一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法

摘要

本发明公开了一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法，基因转移体的基因序列为：SEQ ID NO：17。所述基因转移体从5′端起到3′端止依次包括有牛核基质结合区(MARs)、RNA聚合酶III类启动子(U6)、以牛肌肉抑素(MSTN)第三号外显子(926-947位点)为靶点的小发夹RNA(shRNA)、CMV启动子、牛卵泡抑素基因(FSTN)、SV40polyA信号区。本发明的基因转移体不含有载体骨干序列，是洁净安全的基因转移体，首次把核基质结合区(MAR)与敲减载体结合，可以有效的增强载体本身的敲减作用，再次本发明通过双启动子独立启动的方法，实现了敲减与过表达同时进行的目的，为改善双、多基因控制的性状如经济性状提供新的思路和途径。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中的基因工程技术领域，涉及一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法。 

背景技术

在转基因动物中外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。影响外源基因高效表达的因素很多，如启动子、甲基化、基因本身结构、插入位点、调控序列(增强子、绝缘子、核基质结合区)等。 

MSTN的主要功能是负向调控肌细胞的生长发育。MSTN基因在进化过程中虽然相当保守，但它对动物的生存和繁殖不是必须的。在MSTN敲除或敲低小鼠中，除肌肉发达外，没有发现其它异常情况。这样既可研究该基因敲低后对动物肌肉发育和生长的影响，又不会对动物的生长发育造成不良后果。以RNAi的方式干扰其表达，试图得到干扰效果良好的干扰载体，为进一步生产干扰MSTN的转基因大动物做铺垫。 

核基质结合区(MARs)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。 

MARs的长度一般为300一1000bp，也有的长达几个kb，维持其活性的最小长度约是300bp，MARs是非编码序列，AT含量高达70％，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的结构基元，如烟草中发现TM2序列具备一般MARs序列的基本特征：其序列全长1001bp，AT含量为62.8％，序列上含有一个典型的T-box，两个潜在的DNA解旋序列(AATATT)和一个潜在的拓扑异构酶II结合位点(CTTTATATTGTTGAC)。 

研究表明，MARs序列的功能包括边界因子(boundarye lement)作用、染色质调节作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARS对转基因表达的调控作用，鉴于MARs与基因表达间的关系，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。 

FSTN，全称叫卵泡抑素(Follistatin，FST)又名FSH抑制蛋白，是一种单链糖蛋白，最初是从牛和猪的卵泡液中分离出来的，因而被称作卵泡抑制素。以旁分泌或自分泌的方式，与转 化生长因子-β(TGF-β)超家族的许多成员，如骨形态发生蛋白(BMP)、肌肉抑素(MSTN)等结合，其中MSTN是目前所知的最强的骨骼肌生长抑制物。FST蛋白能够同MSTN黏合在一起，阻断其抑制功能，从而促进肌肉的生长。 

用基因打靶技术敲除MSTN基因，已在多种模式动物中成功运用，但该技术需要消耗大量的时间和资源而且往往效率很低。由于RNAi转基因小鼠的出现，使在哺乳动物个体水平上研究靶基因的敲减成为了可能。RNAi技术的优越性：①RNAi效应可以遗传。②dsRNA的表达受到特异性启动子的调控，因而可以有目的地在特定时相内启动RNAi。避免基因突变或敲减进行可遗传的修饰时，会过早的沉默基因，从而产生致死表型，使得无法进一步研究，从这点来看RNAi比基因敲除具有优越性。另外，利用RNAi可以很快得到许多有关基因的功能信息，而且可以达到研究信号通路中多个基因的目的。 

有研究证明，大于50bp的外源双链RNA转染细胞后，会引起干扰素途径，但转染19-23bp的shRNA却可以避免干扰素途径，从而特异性降解靶基因，而且这种shRNA具有高效、稳定的特点。 

近年来利用去除质粒载体主干序列的基因表达盒(仅包括启动子、编码区和终止子)作为基因转移体，也称为洁净DNA转化(clean DNA transformatio n)，主要是通过基因枪转化植物，已在水稻、棉花、小麦、葡萄转化中获得成功应用，利用花粉管导入法在甜瓜中也成功利用，很少见在转基因动物尤其哺乳动物中的构建与应用，而且很少见关于RNA干扰载体的基因表达盒的研究，而关于MAR序列与RNA干扰结合构建基因表达盒的研究几乎没有。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法，能使两种目的基因作为双顺反子高效共表达，无质粒载体主干序列、无抗性等选择标记、洁净且安全的双顺反子共表达基因转移体。其具体技术方案为： 

种双顺反子共表达基因转移体，基因转移体的基因序列为：SEQ ID NO：17。 

进一步优选，所述基因转移体从5′端起到3′端止依次包括有牛核基质结合区(MARs)、RNA聚合酶III类启动子(U6)、以牛肌肉抑素(MSTN)第三号外显子(926-947位点)为靶点的小发夹RNA(shRNA)、CMV启动子、牛卵泡抑素基因(FSTN)、SV40polyA信号区。 

进一步优选，所述核基质结合区MAR的序列通过如下引物进行PCR获得： 

U6前的MAR序列： 

MAR-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：1； 

MAR-R反义链，5′到3′：SEQ IDNO：2。 

进一步优选，所述核基质结合区MAR的序列为：SEQ ID NO：15。 

进一步优选，所述CMV启动子的序列通过如下引物进行PCR获得： 

CMV-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：3； 

CMV-R反义链，5′到3′：SEQ IDNO：4。 

进一步优选，所述CMV启动子的序列为：SEQ ID NO：16。 

进一步优选，：所述干扰牛肌肉抑素基因(MSTN)的shRNA序列为： 

Sh926正向，5′到3′：SEQ ID NO：5； 

Sh926反向，5′到3′：SEQ ID NO：6。 

进一步优选，所述卵泡抑素(FSTN)基因的序列通过如下引物进行PCR获得： 

FSTN-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：7； 

FSTN-R反义链，5′到3′：SEQ IDNO：8。 

进一步优选，所述FSTN基因的序列为：SEQ ID NO：18。 

一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法，步骤如下： 

第一步，CMV启动子的获得和插入pDsRed载体，构建pCDsRed载体； 

第二步，shRNA的设计与合成并插入pSilencerTM2.1-U6载体获得pSilencerTM2.1-U6-shRNA载体； 

第三步，U6-shRNA的获得并插入pCDsRed载体获得干扰载体pU6-shRNA-CMV-DsRed； 

第四步，克隆MAR序列并插入干扰载体pU6-shRNA-CMV-DsRed获得pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体； 

第五步，FSTN基因的克隆并替换pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体中的DsRed基因，从而获得pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN载体； 

第六步，质粒载体pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN构建完毕后，用Xhol I、Afl II双酶切，通过双酶切的方法获得MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子共表达基因转移体。 

进一步优选，所述步骤第一步，进一步的具体步骤包括： 

(1)依据CMV启动子序列设计引物； 

(2)通过PCR反应获得CMV的全长片断； 

(3)测序：通过胶回收的方法回收该片段，连接到PMD19T-simple vector上，转化并涂平板，挑菌并摇菌，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌液送去测序； 

(4)基因片段插入pDsRed载体：选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行Kpn I和Sma I双酶切，获得的片段通过Kpn I和Sma I两个酶切位点插入到初始载体中， 并进行酶切鉴定和PCR鉴定，以确保外源基因正确插入。 

进一步优选，所述步骤第二步，进一步的具体步骤包括： 

(1)牛MSTN基因序列及shRNA设计原则设计shRNA，并在牛基因组范围内进行同源性比对，排除非特异性干扰；在干扰片段的5’端和3’端引入BamH I和HindIII识别位点； 

(2)所设计的shRNA合成并退火； 

(3)将合成并退火后的shRNA通过在干扰片段的5’端和3’端引入BamH I和HindIII识别位点插入到初始载体pSilencerTM2.1-U6中。 

进一步优选，所述步骤第三步，进一步的具体步骤包括： 

(1)将将鉴定正确的pCDsRed载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒； 

(2)将鉴定正确的pSilencer^TM2.1-U6-shRNA载体分别在添加氨苄青霉素的液体LB培养基中培养并提取质粒； 

(3)用EcoR I和HindIII对这俩个载体进行双酶切，将切下的U6-shRNA连入pCDsRed中，转化并涂平板，挑菌并摇菌，然后送去测序，以确保U6-shRNA片段正确插入到pCDsRed载体中；获得pU6-shRNA-CMV-DsRed。 

进一步优选，所述步骤第四步，进一步的具体步骤包括： 

(1)依据MAR序列设计引物； 

(2)通过PCR反应获得MAR的全长片断； 

(3)测序：通过胶回收的方法回收该片段，连接到PMD19T-simple vector上，转化并涂平板，挑菌并摇菌，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌液送去测序； 

(4)基因片段插入pU6-shRNA-CMV-DsRed载体：选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行Xho I和HindIII双酶切，获得的片段通过Xho I和HindIII两个酶切位点插入到pU6-shRNA-CMV-DsRed载体中，并进行酶切鉴定和PCR鉴定，以确保外源基因正确插入。 

进一步优选，所述步骤第五步，进一步的具体步骤包括： 

(1)依据FSTN基因序列设计引物； 

(2)通过PCR反应获得FSTN的全长片断； 

(3)测序：通过胶回收的方法回收该片段，连接到PMD19T-simple vector上，转化并涂平板，挑菌并摇菌，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌液送去测序； 

(4)基因片段插入pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体：选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行Sma I和Not I双酶切，并对pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体也进行Sma I和Not I双酶切，获得的片段通过Sma I和Not I两个酶切位点插入到pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体中替换掉载体中原有的DsRed基因，并进行酶切鉴定和 PCR鉴定，以确保外源基因正确插入。 

进一步优选，所述步骤第六步，进一步的具体步骤包括： 

(1)对鉴定正确的pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒； 

(2)用通过Xho I和AflII对质粒载体pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收获得MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子基因转移体。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

本发明的基因转移体不含有载体骨干序列，是洁净安全的基因转移体，而且，本发明首次把核基质结合区(MAR)与敲减载体结合，可以有效的增强载体本身的敲减作用，再次本发明通过双启动子独立启动的方法，实现了敲减与过表达同时进行的目的，为改善双、多基因控制的性状如经济性状提供新的思路和途径。 

附图说明

图1是初始载体pDsRed结构示意图； 

图2是载体pCDsRed结构示意图； 

图3是载体pSilencerTM2.1-U6-shRNA质粒结构示意图； 

图4是载体pU6-shRNA-CMV-DsRed-结构示意图； 

图5是载体pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed结构示意图； 

图6是载体pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN结构示意图； 

图7是MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子基因转移体结构示意图； 

图8是CMV插入pDsRed构建成pCDsRed载体的PCR鉴定图； 

图9是CMV插入pDsRed构建成pCDsRed载体的酶切鉴定图； 

图10是U6-shRNA插入pCDsRed构建成pU6-shRNA-CMV-DsRed载体的测序鉴定图； 

图11是MAR插入pU6-shRNA-CMV-DsRed载体构建成pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体的PCR鉴定图； 

图12是MAR插入pU6-shRNA-CMV-DsRed载体构建成pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体的酶切鉴定图； 

图13是FSTN插入pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体构建成pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN载体的PCR鉴定图； 

图14是FSTN插入pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体构建成pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN载体的酶切鉴定图； 

图15是转基因小鼠的鉴定结果； 

图16是MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN以及U6-shRNA926-CMV-FSTN基因表达盒在小鼠个体中对于外源性FSTN基因过表达的作用转U6-shRNA926-CMV-FSTN和MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN表达盒的小鼠其各类肌肉中外源性FSTN的表达情况。A，转基因小鼠肠中FSTN的过表达情况；其中U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组，U6-shRNA926-CMV-FSTN组与MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组存在显著性差异，p＜0.05；MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组存在极显著性差异，p＜0.001。B，转基因小鼠胃中FSTN的过表达情况；其中U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组，U6-shRNA926-CMV-FSTN组与MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组存在显著性差异，p＜0.05；MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组存在极显著性差异，p＜0.001。C，转基因小鼠心脏中FSTN的过表达情况；其中U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组不存在显著性差异，p＞0.05；MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组，U6-shRNA926-CMV-FSTN组与MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组存在极显著性差异，p＜0.001。D，转基因小鼠骨骼肌中FSTN的过表达情况；其中U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组不存在显著性差异，p＞0.05；MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组，U6-shRNA926-CMV-FSTN组与MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组存在极显著性差异，p＜0.001； 

图17是MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN以及U6-shRNA926-CMV-FSTN基因表达盒在小鼠个体中对于内源U6-shRNA926-CMV-FSTN和MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN表达盒对于小鼠各类肌肉内源性MSTN的干扰效率： 

A，U6-shRNA926-CMV-FSTN和MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN表达盒对于小鼠骨骼肌MSTN的干扰效率。MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN相对于野生组和U6-shRNA926-CMV-FSTN组其干扰效率存在显著性差异，p＜0.05。B，U6-shRNA926-CMV-FSTN和MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN表达盒对于小鼠胃(平滑肌)MSTN的干扰效率。U6-shRNA926-CMV-FSTN和MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN组与野生组存在及显著性差异，p＜0.001。C，U6-shRNA926-CMV-FSTN和MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN表达盒对于小鼠心肌MSTN的干扰效率。MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN相对于野生组和U6-shRNA926-CMV-FSTN组其干扰效率存在显著性差异，p＜0.05； 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。 

一种双顺反子共表达基因转移体，基因转移体的基因序列为：SEQ ID NO：15。 

而且，如图7所示，所述基因转移体从5′端起到3′端止依次包括有牛核基质结合区(MARs)、RNA聚合酶III类启动子(U6)、以牛肌肉抑素(MSTN)第三号外显子(926-947位点)为靶点的小发夹RNA(shRNA)、CMV启动子、牛卵泡抑素基因(FSTN)、SV40polyA信号区。 

而且，所述核基质结合区MAR的序列通过如下引物进行PCR获得： 

MAR-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：1； 

MAR-R反义链，5′到3′：SEQ ID NO：2。 

而且，所述核基质结合区MAR的序列为：SEQ ID NO：15。 

而且，所述CMV启动子的序列通过如下引物进行PCR获得： 

CMV-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：3； 

CMV-R反义链，5′到3′：SEQ ID NO：4； 

而且，所述CMV启动子的序列为：SEQ ID NO：16。 

而且，所述干扰牛肌肉抑素基因(MSTN)的shRNA序列为： 

Sh926正向，5′到3′：SEQ ID NO：5； 

Sh926反向，5′到3′：SEQ ID NO：6。 

而且，所述卵泡抑素基因FSTN的序列通过如下引物进行PCR获得： 

FSTN-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：7； 

FSTN-R反义链，5′到3′：SEQ IDNO：8。 

而且，所述抑制蛋白基因FSTN的序列为：SEQ ID NO：18。 

一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法，步骤如下： 

第一步，CMV启动子的获得和插入pDsRed载体，构建pCDsRed载体；将克隆获得的CMV启动子通过Kpn I和Sma I俩个酶切位点插入到如图1所示的pDsRed载体中，获得如图2所示的pCDsRed载体。具体步骤是 

(1)依据CMV启动子序列设计引物；引物如下： 

CMV-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：3； 

CMV-R反义链，5′到3′：SEQ ID NO：4； 

(2)通过PCR反应获得CMV的全长片断； 

1)PCR反应的体系 

2)PCR反应的条件 

②-④重复35个循环 

通过此反应即可获得CMV启动子的全长片断，片断大小为589bp，序列为：SEQ ID NO：16。 

(3)测序：通过胶回收的方法回收该片段，连接到PMD19T-simple vector上，转化并涂平板，挑菌并摇菌，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌液送去测序； 

(4)基因片段插入pDsRed载体：选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行Kpn I和Sma I双酶切，获得的片段通过Kpn I和Sma I两个酶切位点插入到初始载体中，并进行酶切鉴定和PCR鉴定，以确保外源基因正确插入。在CMV和DsRED中设计一对引物，P出的片段长为403bp，PCR鉴定引物如下： 

SEQ ID NO：9JD-F：GGGCGTGGATAGCGGTTTG 

SEQ ID NO：10JD-R：AGGATGTCCCAGGCGAAGG 

PCR鉴定结果如图8，酶切鉴定结果如图9 

第二步，shRNA的设计与合成并插入pSilencerTM2.1-U6载体获得pSilencerTM2.1-U6-shRNA载体；具体步骤是： 

(1)牛MSTN基因序列及shRNA设计原则设计shRNA，并在牛基因组范围内进行同源性比对，排除非特异性干扰；在干扰片段的5’端和3’端引入BamH I和HindIII识别位点； 

所设计的shRNA片段如下： 

Sh926正向，5′到3′SEQ ID NO：5 

GATCCGCTCTGGAGAATGTGAATTTGTTCAAGAGACAAATTCACATTCTCCAGAGCTT TTTTA 

Sh926反向，5′到3′SEQ ID NO：6 

AGCTTAAAAAAGCTCTGGAGAATGTGAATTTGTCTCTTGAACAAATTCACATTCTCCAGAGCG 

(2)所设计的shRNA合成并退火 

(3)将合成并退火后的shRNA通过在干扰片段的5’端和3’端引入BamH I和HindIII识别位点插入到初始载体pSilencerTM2.1-U6中。构建成如图3所示的pSilencerTM2.1-U6-shRNA载体。 

第三步，U6-shRNA的获得并插入如图3所示的pCDsRed载体获得如图4所示的干扰载体pCDsRed-U6-shRNA；具体步骤是： 

(1)将将鉴定正确的pCDsRed载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒； 

(2)将鉴定正确的pSilencer^TM2.1-U6-shRNA载体分别在添加氨苄青霉素的液体LB培养基中培养并提取质粒； 

(3)用EcoR I和HindIII对这俩个载体进行双酶切，将切下的U6-shRNA连入pCDsRed中，转化并涂平板，挑菌并摇菌，然后送去测序，以确保U6-shRNA片段正确插入到pCDsRed载体中；获得pU6-shRNA-CMV-DsRed。鉴定结果如图10所示。 

第四步，克隆MAR序列并插入如图4所示的干扰载体pU6-shRNA-CMV-DsRed获得如图5所示的pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体； 

(1)依据MAR序列设计引物；所设计的引物如下： 

MAR-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：1； 

MAR-R反义链，5′到3′：SEQ IDNO：2。 

(2)通过PCR反应获得MAR的全长片断； 

1)PCR反应的体系 

2)PCR反应的条件 

②-④重复35个循环 

通过此反应即可获得MAR序列的全长片断，片断大小为1171bp，序列为：SEQ ID NO：15。 

(3)测序：通过胶回收的方法回收该片段，连接到PMD19T-simple vector上，转化并涂平板，挑菌并摇菌，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌液送去测序； 

(4)基因片段插入如图4所示的pU6-shRNA-CMV-DsRed载体：选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行Xho I和HindIII双酶切，获得的片段通过Xho I和HindIII两个酶切位点插入到pU6-shRNA-CMV-DsRed载体中，并进行酶切鉴定和PCR鉴定，以确保外源基因正确插入。在上游MAR和CMV中设计一对引物，P出的片段长为1243bp。所设计的引物如下： 

SEQ ID NO：11MC-F：GGGACGACAGAGGATGAG 

SEQ ID NO：12MC-R：CCAAGTGGGCAGTTTACC 

PCR鉴定结果如图11，酶切鉴定结果如图12 

第五步，FSTN基因的克隆并替换如图5pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体中的DsRed基因，从而获得如图6所示的pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN载体；具体步骤是： 

(1)依据FSTN基因序列设计引物；所设计引物如下： 

FSTN-F正义链，5′到3′：SEQ ID NO：7； 

FSTN-R反义链，5′到3′：SEQ IDNO：8。 

(2)通过PCR反应获得FSTN的全长片断； 

1)PCR反应的体系 

2)PCR反应的条件 

②-④重复35个循环 

通过此反应即可获得FSTN基因的全长片断，片断大小为1067bp，序列为：SEQ ID NO：18。 

(3)测序：通过胶回收的方法回收该片段，连接到PMD19T-simple vector上，转化并涂平板，挑菌并摇菌，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌液送去测序； 

(4)基因片段插入如图5所示的pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体：选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行Sma I和Not I双酶切，并对pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体也进行Sma I和Not I双酶切，获得的片段通过Sma I和Not I两个酶切位点插入到pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体中替换掉载体中原有的DsRed基因，并进行酶切鉴定和PCR鉴定，以确保外源基因正确插入。在CMV和FSTN中设计一对引物，P出的片段长为489bp。所设计的引物如下： 

SEQ ID NO：13CF-F：GCGTGGATAGCGGTTTGACT 

SEQ ID NO：14CF-R：TCTTTACAAGGGATGCAGTTGG 

PCR鉴定结果如图13，酶切鉴定结果如图14. 

第六步，如图6所示的质粒载体pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN构建完毕后，用XholI、Afl II双酶切，通过双酶切的方法获得如图7所示的MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子共表达基因转移体。具体步骤是： 

(1)对鉴定正确的如图6所示的pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒； 

(2)用通过Xho I和AflII对质粒载体pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收获得如图7所示的MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子基因转移体。 MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子基因转移体全序列见SEQ ID NO：17. 

本发明MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子共表达基因转移体的表达水平的鉴定，其鉴定过程如下： 

MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN以及U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子共表达基因转移体通过显微注射方法获得转基因小鼠； 

(1)转基因小鼠的获得：通过显微注射的方法获得，具体步骤如下： 

①DNA的准备：酶切并回收基因表达盒MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN以及U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子共表达基因转移体； 

②通过原核注射的方法制备转基因小鼠 

(2)转基因小鼠的鉴定： 

通过PCR来检测MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN转基因小鼠，设计从CMV到FSTN的引物，阳性鼠应该得到286bp的片段。引物序列见表1.1。鉴定结果如图16所示，制备的7只转基因鼠(其中三只MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN转基因小鼠，四只U6-shRNA-CMV-FSTN转基因小鼠)均为阳性。而且MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN转基因雄鼠与阴性雌鼠交配获得的俩只F1代MAR-shRNA926-FSTN转基因小鼠也是阳性的。 

表1转基因小鼠PCR检测引物 

Table1.1The PCR detection primers of transgenic mice 

(3)验证MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN双顺反子共表达基因转移体在小鼠个体水平上的作用 

分别提取原代转基因阳性小鼠的骨骼肌、心肌以及平滑肌(肠和胃)的总RNA，并通过Real-time PCR的方法检验转基因小鼠与非转基因阴性对照相比，其MSTN及外源性(牛)FSTN基因的表达情况，从而验证MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN以及U6-shRNA-CMV-FSTN基因表达盒在个体水平上的功能。 

(1)MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN以及U6-shRNA-CMV-FSTN基因表达盒在小鼠个体中对于外源性FSTN基因过表达的作用 

通过Real-time PCR的方法检验转基因小鼠中外源性(牛)FSTN基因的表达。结果如图17，在转基因小鼠的肠、胃、心脏以及骨骼肌中外源性的FSTN表达都明显的增强了，其中 在胃中其表达增强最为明显，转U6-shRNA926-CMV-FSTN和MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN表达盒的小鼠其外源性FSTN分别过表达了199.79倍和329.93倍；其次是肠，FSTN分别过表达了53.96倍和93.4倍；再次是在骨骼肌中FSTN分别过表达了2.5倍和58.57倍；在心脏中FSTN分别过表达了3.69倍和24.12倍。 

(2)MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN以及U6-shRNA-CMV-FSTN基因表达盒在小鼠个体中对于内源性MSTN基因的敲减作用 

通过Real-time PCR的方法检验转基因小鼠中内源性性MSTN基因的表达，从而来确定干扰载体对于内源性MSTN的干扰效果。在转基因小鼠及野生型小鼠的肠中均没有检测到MSTN基因的表达；在转sh926-FSTN的转基因小鼠中，胃(平滑肌)中的MSTN被明显的干扰了，其干扰效率达到了97.25％，而在骨骼肌和心肌中基本没有干扰效果；在MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN转基因小鼠中，胃(平滑肌)中MSTN的干扰效率达到了98.38％，而在骨骼肌和心肌中其干扰效率分别为22.79％和41.82％。由此可以证明MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN和U6-shRNA926-CMV-FSTN基因表达盒对胃部(平滑肌)的MSTN有明显的干扰作用，MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN相比于U6-shRNA926-CMV-FSTN对心肌和骨骼肌也存在显著性的干扰效果。 

上述实验结果表明，本发明所构建的MAR-U6-shRNA-CMV-FSTN独立基因转移体可以有效的在个体水平表达，并且可以显著的上调外源过表达基因的表达，下调内源干扰基因的表达，起到了过表达与干扰载体共同发挥的作用，而且MAR的插入有效的增强了基因转移体在个体水平的表达。且无任何质粒载体主干序列和任何选择性抗性基因及标志基因，是安全有效的新型基因转移体。 

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。 

SEQUENCE LISTING(序列表) 

<110>内蒙古大学 

<120>一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法 

<160>18 

<170>PatentIn version3.3 

<210>1 

<211>31 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

aatcgctcga gaaattgtaa caatgtatag   a                         31 

<210>2 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

aatcgaagct ttgagtcatc   c                                    21 

<210>3 

<211>34 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

cggggtacct agttattaat agtaatcaat tacg                        34 

<210>4 

<211>29 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

tcccccgggg atctgacggt tcactaaac                                            29 

<210>5 

<211>63 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

gatccgctct ggagaatgtg aatttgttca agagacaaat tcacattctc cagagctttt   60 

tta                                                                        63 

<210>6 

<211>63 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

agcttaaaaa agctctggag aatgtgaatt tgtctcttga acaaattcac attctccaga   60 

gcg                                                                        63 

<210>7 

<211>30 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>7 

aatcgcccgg gtgccctcag gatggcccgt                                           30 

<210>8 

<211>31 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>8 

aatcggcggc cgctgaacat tggtggaggg t                                         31 

<210>9 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>9 

gggcgtggat agcggtttg                               19 

<210>10 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>10 

aggatgtccc aggcgaagg                               19 

<210>11 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>11 

gggacgacag aggatgag                               18 

<210>12 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>12 

ccaagtgggc agtttacc                               18 

<210>13 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>13 

gcgtggatag cggtttgact                              20 

<210>14 

<211>22 

<212>DNA 

<213>人工序列. 

<400>14 

tctttacaag ggatgcagtt gg                                              22 

<210>15 

<211>1170 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>15 

aaattgtaac aatgtataga aataataatt acattaaaaa tattgagttg tgtttccatg    60 

aaagtattca cctttatatc aatgtctaaa ataaagcatt tccttatcca accctagatt    120 

ctttctgtaa gcaggatatc actcaagtaa cagtttatct atctatgttg tactaacatc    180 

accactctcc ttttacctcc agccaaaagt tcattcattt tgcactaaca aggcatctac    240 

ctacctaaga gacttgggaa aaaatggact aaaatttaac tgtgttaact aaatgctacc    300 

taatgagttc tttctgaaag actgtatttt ggtgggtaaa gagattttac ctatcatgaa    360 

tatctcttct gacttgacaa aatgtggttt tcatgattga taaatcttcc tagctctagt    420 

cattggttgt ccatgtttaa cagtgttaat atgaagatat aatgtattta acatgcctta    480 

ctaacttcag gagatcagcc ctgggatttc tttggaagga atgatgctga agctgaaact    540 

ccagtacttt ggccacctca tgcgaagagt tgactcattg ggaaagagtc tgatgctggg    600 

agggattggg agcaggagga gaaggggacg acagaggatg agatggctgg atggcatcac    660 

tgactcgatg gacctgagtc tgagtgaact ctgggagttg gtgatggaca gggaggcctg    720 

gtgtgctgcg attcatgggg tcgcaaagag ttggacacga ctgagtgact gaactgaact    780 

gaactgaact aactccagga gatagtaaag gacaggaaag tctgaagtgc ttcagttcac    840 

gaggtcacaa agtgtgagac atgaattaac aactgaacaa cagtaacaac tagctatcaa    900 

aactagctat cttatcctat cagatgggat aataaaccat ccttctgtag aatggaatat    960 

atgcatttat taatcaattt ttatagttct ttgcattgtc taaaatcttc ttttaattat    1020 

gaatccattt actcttcata agaattgtgt agtgagggga aagcagaagt tatactttct    1080 

tttgtagata aggaaaccaa accatctgta agttaagtga attacttctg tacaaggtct    1140 

tgcatctgct aacaaggaaa ggatgactca                                     1170 

<210>16 

<211>589 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>16 

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg    60 

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt    120 

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca    180 

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc    240 

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta    300 

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac    360 

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg    420 

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg    480 

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt    540 

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatc                589 

596 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>17 

ctcgagctaa attgtaacaa tgtatagaaa taataattac attaaaaata ttgagttgtg    60 

tttccatgaa agtattcacc tttatatcaa tgtctaaaat aaagcatttc cttatccaac    120 

cctagattct ttctgtaagc aggatatcac tcaagtaaca gtttatctat ctatgttgta    180 

ctaacatcac cactctcctt ttacctccag ccaaaagttc attcattttg cactaacaag    240 

gcatctacct acctaagaga cttgggaaaa aatggactaa aatttaactg tgttaactaa    300 

atgctaccta atgagttctt tctgaaagac tgtattttgg tgggtaaaga gattttacct    360 

atcatgaata tctcttctga cttgacaaaa tgtggttttc atgattgata aatcttccta    420 

gctctagtca ttggttgtcc atgtttaaca gtgttaatat gaagatataa tgtatttaac    480 

atgccttact aacttcagga gatcagccct gggatttctt tggaaggaat gatgctgaag    540 

ctgaaactcc agtactttgg ccacctcatg cgaagagttg actcattggg aaagagtctg    600 

atgctgggag ggattgggag caggaggaga aggggacgac agaggatgag atggctggat    660 

ggcatcactg actcgatgga cctgagtctg agtgaactct gggagttggt gatggacagg    720 

gaggcctggt gtgctgcgat tcatggggtc gcaaagagtt ggacacgact gagtgactga    780 

actgaactga actgaactaa ctccaggaga tagtaaagga caggaaagtc tgaagtgctt    840 

cagttcacga ggtcacaaag tgtgagacat gaattaacaa ctgaacaaca gtaacaacta    900 

gctatcaaaa ctagctatct tatcctatca gatgggataa taaaccatcc ttctgtagaa    960 

tggaatatat gcatttatta atcaattttt atagttcttt gcattgtcta aaatcttctt    1020 

ttaattatga atccatttac tcttcataag aattgtgtag tgaggggaaa gcagaagtta    1080 

tactttcttt tgtagataag gaaaccaaac catctgtaag ttaagtgaat tacttctgta    1140 

caaggtcttg catctgctaa caaggaaagg atgactcaca agcttcgatc cgctctggag    1200 

aatgtgaatt tgttcaagag acaaattcac attctccaga gcttttttgg taccagatcc    1260 

gacgccgcca tctctaggcc cgcgccggcc ccctcgcaca gacttgtggg agaagctcgg    1320 

ctactcccct gccccggtta atttgcatat aatatttcct agtaactata gaggcttaat    1380 

gtgcgataaa agacagataa tctgttcttt ttaatactag ctacatttta catgataggc    1440 

ttggatttct ataagagata caaatactaa attattattt taaaaaacag cacaaaagga    1500 

aactcaccct aactgtaaag taattgtgtg ttttgagact ataaatatcc cttggagaaa    1560 

agccttgttt ggatccgctc tggagaatgt gaatttgttc aagagacaaa ttcacattct    1620 

ccagagcttt tttgaattct gcagtcgacg gtaccgcggg tagttattaa tagtaatcaa    1680 

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa    1740 

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg    1800 

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt    1860 

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg    1920 

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc    1980 

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc    2040 

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca    2100 

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta    2160 

acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa    2220 

gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc ccgggtgccc tcaggatggc ccgtcctagg    2280 

caccagcccg gcgggctttg cctcctgctg ctgcttctct gccagttcat ggaggaccgc    2340 

agcgcccagg ctgggaattg ctggctccgc caagcaaaga acggccgctg tcaggtcctg    2400 

tacaagacag aactgagcaa ggaggagtgt tgcagcactg gccgcctgag cacctcgtgg    2460 

accgaggagg acgtaaatga caacacgctg ttcaagtgga tgattttcaa cgggggcgcc    2520 

cccaactgca tcccttgtaa agaaacgtgt gagaacgtgg actgtggccc cggaaaaaaa    2580 

tgccgaatga acaagaagaa taaaccccgc tgcgtctgtg ccccagattg ttctaacatc    2640 

acctggaaag gcccggtgtg tgggctggat ggaaaaacct accgcaacga atgtgcactc    2700 

ctcaaggcca gatgtaaaga gcagccagag ctgcaagtcc agtaccaggg caaatgtaaa    2760 

aagacctgtc gggatgtttt ctgtccaggc agctctacat gcgtggtgga ccagactaat    2820 

aatgcctact gtgtgacttg taacagaatt tgcccagagc ccacctcctc tgaacagtat    2880 

ctctgtggga atgatggagt gacctacccc agtgcctgtc acctgagaaa agctacctgc    2940 

ctactgggca gatctattgg attggcctat gagggaaagt gtatcaaagc aaagtcctgt    3000 

gacgatatcc agtgcactgg tggaaaaaag tgtttatggg acttcaaggt tggcagaggc    3060 

cggtgttcac tctgcggtga gctgtgccct gagagtaagt ctgaggagcc tgtctgtgcc    3120 

agtgacaatg ccacctatgc tagcgagtgt gccatgaagg aagcggcctg ctcctcgggc    3180 

gtgctgctgg aagtgaagca ctccggatct tgcaactcca tttcggaaga caccgaagac    3240 

gaggaggaag atgaagacca ggactacagc tttcctatat cttccattct agagtggtaa    3300 

accctccacc aatgttcagc ggccgcgact ctagatcata atcagccata ccacatttgt    3360 

agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat    3420 

gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa    3480 

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgta    3540 

aattgtaaca atgtatagaa ataataatta cattaaaaat attgagttgc ttaagt        3596 

<210>18 

<211>1062 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>18 

tgccctcagg atggcccgtc ctaggcacca gcccggcggg ctttgcctcc tgctgctgct    60 

tctctgccag ttcatggagg accgcagcgc ccaggctggg aattgctggc tccgccaagc    120 

aaagaacggc cgctgtcagg tcctgtacaa gacagaactg agcaaggagg agtgttgcag    180 

cactggccgc ctgagcacct cgtggaccga ggaggacgta aatgacaaca cgctgttcaa    240 

gtggatgatt ttcaacgggg gcgcccccaa ctgcatccct tgtaaagaaa cgtgtgagaa    300 

cgtggactgt ggccccggaa aaaaatgccg aatgaacaag aagaataaac cccgctgcgt    360 

ctgtgcccca gattgttcta acatcacctg gaaaggcccg gtgtgtgggc tggatggaaa    420 

aacctaccgc aacgaatgtg cactcctcaa ggccagatgt aaagagcagc cagagctgca    480 

agtccagtac cagggcaaat gtaaaaagac ctgtcgggat gttttctgtc caggcagctc    540 

tacatgcgtg gtggaccaga ctaataatgc ctactgtgtg acttgtaaca gaatttgccc    600 

agagcccacc tcctctgaac agtatctctg tgggaatgat ggagtgacct accccagtgc    660 

ctgtcacctg agaaaagcta cctgcctact gggcagatct attggattgg cctatgaggg    720 

aaagtgtatc aaagcaaagt cctgtgacga tatccagtgc actggtggaa aaaagtgttt    780 

atgggacttc aaggttggca gaggccggtg ttcactctgc ggtgagctgt gccctgagag    840 

taagtctgag gagcctgtct gtgccagtga caatgccacc tatgctagcg agtgtgccat    900 

gaaggaagcg gcctgctcct cgggcgtgct gctggaagtg aagcactccg gatcttgcaa    960 

ctccatttcg gaagacaccg aagacgagga ggaagatgaa gaccaggact acagctttcc    1020 

tatatcttcc attctagagt ggtaaaccct ccaccaatg ttc                       1062 。