位疫苗口服时，在通过胃肠道的时候，容易受到酶水解而失去效力。

发明内容

针对现有技术中猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗无法口服，且在胃肠道中容易降解的缺陷，本发明的目的在于提供一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗制备方法。

本发明是通过以下技术方案予以实现的。

    一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将脱乙酰度为80~85%的壳聚糖溶于0.5~0.6%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； 

S2. 取4 ml步骤S1制备的壳聚糖溶液，边搅拌边逐滴加入1 ml浓度为50~100μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，蛋白加完后再搅拌15~20 min；

S3. 将1~2 ml浓度为0.2%（W/V）的三聚磷酸钠，加入到S2溶液中，继续搅拌5 ~10min即得疫苗。

    优选地，S1所述壳聚糖的脱乙酰度为85%。

    优选地，S1所述壳聚糖溶液配置时将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶解于0.5%（v / v）乙酸中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果

本发明制得的猪流性腹泻病毒亚单位疫苗可以口服，并且在胃肠部不易降解，能够刺激机体产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，免疫效果显著，制备工艺简单，制备条件温和，只需要进行常规的搅拌和常温条件即可制备，制备成本低廉，有利于大规模推广。

另外，现有技术报道利用0.3~1%（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，包封蛋白或核酸的包封率都在80%左右，但是，本发明发现，对于猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，必须用脱乙酰度为80~85%，浓度为0.5~0.6（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，才能达到良好的包封率。分析原因可能与猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白的空间结构和蛋白大小有关。

附图说明

图1为实施例5受刺激脾细胞培养上清GM-CSF浓度

图2为实施例5受刺激脾细胞培养上清IFNγ浓度

图3为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL2浓度

图4为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL4浓度

图5为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL5浓度

图6为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL6浓度

图7为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL10浓度

图8为实施例5受刺激脾细胞培养上清TNFα浓度。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

实施例1 

    壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：

S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶于0.5%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； 

S2.取4 ml步骤S1制备的壳聚糖溶液，边搅拌边逐滴加入1 ml浓度为60μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，蛋白加完后再搅拌15 min；

S3. 将2 ml浓度为0.2%（W/V）的三聚磷酸钠，加入到S2溶液中，继续搅拌5min即得疫苗。

其中，60μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白是用0.9%的生理盐水稀释500 μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白原液获得的，而猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白原液是华南农业大学动物科学学院家禽研究室按照常规的真核表达的方法获得的。

实施例2

    壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：

S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为80%的壳聚糖溶于0.6%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； 

    其他步骤同实施例1。

实施例3

    壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：

S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶于0.3%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； 

    其他步骤同实施例1。

实施例4

    壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：

S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶于1%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； 

其他步骤同实施例1。

利用BCA法测定实施例1~4制备得到的壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的包封率，BCA方法的步骤参考本技术领域常规的方法即可，测定结果：实施例1~4所述疫苗的包封率分别为（86.31±2.05）%、（84.56±3.23）%、（70.12±1.96）%、（69.62±3.17）%。由实施例1、3、4的结果可知，醋酸溶液的浓度置显著影响了包封率。现有技术中报道，利用0.3~1%（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，包封蛋白或核酸的包封率都在80%左右，但是，本发明发现，对于猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，必须用脱乙酰度为80~85%，浓度为0.5~0.6（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，才能达到良好的包封率。分析原因可能与猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白的空间结构和蛋白大小有关。

实施例5

将实施例1制备的壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗用来免疫Balb/c雌性小白鼠，设3个试验组。分别为：1、NS组（生理盐水组）；2、COE组（未包被的PEDV亚单位疫苗组）；3、COE-CS组（壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗）。每组30只，采用8号灌胃针进行灌胃免疫，于第1 d进行首次免疫，第14 d进行加强免疫，每次连续免疫2 d。试验期为56 d，每周采血样，每次每组采血样3只小鼠，收集血清用ELISA检测抗COE蛋白抗体产生情况。并于第35d脱臼处死小鼠，提取小鼠的脾脏细胞进行体外培养，采用COE蛋白刺激后，检测细胞培养上清中细胞因子的分泌浓度。

血液样品的采集为，分别于首次免疫后第7 、14 、21 、28 、35 、42 、49 、56 d收集外周血血清。具体操作如下：固定小鼠，眼眶取血置于1.5 mL的离心管中静置。所有样品采集结束后将血液置于37℃恒温箱静置1 h，再于4℃，5 000 rpm离心15 min，取血清后再按前一步条件再次离心，然后分装血清后保存于-80℃，用于ELISA检测抗体水平。

脾细胞刺激后培养上清的采集

于首次免疫后第35 d获取小鼠的脾脏细胞。将小鼠眼眶采血处死后，置于酒精浸泡，在超净台中无菌解剖，取每组3只小鼠脾脏合并放入细胞筛中，再置于含有适量RPMI-1640培养基（含双抗，下同）的6孔细胞培养板内，用针头将脾脏戳开后，使用注射器内塞缓慢研磨脾脏，至没有块状组织。弃掉细胞筛，将孔内的细胞悬液转移至15 mL离心管。用2 mL RPMI-1640培养基清洗6孔板，一并转移至15 mL离心管内，补足至10 mL，20℃，200 g离心10 min，弃上清，用3 mL的RPMI-1640培养基重悬，再加入9 mL的ACK红细胞裂解液，室温放置5 min，期间轻轻颠倒混匀。按前一步条件离心，弃掉离心上清，用10 mL RPMI-1640培养基重悬细胞洗涤2次，每次22℃，200 g离心10 min，最后用3 mL RPMI-1640完全培养基（含10 % FBS）重悬细胞。用过滤网再过滤一次至6孔板，转移至新的15 mL离心管，用2 mL完全培养基清洗6孔板一次，一并转到15 mL离心管，用RPMI-1640完全培养基补至5 mL。使用台盼蓝计数。最后用RPMI-1640完全培养基稀释脾细胞至5×10⁶个细胞/mL。

取96孔板，每组设置3个样品孔，每孔加入200 μL浓度为5×10⁶个细胞/mL的脾细胞悬液，加入4.8 μL纯化的COE蛋白进行刺激（终浓度为5 μg/mL），以加入等量培养基的孔作为对照。在96孔板周围加入无菌PBS防止孔内细胞液蒸发。刺激80 h后，吸取细胞液，在4℃，8 000 rpm离心10 min。取上清保存于-80℃用于细胞因子的测定。

体液免疫效果分析

通过酶联免疫吸附实验（ELISA）测定实施例1制备的壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗在动物体内所诱导的抗体水平。具体方式如下：

1.用包被缓冲液将COE蛋白(222 μg/mL)按1:500的比例稀释，按100 μL每孔加入酶标板中，置于4℃过夜。

2.取出包被过夜的酶标板，弃包被液，用每孔用250 μL的洗涤液洗板3次，每次浸泡1 min，然后加入100 μL/孔的封闭液，37℃反应2h。

3.取出洗板（同2），将血清用血清稀释液按1:20稀释后，按100 μL/孔加入酶标板，37℃反应60 min。

4.取出洗板（同2），按100 μL每孔加入1:1 000的酶标二抗，37℃反应60 min。

5.取出洗板（同2），按100μL每孔加入底物缓冲液，室温反应5～15 min，按100 μL每孔加入终止液，混匀，在酶标仪上测OD450 吸光值。

试验结果如表1所示：从表中可以看出，从第14d开始，即有明显的抗COE蛋白的抗体产生，其中第14d，21d，42d和49d，壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗产生的特异性抗体水平高于裸PEDV亚单位疫苗组。说明壳聚糖的包被效果是显著有效的。

表1  ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平（OD450）

注释：1、数据表示方式为平均值±标准误；

    2、数据按照纵向进行比较，数据末尾未标注字母或者标注有相同字母表示差异不显著（P＞0.05,），标注不同字母说明两两之间差异显著（P＜0.05）。

细胞因子产生效果分析

采用特异性抗原COE蛋白刺激体外培养的小鼠脾细胞，并采用Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel检测刺激上清中的细胞因子的分泌水平，可以反应小鼠的免疫细胞在受到抗原刺激时分泌的细胞因子的水皮。具体实施方法如下：

相关试剂的配制：   

1)    抗体标记微球的制备

本次试验采用的是单独分装的微球瓶，首先在超声波仪上处理30 s，振荡器振荡1分钟。从每个抗体微球瓶中各吸取90 μL的液体加入混合瓶，然后加Assay Buffer至终体积为3 mL，振荡混合，未用部分可在2~8℃保存至多1月。

2)    质量控制组的制备

在试验前，分别使用250 μL的去离子水溶解质量控制组1和质量控制组2。多次翻转瓶子以充分混合，静置5~10 min，将控制组转移至有适当标记的EP管中，未使用部分在-20℃条件下至多保存1月。

3)    清洗缓冲液(Wash     Buffer)的制备

取l0×Wash Buffer在恢复室温后摇匀，使所有盐类溶解，用540 mL去离子水稀释60 mL 10×Wash Buffer，未用部分可在2~8℃保存至多1月。

4)    细胞因子标准品的制备

使用前，用250 μL去离子水溶解细胞因子标准品，此时标准品浓度达到10 000 pg/mL，多次翻转瓶子以充分混合，振荡器振荡10 s，静置5-l0 min，将标准品转移至有适当标记的EP管中。此管为10 000 pg/mL标准品管，未使用部分在-20℃条件下至多保存1月。分别标记5个EP管 2 000，400，80，16和 3.2 pg/mL，每管中分别加入200 μL Assay Buffer。连续稀释，从10 000 pg/mL的原始标准品管中吸取50 μL加入2 000 pg/mL管中，充分混合，从2 000 pg/mL管中吸取50 μL加入至400 pg/mL管中，充分混合，从400 pg/mL管中中吸取50 μL加入80 pg/mL管中，充分混合，从80 pg/mL管中吸取50 μL加入至3.2 pg/mL管中，充分混合。0 pg/mL标准品(背景)用Assay Buffer。

检测步骤参照说明书进行，主要步骤如下：

1）将所有试剂恢复至室温（20-25℃）。

2）取96孔板，每孔加入200μL Wash Buffer进行预湿，密封后使用96孔摇床在室温震荡10 min。

3）倒转板子，轻轻倒掉Wash Buffer后，使用吸水纸吸走残留的液体。

4）将标准品或者质量控制品加入到适当的孔中，Assay Buffer作为0 pg/mL 的标准品(同时作为背景孔)。

5）加25 μL的Assay Buffer到样品孔中。

6）加25 μL的适当基质液到背景孔、标准品孔或者质量控制孔中，当检测的样品是血清时，使用试剂盒提供的Serum Matrix作为基质液，当检测的样品是细胞培养上清的时候，使用的是细胞培养基作为基质液。

7）加25 μL的样品到样品孔中（血清需要使用Assay Buffer做1:1的稀释）。

8）晃动磁珠混合瓶子，并加25 μL的磁珠进入到每个孔中（在加样过程中要不间断地振摇瓶子以免发生沉降）。

9）先使用板膜封好板后，再使用铝箔将板子包裹。置于96孔摇床上，于2-8℃振摇过夜（16-18 h）。

10）去除铝箔和封口膜后，置于磁力架上静置60 s，轻轻倒掉板中的液体，并在吸水纸上轻轻吸掉残留的液体。随后取下96孔板，加入200 μL的Wash Buffer，置于96孔板摇床上摇60 s，重复洗涤的操作。总共洗板2次。

11）每孔中加入25 μL二抗(注意：二抗在加入前应复温至室温)。

12）使用封口膜封口，铝箔避光，在室温下(20-25℃)摇床上孵育1 h。

13）在含二抗的孔中加入25 μL的Streptavidin-Phycoerythrin(链霉素藻红蛋白)。

14）使用封口膜封口，铝箔避光，在室温下(20-25℃)摇床上孵育1 h。

15）重复第（10）歩洗板过程。

16）所有孔中加入150 μL鞘液，摇床上震荡5 min使微球呈悬浮状态。

17）将板子置入Luminex? 200内进行检测。用MILLIPLEX? Analyst 5.1软件进行数据分析。

试验结果如图1~8所示，可以看出，COE-CS组GM-CSF、IFNγ、IL2、IL4、IL5、IL6、IL10、TNFα这8种细胞因子分泌水平均极显著高于NS组和COE组（P＜0.01），说明壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗可以诱导产生较强的细胞免疫反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方法，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。