蜚蠊提取物及用提取物制成治疗肝纤维化的药物或保健品

摘要

本发明涉及一种蜚蠊提取物及其在治疗肝纤维化的药物或保健品中的应用，该提取物主要含有蜚蠊生物活性肽、糖肽、氨基酸和多元醇类化合物，对HSC细胞株有较强的抑制作用，其IC50值为49.0μg/ml。该提取物能减轻炎性细胞对肝组织的浸润和明显减少CCl4诱导肝纤维化小鼠胶原蛋白的沉积，对肝纤维化有明显的治疗作用，可用于制备治疗肝纤维化的药物或保健品。当前对于蜚蠊提取物多用于口腔护理及心血管疾病方面的应用，在肝纤维化方面的应用使蜚蠊的药用价值得到进一步的提升。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种蜚蠊提取物和用提取物制成治疗 肝纤维化的药物、组合药物或保健品。

背景技术

蜚蠊(Blattodea)属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂。它在地球上已经生存了4亿 年，是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。蜚蠊一直被人类视为 害虫，但它面对人类的各种杀灭手段却能顽强繁衍至今，其体内无疑具有最优秀的生物活性 物质和特殊生理机制。

近年来，随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，科学工作者对这一资源丰富的昆 虫进行了应用方面的研究开发，取得了可喜的成就，并以蜚蠊药材为原料，先后研发的新药 有：“康复新液”、“肝隆胶囊”、“心脉隆注射液”，其中“肝隆胶囊”和“心脉隆注 射液”为国家级二类新药(中药)。“康复新液”用于治疗口腔溃疡、十二指肠溃疡、烧伤、 烫伤、褥疮、肺结核辅助治疗等，为国家中药保护品种、国家医保乙类药物；“肝隆胶囊” 用于治疗慢性乙型肝炎，肝硬化及乙肝病毒携带等肝脏疾病；“心脉隆注射液”主治慢性充 血性心力衰竭，慢性肺原性心脏病，对继发性肺心病、心肌病的心衰治疗效果特别明显。

为了明确蜚蠊药材中具有抗肝纤维化作用的活性部位，进一步弄清其中起主要作用的物 质基础，并从分子药理学基础上阐明蜚蠊抗肝纤维化的作用机制，发明人对其展开了详细的 药学工艺研究。

发明内容

本发明提供一种蜚蠊活性提取物和用提取物制成治疗肝纤维化的药物、组合药物或保健 品。

本发明提供的一种蜚蠊提取物，其提取物中，多肽的含量在400～500mg/g之间，粘多 糖的含量在100～150mg/g之间，多元醇的含量在70～90mg/g之间，游离氨基酸的含量在 200～250mg/g之间。

进一步的，蜚蠊提取物由包括下列步骤的提取方法提取获得：

原料处理：将蜚蠊养殖时间在5个月以上的成虫杀死干燥后粉碎；

提取：将所得粉末置于提取罐中，加入醇溶剂进行提取制得滤液；

浓缩：将所得滤液减压浓缩至浸膏无醇味，即得蜚蠊提取物；

脱脂：在油水分离装置中加入所得浸膏和热水，进行搅拌，静置后放出水层，收集滤液 并过滤，即得蜚蠊脱脂提取物；

吸附、洗脱：将蜚蠊脱脂提取物经过大孔吸附树脂柱吸附，再用水及不同浓度的醇洗 脱，收集洗60～95％的洗脱液；

制成品：将所得洗脱液过滤、减压浓缩、干燥后粉碎，即得提取物的活性成分；

检测：分别测定提取物的活性成分中总肽、粘多糖、多元醇及游离氨基酸的含量。

进一步的，多肽的含量以小牛血蛋白计。

进一步的，一种治疗肝纤维化的药物或保健品，含有上述的蜚蠊提取物，且该药物或保 健品的药物剂型是注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。

本发明的有益效果在于：从蜚蠊体内提取出一种活性物质，并且该物质可应用在治疗肝 纤维化的疾病方面，对当代医学对肝纤维化的治疗方式提供一种新方法。

附图说明

图1为各组小鼠肝脏组织HE染色结果(×200)

图2为不同组别小鼠HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C和TGF-β1的情况

具体实施方式

下文将结合附图详细描述本发明的实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特 征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合和相互结合从而达到更 好的技术效果。

本发明提供的一种蜚蠊提取物，其提取物中，多肽(以小牛血清蛋白计)的含量在400～ 500mg/g之间，粘多糖的含量在100～150mg/g之间，多元醇的含量在70～90mg/g之间，游 离氨基酸的含量在200～250mg/g之间。

蜚蠊提取物由包括下列步骤的提取方法提取获得：

原料处理：将蜚蠊养殖时间在5个月以上的成虫杀死干燥后粉碎；

提取：将所得粉末置于提取罐中，加入醇溶剂进行提取制得滤液；

浓缩：将所得滤液减压浓缩至浸膏无醇味，即得蜚蠊提取物；

脱脂：在油水分离装置中加入所得浸膏和热水，进行搅拌，静置后放出水层，收集滤液 并过滤，即得蜚蠊脱脂提取物；

吸附、洗脱：将蜚蠊脱脂提取物经过大孔吸附树脂柱吸附，再用水及不同浓度的醇洗 脱，收集洗60～95％的洗脱液；

制成品：将所得洗脱液过滤、减压浓缩、干燥后粉碎，即得提取物的活性成分；

检测：分别测定提取物的活性成分中总肽、粘多糖、多元醇及游离氨基酸的含量。

一种治疗肝纤维化的药物或保健品，含有上述的蜚蠊提取物。且该药物或保健品，其药 物剂型是注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。

实施例1

不同树脂纯化的蜚蠊提取物在相同时间点对HSC增殖的影响。

表1 各提取物组分含量表

1、将蜚蠊不同树脂纯化物用不含10％灭活FBS的DMEM(含HEPES4.746g/L，青霉素 100U/L，链霉素100mg/L)溶解，配制成浓度为10mg/ml的溶液，用0.22μm的滤膜过滤，作 为样品储备液。取储备液适量加DMEM溶液稀释成浓度为1000μg/ml、250μg/ml、 62.5μg/ml、15.63μg/ml、3.91μg/ml、0.98μg/ml的样品溶液。

2、HSC细胞用含10％灭活FBS的DMEM培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养，取对数生 长期的HSC，用0.25％胰酶消化后，离心，弃上清液，用完全培养基调细胞浓度至1×105个 /ml，接种于96孔板，每孔100μL，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h后弃上清液，分别在 每个实验孔中加入不同树脂纯化的蜚蠊提取物，每个浓度设6个复孔，同时设置阳性对照 组、阴性对照组和溶剂对照组。将加好样品液的培养板放入37℃，5％CO2培养箱中分别培养 48h，取出培养板，弃上清，加入5mg/ml的MTT溶液20μL，继续培养4h，再分别加入DMSO 溶液150μL，待紫色结晶溶解后，在波长490nm处检测各孔的OD值。根据以下公式计算样 品对肝星状细胞的抑制率，再计算IC50。

表2 蜚蠊不同树脂提取物48h对HSC的影响

3、如表2所示，蜚蠊不同树脂纯化物对HSC细胞的增值均有明显的抑制作用，与阳性药 物秋水仙碱比较，作用相当，表明蜚蠊提取物经大孔吸附树脂富集纯化的提取部位对HSC细 胞有较强的细胞毒性，可用于抗肝纤维化新药。

实施例2

蜚蠊乙醇提取物经大孔吸附树脂AB-8纯化所得提取部位抗肝纤维化的体内活性

1、清洁级健康昆明种小鼠，雌雄各半，饲养观察一周后将105只小鼠随机分为7组，即 空白对照组、正常对照组、模型对照组、阳性药物组、蜚蠊提取物组(高、中、低剂量组)， 每组15只。除空白对照组和正常对照组以外，其余各组均被制成肝纤维化模型。

2、模型复制成功后，空白对照组、正常对照组及模型组按体质量0.2ml/10g灌胃0.9％ 生理盐水，阳性药物组给予剂量为0.2mg/kg秋水仙碱的混悬液，ML-D4高、中、低剂量组份 别给予500mg/kg、250mg/kg、125mg/kg的药物混悬液。每日灌胃一次，连续给药5周。

3、实验动物于给药第5周末禁食不禁水一晚，次日称重后，先摘除眼球取血，静置 2h，4000r/min离心15min，取血清保存于-20℃待测；取血完毕后立即处死动物，剖腹取肝 脏组织，生理盐水中洗至无血，滤纸吸干盐水，称定质量，并精确取每只小鼠同一部位肝脏 0.2g，剩余置10％甲醛溶液中固定，用于病理检查，按1:9(W/V)加入0.9％生理盐水制成10％ 肝组织匀浆，4000r/min离心15min，取上清液保存于-20℃待测。

4、肝组织HE染色镜下观察，见图1：空白对照组及正常对照组肝组织无纤维组织增生 和炎性细胞浸润，无变性、坏死，肝细胞大小均匀，肝小叶结构存在，中央静脉周围有放射 状排列整齐的肝细胞索，汇管区清晰可辩，见图1A图和图1B图；模型组可见汇管区周围纤 维化且纤维延伸明显；中央门静脉边缘胶原增生明显，有炎性细胞浸润；可见肝细胞坏死区 域，部分细胞核增大；小叶结构不完整，肝细胞索排列紊乱，见图1C图；ML-D4高剂量治疗 组胶原纤维增生及肝细胞坏死程度与模型组相当，门管区炎性细胞浸润更明显，见图1D 图；相比较而言，ML-D4中、低剂量组疗效较好，肝组织炎性细胞浸润、胶原纤维增生及肝 细胞变性、坏死明显减少，无假小叶的形成，见图E和图F；秋水仙碱组炎性细胞浸润较 少，肝细胞变性坏死及胶原纤维增生明显减轻，见图1G图。

肝组织HE胶原纤维染色镜下观察：重点观察被染成蓝色的胶原纤维分布情况，空白对 照组及正常对照组仅于血管周围可见少量蓝色纤维，短且细，未见胶原纤维增生，肝小叶结 构正常，见图1A图和图1B图；模型组于汇管区及中央门静脉周围可见大量蓝色着色，胶原 纤维明显增多，可互相连接成较粗大的纤维间隔，见图1C图；模型组和纯化物相比，纯化 物高、中、低剂量组蓝色着色程度明显减少，见图1D图、图1E图和图1F图；阳性药物秋水 仙碱组蓝色着色程度也明显减少，表明纯化物可改善肝纤维化，见图1G图，其作用与一线 用药秋水仙碱相当。

肝组织中与纤维化相关指标(HA、LN、TGF-β1、PC-Ⅲ和Ⅳ-C)检测(ELISA)：与模型 组比较，纯化物各剂量组和秋水仙碱组小鼠肝组织中的LN、HA、PC-Ⅲ、TGF-β1和Ⅳ-C水 平均下降(P<0.01)；与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织中LN、HA、PC-Ⅲ、TGF-β1和 Ⅳ-C水平均升高，有显著差异(P<0.01)，纯化物高剂量组小鼠肝组织中LN和PC-Ⅲ的水平 与正常对照组差异显著(P<0.01)，高、中剂量组小鼠肝组织中Ⅳ-C水平与正常对照组有差 异(P<0.05)；正常对照组与空白对照组之间无统计学差异(P>0.05)。结果见表3，图2。

表3 ML-D4对实验小鼠肝纤维化指标的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△ P<0.01。

5、通过体内实验结果表明：(1)与CCl4所致肝纤维化模型组比较，蜚蠊提取物纯化物 高、中、低剂量组均能明显降低AST及ALT水平(P<0.01)其中，纯化物中剂量组的作用较 明显，但各剂量组对ALB和TB水平的影响均无显著性差异(P>0.05)；(2)模型组小鼠肝脏 组织中HA、TGF-β1、PC-Ⅲ和Ⅳ-C的含量明显高于正常对照组，给予蜚蠊提取纯化物 (500，250，125mg/mL)治疗后，可明显抑制HA、TGF-β1、PC-Ⅲ和Ⅳ-C水平的表达，高、 中、低剂量组的抑制作用都与秋水仙碱组相当，这与肝组织活检(HE染色)结果相吻合。

本发明提供的一种蜚蠊成虫提取物在治疗肝纤维化的药物或保健品中的应用，该提取物 主要含有蜚蠊生物活性肽、糖肽、氨基酸和多元醇类化合物，对HSC细胞株有较强的抑制作 用，蜚蠊提取物对小鼠肝纤维化具有明显的治疗和保护作用，可用于开发抗肝纤维化新药或 保肝护肝保健品。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离 本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本 文的实施例作为本发明权利范围的限定。