鉴定白花草木樨和黄花草木樨特异分子标记试剂盒及其检测方法

摘要

本发明主要涉及一种根据片段长度鉴定白花草木樨(M.albus)和黄花草木樨(M.officinalis)的特异分子标记及其专用引物。具体包括白花草木樨和黄花草木樨基因组DNA的分子标记引物试剂盒及其检测方法。一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记，其主要特点包括有：白花草木樨和黄花草木樨的PCR检测体系相同，其中包括2×Eco Taq PCR SuperMix，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC，ddH2O。鉴定结果表明，该技术具有成本低、准确度高、稳定性好和简单快捷等特点，尤其是受测群体较大时，此种方法具有更显著的经济效应。

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的分子标记及其专用引物。具体涉及白花草木樨和黄花草木樨基因组DNA的分子标记引物试剂盒及其检测方法。 

背景技术

草木樨属为豆科的一年生或二年生草本植物全世界约19种，分布于北半球的温带和亚热带，在中国主要分布在辽宁、陕西、甘肃、内蒙古等地。目前，草木樨属植物在全世界共有19种(Stevenson,1969)，主要分布于中亚、北非和欧洲，我国现有11种(张保烈等，1992)。草木樨植物主要用作饲料，也是重要的药用植物，有清热解毒、健胃化湿等功效(祝文妹，2008)。草木樨适应性很强，耐旱、耐瘠薄、耐寒、耐盐碱(马丽，2005)，既能作牧草和绿肥，又能保持水土，防风挡沙(丛建明，2012)，同时还是蜜源植物(赵春生，2008)。草木樨固氮效率优于其它豆科牧草(Stickler and Johnson,1959)，利于轮作,是固氮研究模式植物(Hirsch,2002)。 

草木樨生产中仅有3个品种，分别为斯列金1号和天水黄花草木樨、天水白花草木樨。目前生产中流通的品种混杂程度较高，不利于区分，因而准确迅速的区分白花草木樨和黄花草木樨，对于白花草木樨和黄花草木樨的生产具有十分重要的意义。 

传统的分类方法主要依据白花草木樨和黄花草木樨的形态进行区分(Stevenson，1969)，而它们除花色明显不同外在形态学上极为相似，没有快速准确的鉴别方法。而且在长期的生长过程中，两种草木樨有发生杂交和性状交叉，使得两种草木樨在形态学上更难区分。这对两种牧草的生产产生严重影响。 

本研究采用分子标记的方法，设计一对专用引物，依据两种草木樨扩增片段长度不同进行鉴别。该方法具有成本低、准确度高、稳定性好和简单快捷等特点，尤其是受测群体较大时，此种方法具有更显著的经济效应。 

发明内容

本发明的目的一是提供一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的专用引物。 

本发明的目的二是提供一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的试剂盒。 

本发明的目的三是提供一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的方法。 

以便快速、高效和准确的鉴定白花草木樨和黄花草木樨。此方法省时高效，操作简便，在实验室条件下较短时间内能够很好完成。研究中，随机从美国国家种质库抽取的12份白花草木樨、10份黄花草木樨种质都可适用，具有很强的推广价值，有助于种子检验人员快速有效区分白花草木樨和黄花草木樨。为白花草木樨和黄花草木樨在开花前的鉴定提供高效和准确的方法。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的专用引物，其主要特点是包括有： 

白花草木樨和黄花草木樨专用引物：Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC； 

                                Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC。 

一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的试剂盒，其主要特点包括有： 

第一组：白花草木樨PCR检测体系，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC和ddH₂O； 

第二组：黄花草木樨PCR检测体系，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC和ddH₂O。 

一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的方法，其主要包括如下步骤： 

A.分别种植白花草木樨和黄花草木樨，采集叶片，提取基因组DNA备用； 

B.利用白花草木樨和黄花草木樨专用引物，对白花草木樨基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1μl，ddH₂O7.5μl和白花草木樨DNA模板(50ng/μl)0.5μl；扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环29次；(6)72℃延伸7min。 

C.利用白花草木樨和黄花草木樨专用引物，对黄花草木樨种子基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1μl，ddH₂O7.5μl和黄花草木樨DNA模板(50ng/μl)0.5μl； 扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环29次；(6)72℃延伸7min。 

D.将白花草木樨和黄花草木樨PCR产物在同一张6％变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为400V，跑胶1.5h；AgNO₃燃料染色，灯箱上照相； 

E.其电泳扩增条带大小都在150bp-200bp之间，扩增条带172bp为白花草木樨；扩增条带183bp为黄花草木樨。 

本发明的有益效果是，可以快速有效地鉴定出白花草木樨和黄花草木樨。此方法具有成本低、准确度高、稳定性好、重复性强和简单快捷等特点，能够大批量进行白花草木樨和黄花草木樨的鉴定，为保障两种牧草纯度鉴定提供可行依据。 

附图说明

图1.白花草木樨和黄花草木樨在形态学上的相似性。 

图中：(A和B)白花草木樨和黄花草木樨种子、(C和D)白花草木樨和黄花草木樨叶片、(E)白花草木樨和黄花草木樨花絮、(F和G)白花草木樨和黄花草木樨植株 

图2.两种白花草木樨和黄花草木樨(见表1)间的PCR鉴定结果。 

图中：白花草木樨(M.albus)的1-10编号表示白花草木樨10个单株，黄花草木樨(M.officinalis)的1-10编号表示黄花草木樨10个单株,“M”表示DL500的DNA Marker,“H₂O”表示以ddH₂O为模板的负对照组。 

图3.不同种质的白花草木樨和黄花草木樨间的PCR鉴定结果。 

图中：白花草木樨(M.albus)的1-12编号表示白花草木樨12个不同种质(见表2)，黄花草木樨(M.officinalis)的1-10编号表示黄花草木樨10个不同种质(见表3),“M”表示DL500的DNA Marker,“H₂O”表示以ddH₂O为模板的负对照组。 

图4.白花草木樨和黄花草木樨混合的PCR鉴定结果。 

图中：100:0、99:1、95:5、90:10、75:25、50:50、25:75、10:90、5:95、1:99和0:100表示白花草木樨和黄花草木樨基因组DNA模板混合的比例,“M”表示DL500的DNAMarker,“H₂O”表示以ddH₂O为模板的负对照组。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 

实施例1：一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的专用引物，包括有： 

白花草木樨和黄花草木樨专用引物：Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC； 

                                Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC。 

实施例2：一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的试剂盒，包括有： 

第一组：白花草木樨PCR检测体系，PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1μl和ddH₂O7.5μl； 

第二组：黄花草木樨PCR检测体系，PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1μl和ddH₂O7.5μl。 

实施例3：一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的试剂盒，包括有： 

第一组：白花草木樨PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的两倍。 

第二组：黄花草木樨PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的两倍。 

实施例4：一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的试剂盒，包括有： 

第一组：白花草木樨PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的五倍。 

第二组：黄花草木樨PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的五倍。 

实施例5：一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的试剂盒，包括有： 

第一组：白花草木樨PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的十倍。 

第二组：黄花草木樨PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的十倍。 

实施例6：一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记的方法，包括如下步骤： 

A.分别种植白花草木樨和黄花草木樨，采集叶片，提取基因组DNA备用； 

B.利用白花草木樨和黄花草木樨专用引物，对白花草木樨基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1μl，ddH₂O7.5μl和白花草木樨DNA模板(50ng/μl)0.5μl。扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环29次；(6)72℃延伸7min； 

C.利用白花草木樨和黄花草木樨专用引物，对黄花草木樨基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1 μl，ddH₂O7.5μl和黄花草木樨DNA模板(50ng/μl)0.5μl。扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环29次；(6)72℃延伸7min； 

D.将白花草木樨和黄花草木樨PCR产物在同一张6％变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为400V，跑胶1.5h；AgNO₃燃料染色，灯箱上照相； 

E.其电泳扩增条带大小都在150bp-200bp之间，扩增条带172bp为白花草木樨；扩增条带183bp为黄花草木樨。 

实施例7：鉴定两种白花草木樨和黄花草木樨间的分子标记的方法，包括如下步骤： 

从12份白花草木樨和10份黄花草木樨种质中各抽取一种种质作为参试材料(见表1)。种植材料，收集叶片，提取这两个种质各10份单粒种子的基因组DNA，共3份。将其浓度稀释为50ng/μl，用作模板，采用Melilotus-F和Melilotus-R引物进行PCR扩增。 

PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1μl，ddH₂O7.5μl和DNA模板(50ng/μl)0.5μl。扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环29次；(6)72℃延伸7min。 

将20份白花草木樨和黄花草木樨的PCR产物在同一张6％变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为400V，跑胶1.5h。然后AgNO₃燃料染色，灯箱上照相。 

其效果为： 

图2显示白花草木樨(PI662299)和黄花草木樨(PI552552)各10个单粒种子的基因组DNA为模板，其电泳扩增条带大小都在150bp-200bp之间，并且黄花草木樨(PI552552)的电泳扩增片段大于白花草木樨(PI662299)。 

表1.白花草木樨和黄花草木樨参试种质的信息描述 

实施例8：鉴定多个种质的白花草木樨和黄花草木樨间的分子标记的方法，包括如下步骤： 

选取12份白花草木樨和10份黄花草木樨作为参试材料(见表2，表3)。种植材料，采集叶片，提取白花草木樨和黄花草木樨基因组DNA，每个种质提取一份，共22份。将其浓度稀释为50ng/μl，用作模板，采用Melilotus-F和Melilotus-R引物进行PCR扩增。 

PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix10μl，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC1μl，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1μl，ddH₂O7.5μl和DNA模板(50ng/μl)0.5μl。扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环29次；(6)72℃延伸7min。 

将20份白花草木樨和黄花草木樨PCR产物在同一张6％变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为400V，跑胶1.5h。然后AgNO₃燃料染色，灯箱上照相。 

其效果为： 

图3显示以12份白花草木樨和10份黄花草木樨种质基因组DNA为模板，其电泳扩增条带大小都在150bp-200bp之间，并且12份白花草木樨种质的电泳扩增片段大于10份黄花草木樨。 

表2.12份白花草木樨参试种质的基本信息 

表3.10份黄花草木樨参试种质的基本信息 

实施例9：鉴定白花草木樨和黄花草木樨混合种子的分子标记方法，包括如下步骤： 

白花草木樨和黄花草木樨的DNA分别以100:0、99:1、98:2、95:5、90:10、75:25、50:50、25:75、10:90、5:95、2:98、1:99和0:100的比例混合作为模板，以ddH₂O为模板作对照，采用白花草木樨和黄花草木樨专用正向引物Melilotus-F和专用反向引物Melilotus-R进行PCR扩增。PCR体系和方法同实施例3。 

PCR产物经6％变性丙烯酰胺凝胶电泳检测其效果为： 

图4显示混合模板中，白花草木樨基因组DNA浓度从左到右逐渐降低，电泳条带逐渐变暗，而以黄花草木樨基因组DNA浓度从左到右逐渐升高，电泳条带也逐渐变亮，并且黄花草木樨电泳扩增片段都大于白花草木樨的电泳扩增片段。以ddH₂O为模板的负对照组没有电泳扩增条带。 

实施例10：验证一种鉴定白花草木樨和黄花草木樨的特异分子标记正确性的方法，包括如下步骤： 

为进一步验证白花草木樨和黄花草木樨所设计引物的有效性，我们对白花草木樨和黄花草木樨的专用DNA序列进行了测序。预测，白花草木樨和黄花草木樨DNA序列里都包含专用正向引物Melilotus-F和专用反向引物Melilotus-R。 

以50ng/μl白花草木樨基因组DNA为模板，采用Melilotus-F和Melilotus-R引物进行PCR扩增。PCR体系和方法同实施例6。PCR产物经2％琼脂糖中检测，回收长度约180bp的DNA片段，连接pGEM-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将含pGEM-T-Elymus质粒的大肠杆菌涂于含Amp、IPTG和X-Gal的LB培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含Amp的LB液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序，送测3个阳性克隆白花草木樨片段序列一致。结果显示，白花草木樨和黄花草木樨专用引物可以很好地扩增出白花草木樨172bp的专用基因片段。 

白花草木樨序列 

ggttcaagtc cctctatccc caaaagccca tttaactctc taatttttta tcctatatcc   60 

ctttttttaa ttttaattaa aaaaagtatt tttttttttt tttgaattta gttgacataa   120 

actcaagtaa tttcttaaaa ttaaaagggt cgggatagct caaacggtaa ag   172 

白花草木樨互补序列 

ccaagttcag ggagataggg gttttcgggt aaattgagag attaaaaaat aggatatagg   60 

gaaaaaaatt aaaattaatt tttttcataa aaaaaaaaaa aaacttaaat caactgtatt   120 

tgagttcatt aaagaatttt aattttccca gccctatcga gtttgccatt tc   172 

以50ng/μl黄花草木樨基因组DNA为模板，采用Melilotus-F和Melilotus-R引物进行PCR扩增。PCR体系和方法同实施例3。PCR产物经2％琼脂糖检测，回收长度约190bp的DNA片段，连接pGEM-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将含pGEM-T-Elymus质粒的大肠杆菌涂于含Amp、IPTG和X-Gal的LB培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含Amp的LB液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序，送测3个阳性克隆黄花草木樨片段序列一致。结果显示，白花草木樨和黄花草木樨专用引物可以很好地扩增出黄花草木樨183bp的专用基因片段。 

黄花草木樨序列 

黄花草木樨互补序列 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。