猪流行性腹泻病毒S基因变异分析及嗜酸乳杆菌口服疫苗的研究

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种有囊膜的单链RNA病毒，属冠状病毒科冠状病毒亚科α冠状病毒属成员。
　　在中国，PED已在多个猪的主产省报道，7日龄内哺乳仔猪病死率高达90-100％，通常出生后2-3天开始发病。尽管有疫苗可用，但作为中国生猪生产大省，山东省因为这些新PED的暴发仍遭受了严重的经济损失。自2012以来，山东省许多猪场PED暴发明显增加，这给养猪业带来了沉重打击。为了解山东省规模化猪场PEDV的流行情况和变异规律，探究针对当前流行的主要基因型PEDV的新型有效口服疫苗，本研究进行了以下几个方面的工作：
　　2012年1月至2015年7月，我们首先在山东省开展PEDV分子流行病学研究，一共采集了205份PEDV可疑病料，RT-PCR检出146份阳性，检出率为71.2%。利用RT-PCR扩增和DNAstar软件拼接，得到来自13个不同地市的38株PEDV完整的S基因序列，序列长度在4149-4161bp之间，氨基酸序列在1381-1386aa之间，彼此核苷酸同源性为95.0%-99.9%，氨基酸同源性为94.3%-99.8%，这38株病毒根据S基因长度不同分属于进化树G2和G3分支。进化树是用从NCBI数据库选取41株具有代表性的参考毒株与本研究获得的38株 PEDV的S基因序列做遗传进化分析所得，它分为三支：G1、G2和G3。G1主要是传统毒株和疫苗株，G2包含7株本研究获得的来自山东省4株不同地市流行株。G3包含56株当前流行株，其中31株来自于本研究，剩余25个分别为17株中国流行株、3株韩国流行毒株和5株美国流行毒株。G3中野毒株的S基因序列长度大都为4161bp，但是其中的Gd分支属于例外，S序列长度都为4158bp。本研究2014年获得的2株临沂地区的流行毒株（CH-SDLY-2-2014和CH-SDLY-3-2014）位于Gd分支，是华北地区首次发现。G3中的31株流行株占据省内12个不同地市，是当前山东省PEDV流行株的主要基因型。根据遗传进化分析结果摘选代表序列做抗原位点的氨基酸同源性比对发现，PEDV的S蛋白变异区主要集中在COE位点，且变异位点较多，这可能是最近几年猪流行性腹泻频繁暴发的主要原因之一。通过遗传分析我们得出结论山东省2012-2015年同时存在2个基因型G2和G3（包含Gd）的PEDV。
　　利用32对引物扩增出CH-SDLY-2014株的全基因组序列28035nt，没有poly(A)，基因组为典型的冠状病毒科结构。CH-SDLY-2014株与选取的国内外PEDV代表毒株进行核苷酸同源性比对显示，全基因组序列同源性在96.6-99.0%之间，S基因的序列同源性是93.5-98.5%。遗传进化分析结果可知全基因组的进化树分为3个组：G1、G2和G3，其中G3包含2个分支3a与3b。CH-SDLY-2014株与6株华南PEDV流行株同源性较高，聚类在3a分支中。S基因遗传进化分析得到的进化树拓扑结构与全基因组的结构相似，CH-SDLY-2014株也聚类在3a中。值得关注的是，3b分支中各流行株的S基因全长都为4161 nt，而3a中的S基因展示了4158 nt长的序列，是我国北方地区第一次分离得到。3a分支中包含14株2011年后分离到的野毒株，其中CH-SDLY-2014株刚从中国北方分离到，12株来自中国南方，还有1株源于南亚。这些3a中的S基因序列有特异性，在其3’碳端与传统CV777株S基因对应的3580-3582 nt位置，存在3个核苷酸的缺失。这一特性或许可以作为3a分支区别其他PEDV流行株基因型的鉴别依据。
　　S蛋白位于PEDV病毒粒子的表面，除了在介导免疫方面的作用外，还具有促进融合病毒与细胞膜、识别靶细胞等其它生物学作用，成为研制防疫PEDV新型有效疫苗的主要的目的蛋白。本研究选取编码主要抗原位点基因，用pET-30a构建重组质粒，转化E.coli BL21进行体外诱导表达。通过对表达时间，诱导剂用量和温度等条件的优化，SPEDV蛋白获得成功表达（最佳的表达方案：重组菌用1 mM的IPTG诱导，在37℃条件下培养4小时）。利用纯化的目的蛋白作为包被抗原，经过一系列条件的优化，我们初步建立了检测SPEDV蛋白抗体的间接ELISA方法。
　　乳酸杆菌作为基因工程疫苗研究的受体菌可以将乳酸杆菌自身的生物学功能与外源基因的特异性免疫功能相结合，从而增强动物机体非特异性免疫和特异性免疫。本研究中，我们将构建的pRc/CMV2-S1-Rep.8014和pRc/CMV2-S2-Rep.8014重组质粒电转到L. acidophilus1C1中，研制了表达PEDV S1（2）蛋白的重组乳酸杆菌疫苗。通过多组动物实验的口服免疫，检测体液和细胞免疫指标，探究该疫苗的免疫效果。
　　BALB/c小鼠分别免疫重组L.acidophilus1C1: pRc/CMV2-S1（2）-Rep.8014、pRc/CMV2-S1-Rep.8014和pRc/CMV2-S2-Rep.8014口服疫苗，并设置PBS、pRc/CMV2和商品疫苗免疫对照组。收集血清、小肠和粪便样品，分离血清用于检测特异性IgG抗体，而小肠和粪便标本用于检测SIgA抗体。试验结果表明，口服疫苗组IgG抗体水平均低于商品疫苗组（p<0.05），但是口服疫苗组 SIgA抗体水平明显高于商品疫苗组（p<0.01）。免疫pRc/CMV2-S1（2）-Rep.8014口服疫苗的小鼠脾细胞CD4+和CD8+T细胞百分比显著高于与其他组（p<0.05）。ELISA法检测免疫小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ
　　和Th2型细胞因子IL-4，结果表明口服疫苗具有一定的免疫效果，不仅提高了小鼠的细胞免疫应答，而且增强了小鼠的体液免疫应答。
　　随着分子生物学的发展，NGS技术在各环境内菌群结构和功能的研究领域中产生了翻天覆地的影响。Rarefaction curve反映样本中数据量已经足够，且S1和S2组早期和晚期的样品多样性指数低于中期。微生物菌群组成S1和S2组成相似，C的组成与其他两组最不相似。群落结构组成分析发现免疫后的小鼠肠道内厚壁菌门是丰度较高的8个门之一，厚壁菌门的乳杆菌属位于丰度较高的5个属之一。实验组S1和S2小鼠肠道内重组乳酸杆菌的比例随时间的推移出现下降趋势，因此建议补充第三次重组乳酸杆菌口服疫苗的免疫，或许对抗体水平的维持或提高有所改进。

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前言

1.1 PEDV的分子结构和遗传特性

1.2 PEDV的流行病学

1.3临床症状、病理变化和致病机理

1.4 PEDV感染仔猪免疫反应及其保护作用

1.5 PED的检测技术

1.6 PED的预防与控制

1.7 乳酸杆菌载体口服疫苗

1.8 测序技术在肠道微生物菌群中的应用

1.9 本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1山东省2012至2015 PEDV分子流行病学调查

2.2 CH-SDLY-2014株全基因序列测定

2.3 PEDV的SPEDV基因原核表达及间接ELISA方法的建立

2.4 PEDV乳酸杆菌口服疫苗的研究

2.5 免疫后小鼠肠道微生物多样性基础分析

3结果与分析

3.1 猪流行性腹泻病毒S基因分子流行病学调查

3.2 PEDV全基因组序列测定

3.3 PEDV的SPEDV蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

3.4乳酸杆菌口服疫苗研究

3.5免疫后小鼠肠道微生物多样性基础分析

4讨 论

4.1山东省2012年至2015年PEDV S基因分子流行病学调查

4.2 CH-SDLY-2014全基因组序列测定

4.3 PEDV SPEDV基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

4.4 PEDV嗜酸乳杆菌口服疫苗研究

4.5免疫后小鼠肠道微生物多样性基础分析

结论

参考文献

致谢

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