人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂

摘要

本发明公开一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，不含有人血白蛋白或其它动物源蛋白、也不含有糖或糖醇，由可溶性盐、氨基酸及表面活性剂组成，不存在传播其他病毒或病原体的风险，适合人群范围广，包括糖尿病患者；使用本发明保护剂的人凝血因子VIII制品冻干后复溶快，复溶效果好，仍然保持高效价和高比活性，效价大于80%、比活性大于40IU/mg；此外，本发明人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂成本低廉，制备简单，保护效果明显，安全有效，具有很好的工业应用前景。

说明书

技术领域

 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂。

背景技术

血友病是一种遗传性出血性疾病，是由于凝血因子基因突变导致人体内凝血因子水平降低或缺乏，从而导致出血。凝血因子FⅧ的缺乏或不足导致血友病A，凝血因子IX的缺乏或不足导致血友病B。凝血因子替代治疗是血友病的主要治疗措施。

随着现代层析技术的发展，国外血液制品企业已开发出高纯度人凝血因子制品，满足了血友病患者的需求。我国从病毒安全性考虑，国家药监部门尚未批准人血液来源的凝血因子进口。国内血液制品企业限于技术能力，多以生产人血白蛋白和免疫球蛋白为主，凝血因子类等市场份额非常少，其中凝血因子Ⅷ（防治血友病）极其短缺。因此研究开发凝血因子类血液制品新产品、开展新技术新方法研究，将是血液制品领域的大势所趋。

由于制备人凝血因子VIII产品均以人血浆为原料，因此不能排除传播乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒或者其他病毒/病原体的可能性，因此制备工艺流程中必须包含病毒灭活或去除的方法，例如巴氏灭活、S/D法灭活、20 nm纳米膜过滤法灭活等。而凝血因子VIII易失活，冷冻干燥或干热处理过程容易破坏凝血因子VIII的蛋白稳定性，引起变形，导致凝血因子VIII失活，所以在凝血因子VIII进行冷冻干燥或干热处理时必须添加一定的保护剂或稳定剂。

目前常规的凝血因子VIII保护剂或稳定剂主要使用白蛋白或糖醇，协同氨基酸、无机盐等发挥作用，如中国发明专利201110240278.2和201210468069.8公开的保护剂中引入了人血白蛋白，中国发明专利201210060299.0采用糖醇和氨基酸组合作为保护剂。但是，引入人血白蛋白不但成本高，而且人血白蛋白的使用很可能存在潜在的传播其他病毒或病原体的风险，而使用糖或糖醇制得的产品又不适合糖尿病患者使用，限制了该制品的应用范围，同时该专利制品经热处理灭活病毒后，凝血因子VIII的效价下降严重，热处理后凝血活性收率仅33%左右，实际应用价值不大。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，不使用人血白蛋白或其它动物源蛋白、也不含有糖或糖醇。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，包括柠檬酸钠1~25 mmol/L、氯化钠10~150 mmol/L、氯化钙2~9 mmol/L、甘氨酸10~150 mmol/L、精氨酸10~150 mmol/L、组氨酸10~150 mmol/L、赖氨酸10~150 mmol/L、表面活性剂0.01~0.25 mmol/L；所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。

作为一种优选方案，所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂由柠檬酸钠10~15 mmol/L、氯化钠50~100 mmol/L、氯化钙4~7 mmol/L、甘氨酸50~100 mmol/L、精氨酸50~100 mmol/L、组氨酸50~100 mmol/L、赖氨酸50~100 mmol/L、表面活性剂0.1~0.2 mmol/L组成，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。

作为一种进一步优选方案，所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂由柠檬酸钠13 mmol/L、氯化钠80 mmol/L、氯化钙6 mmol/L、甘氨酸80 mmol/L、精氨酸80 mmol/L、组氨酸80 mmol/L、赖氨酸80 mmol/L、表面活性剂0.15 mmol/L组成，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。

本发明使用非离子型表面活性剂的，不但可以协同柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙、甘氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸发挥保护作用，提高人凝血因子VIII的稳定性，还可以降低人凝血因子VIII冻干制品复溶于水的介电常数，避免蛋白质成分因带电荷而导致絮凝沉淀，保证了最后人凝血因子VIII制品的质量。此外通过实验证明，常规的阳离子表面活性剂（如十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基氯化铵等）和阴离子表面活性剂（如硬脂酸钠、十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸酯等）对人凝血因子VIII的保护作用明显不如非离子型表面活性剂优越，同时阳离子型表面活性剂毒性较大，阴离子型表面活性剂溶血活性较强，会降低人凝血因子VIII产品的品质。

优选地，所述非离子型表面活性剂为Tween类（聚山梨酯，吐温）、Span类（失水山梨醇脂肪酸酯，司盘）、辛基酚聚氧乙烯醚类、壬基酚聚氧乙烯醚类、二缩甘露醇单油酸酯类或Pluronic类（泊洛沙姆类）表面活性剂。

具体地，所述非离子型表面活性剂为吐温80、吐温60、吐温40、司盘80、司盘60、司盘20、TritonX-100、Neutronyx 600、Arlacel A等。

更优选地，所述非离子型表面活性剂为Tween类表面活性剂，如吐温80、吐温60、吐温40等。

最优选地，所述表面活性剂为吐温80，制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂效果最优。

作为一种实施方案，本发明所述干热处理的条件是80℃干热处理72 h或100℃干热处理0.5 h。

本发明所述冻干为本领域常规的冷冻干燥处理。

本发明选用的氨基酸种类和用量配比并非常规选择，必须同时使用上述用量配比的甘氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸的保护剂才能实现人凝血因子VIII制品经干热处理灭活病毒保持高效价和高比活性的作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）不含有人血白蛋白或其它动物源蛋白、也不含有糖或糖醇，由可溶性盐、氨基酸及表面活性剂组成，不存在传播其他病毒或病原体的风险，适合人群范围广，包括糖尿病患者。

（2）使用本发明保护剂的人凝血因子VIII制品经干热处理灭活病毒后，凝血因子VIII仍然保持高效价和高比活性，效价大于标示量的80%、比活性大于40 IU/mg。

（3）使用本发明保护剂的人凝血因子VIII制品冻干后复溶快，远低于复溶时间30min的质量标准，而且复溶效果好，复溶液澄清微带乳光。

（4）本发明人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂不含人血白蛋白，成本低廉，制备简单，保护效果明显，安全有效，具有很好的工业应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1  

一、制备人凝血因子VIII溶液

（1）制作冷沉淀及冷沉淀溶解

以新鲜冰冻人血浆为原料，经血浆融化，离心制备冷沉淀，将冷沉淀用15~20℃预冷的含有8 IU/ml肝素的生理盐水溶解，生理盐水的用量为沉淀重量的7~9倍，搅拌溶解后静置60 min。

（2）铝胶吸附

将静置后的溶解液升温至25~28℃，加入同温度质量浓度3%的氢氧化铝凝胶，加入量为冷沉淀重量的40%，采用搅拌下浸润的方式加入，即在80~100 rpm搅拌速度下，用乳胶管将氢氧化铝凝胶泵入溶解液的液面以下，添加速度为80~100 ml/min，添加完毕后降温至15~20℃，12000 rpm离心除杂，去上清液。

（3）S/D病毒灭活

上清液升温至35℃，加入S/D病毒灭活剂保温3h完成第一次病毒灭活，得到病毒灭活液，其中S/D病毒灭活剂含有1%聚山梨醇（Tween-80）、0.3%磷酸三丁酯（TNBP）。

（4）凝胶柱层析纯化

将凝胶柱用洗液1平衡，病毒灭活液上样凝胶柱层析，在280 nm波长紫外光监测下，用洗液2洗柱4倍柱体积，用洗液3洗脱凝血因子VIII，并收集。其中凝胶型号为DEAE-SAPHROSE FF,上样及洗脱流速为220~250 ml/min，洗液1的配方为110 mM氯化钠，10 mM枸橼酸钠，1 mM氯化钙，16 mM赖氨酸，120 mM甘氨酸，pH7.0；洗液2的配方为150 mM氯化钠，10 mM枸橼酸钠，1 mM氯化钙，16 mM赖氨酸，120 mM甘氨酸，pH7.0；洗液3的配方为250 mM氯化钠，10 mM枸橼酸钠，1 mM氯化钙，16 mM赖氨酸，120 mM甘氨酸，pH7.0。

（5）超滤浓缩

将收集的凝血因子VIII进行超滤脱醇和脱盐，得到高浓度浓缩凝血因子VIII溶液，凝血因子VIII的效价控制在40 IU/ml。

二、制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂

按比例称取各类无机盐、氨基酸及表面活性剂，采用普通医用注射用水配置人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中各类原来的浓度如下：柠檬酸钠13 mmol/L、氯化钠80 mmol/L、氯化钙6 mmol/L、甘氨酸80 mmol/L、精氨酸80 mmol/L、组氨酸80 mmol/L、赖氨酸80 mmol/L、吐温80 0.15 mmol/L。

三、人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂的使用

将步骤一制得的凝血因子VIII溶液与步骤二制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂按照体积比1:1混合，使得凝血因子VIII的效价控制在20 IU/ml，再将混合溶液分装到蛋白瓶内（10 ml/瓶），冷冻干燥后封盖，再经过80℃干热处理灭活病毒，制得人凝血因子VIII成品。

实施例2  

一、制备人凝血因子VIII溶液

参照实施例1的步骤一。

二、制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂

按比例称取各类无机盐、氨基酸及表面活性剂，采用普通医用注射用水配置人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中各类原来的浓度如下：柠檬酸钠10 mmol/L、氯化钠100 mmol/L、氯化钙4 mmol/L、甘氨酸50 mmol/L、精氨酸50 mmol/L、组氨酸100 mmol/L、赖氨酸100 mmol/L、吐温80 0.1 mmol/L。

三、人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂的使用

参照实施例1的步骤三。

实施例3  

一、制备人凝血因子VIII溶液

参照实施例1的步骤一。

二、制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂

按比例称取各类无机盐、氨基酸及表面活性剂，采用普通医用注射用水配置人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中各类原来的浓度如下：柠檬酸钠15 mmol/L、氯化钠50 mmol/L、氯化钙7 mmol/L、甘氨酸100 mmol/L、精氨酸100 mmol/L、组氨酸80 mmol/L、赖氨酸80 mmol/L、吐温80 0.2 mmol/L。

三、人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂的使用

参照实施例1的步骤三。

实施例4 

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂时将吐温80替换为吐温60。

实施例5 

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂时将吐温80替换为吐温40。

实施例6 

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂时将吐温80替换为司盘80。

实施例7 

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂时将吐温80替换为TritonX-100。

实施例8 

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂时将吐温80替换为Neutronyx 600。

实施例9 

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂时将吐温80替换为Arlacel A（失水甘露糖醇单油酸酯）。

对比例 1  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂不含有吐温80成分。

对比例2  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中吐温80的含量为0.5 mmol/L。

对比例3  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中不含有甘氨酸。

对比例4  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中不含有精氨酸。

对比例5  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中不含有组氨酸。

对比例6  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中不含有赖氨酸。

对比例7  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂时将吐温80替换为十六烷基氯化吡啶。

对比例8  

主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中将吐温80替换为十二烷基硫酸钠。

相关检测

（一）将上述实施例及对比例制得人凝血因子VIII成品参照中国药典质量标准的检测方法进行检验，采用下列指标进行产品优劣分析：

1、产品干热后效价。

2、产品干热比活性（药典质量标准为≥1.0 IU/mg蛋白质）。

3、产品外观、可见异物和复溶时间（符合药典规定为合格，不符合药典规定为不合格。药典规定：外观应为乳白色疏松体，复溶后溶液应为无色澄清液体，可带轻微乳光；可见异物，除允许有微量细小蛋白颗粒外，其余应符合规定；复溶时间应≤30 min）。

检测结果如下表所示：

 干热后效价（%）干热比活性（IU/mg蛋白质）外观可见异物复溶时间（min）实施例186.644.41合格合格≤5实施例285.942.12合格合格≤5实施例386.242.19合格合格≤5实施例484.540.03合格合格≤5实施例584.140.01合格合格≤5实施例682.738.35合格合格≤5实施例781.837.69合格合格≤5实施例882.238.81合格合格≤5实施例981.637.23合格合格≤5对比例165.226.05较差较多蛋白颗粒≥30对比例272.829.40合格合格≤5对比例373.629.81合格合格≤5对比例474.430.97合格合格≤5对比例575.230.68合格合格≤5对比例675.131.04合格合格≤5对比例767.227.13较差较多蛋白颗粒≥30对比例867.427.21较差较多蛋白颗粒≥30

从上表结果可以看出，实施例1~9的各项检测结果均符合药典质量标准，而对比例1~8，干热后的效价及比活性显著下降，同时未使用非离子型表面活性剂的对比例1、7和8的外观、可见异物和复溶时间也达不到药典质量标准，说明必须同时使用非离子型表面活性剂、甘氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸，而且用量也需要控制在特定范围才能实现本发明所述的有益效果。

（二）实施例1人凝血因子VIII成品的详细检测报告结果如下，该批次制品检验合格：

 检验项目质量标准检验结果鉴别试验仅与抗人血清或血浆产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清或血浆不产生沉淀线。合格外观应为乳白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体，可带轻微乳光。白色粉末，复溶澄清，微带乳光真空度应出现蓝紫色辉光淡蓝色复溶时间（分钟）≤30 5可见异物允许有微量细小蛋白颗粒偶见蛋白颗粒装量差异应符合规定符合规定水分(%)≤3.01.28pH值6.5~7.56.95钠离子(mmol/L)≤160142枸橼酸离子含量(mmol/L)≤2512效价(%) 86.6比活性(IU/mg蛋白质)≥1.044.41抗A血凝素≤1：64合格抗B血凝素≤1：64合格HBsAg阴性阴性抗-HIV阴性阴性抗-HCV阴性阴性无菌检查无菌生长合格异常毒性试验(豚鼠试验、小鼠试验）豚鼠应健存，体重增加；小鼠应健存，体重增加合格热原检查应符合规定未检磷酸三丁酯含量(μg/ml)≤106.85聚山梨酯80含量(μg/ml)≤10020.04甘氨酸含量(mg/瓶)≤13092.6钙离子含量(mg/瓶)≤91.30

（三）干热法灭活对实施例1~9人凝血因子VIII成品的病毒灭活效果

取实施例1~9的人凝血因子VIII成品进行病毒灭活效果检测，结果如下：

指示病毒PRV（伪狂犬病毒）Sindbis（辛德毕斯病毒）实施例1灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例2灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例3灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例4灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例5灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例6灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例7灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例8灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml实施例9灭活效果>4.5 LogTCID₅₀/0.1ml>4.5 LogPFU/ml

从上表结果可以看出，本发明实施例1~9的人凝血因子VIII成品的病毒灭活效果均能达到国家规定的标准（药典规定值为大于4.0 Log）。本发明人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂在保护制品质量的同时也不会影响其干热处理对病毒的灭活作用。