4H-1-苯并吡喃4,3-b噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用

摘要

本发明涉及糖蛋白特异性荧光检测技术，具体地说是4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。本发明还提供了应用4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼进行糖蛋白特异性荧光检测的方法，包括步骤：将电泳后含蛋白质样品的凝胶在固定液中固定；高碘酸溶液氧化；乙酸水溶液冲洗；染色；洗脱。本发明具有灵敏度高、选择性好、操作简单迅速、重现性好、线性关系好、质谱兼容性好、使用安全、成本低廉等优点，可较好地适用于高通量蛋白质组学的研究。

说明书

技术领域

本发明涉及糖蛋白特异性荧光检测技术，具体地说是4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。 

背景技术

蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也占到较高的比例。 

目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于外国的生物试剂公司，且多数产品均以高附加值的价格在市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有的生物试剂进行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。本发明开发的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物荧光染色方法灵敏度接近Pro-Q Emerald488染色法，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光检测技术，有较好的基础与临床意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。 

本发明所述的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼相关化合物是指以4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。 

4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼母核为： 

为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼进 行糖蛋白特异性荧光检测的方法包括如下步骤： 

1)将经SDS-PAGE电泳后含蛋白质样品的凝胶置于固定液中固定10～60min，弃固定液。优选的固定时间为30min，固定液可以是含有40％乙醇和10％乙酸的水溶液； 

2)在高碘酸溶液里氧化10～40min，其中高碘酸溶液为含重量体积比0.1～1％的高碘酸及按体积比0.5～5％的乙酸水溶液。然后用按体积比0.5～5％的乙酸水溶液冲洗2～5次，每次1～10min；优选的氧化时间为20min，优选的氧化液组成为含重量体积比0.5％的高碘酸及按体积比1％的乙酸水溶液； 

3)加入染色液1～40min，其中染色液为含重量体积比0.0001～0.001％的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物及按体积比0.5～5％的乙酸水溶液。优选的染色时间为10min，优选的染色液组成为含重量体积比0.0002％的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及按体积比1％的乙酸水溶液； 

4)加入洗脱液，洗脱液组成为体积比0.5～5.0％的乙酸，10～70％乙醇及0.5～2％乙醇胺水溶液，洗脱1～3次，每次1～10min。优选的洗脱时间为20min，优选的洗脱液组成为按体积比1.0％乙酸，40％乙醇及1％乙醇胺水溶液； 

5)检测，可在激光扫描仪下观察染色后的糖蛋白。 

前期研究表明该技术有如下优点： 

1)灵敏度高：4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特异性荧光检测法灵敏度同Pro-Q Emerald488灵敏度相当； 

2)操作简单迅速：操作步骤少，可在2个小时内完成； 

3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小； 

4)可逆性好：容易脱色； 

5)质谱兼容性好：由于4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼荧光检测法不影响蛋白质结构，所以可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容； 

6)使用安全：采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小； 

7)成本低。 

附图说明

图1.4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化学结构； 

图2.在一向SDS-PAGE胶上，4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法与其它染色法检测蛋白质标准品效果的比较。(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法和SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记载 操作。采用Sigma公司的8种不同标准蛋白质为样品：Transferrin(糖蛋白)，BSA(非糖蛋白)，IgG(糖蛋白)，OVA(糖蛋白)，α1-acid glycoprotein(糖蛋白)，α-casein(非糖蛋白)，β-casein(非糖蛋白)，avidin(糖蛋白)，在图中用斜体字表示糖蛋白。带1，1000ng；带2，500ng；带3，250ng；带4，125ng；带5，64ng；带6，32ng；带7，16ng；带8，8ng；带9，4ng；带10，2ng。 

图3.在一向SDS-PAGE胶上，4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法与其它染色方法检测实际样品效果的比较。(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法和SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作；采用提取的人血清总蛋白为样品。带1，5000ng；带2，2500ng；带3，1250ng；带4，625ng；带5，312ng；带6，160ng；带7，80ng；带8，40ng；带9，20ng；带10，10ng。 

图4.在一向SDS-PAGE胶上，4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法与其它染色方法针对糖蛋白染色特异性的考察。(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。用PNGase F去除标准蛋白α1-acid glycoprotein及人血清总蛋白中N-链糖。带1，人血清总蛋白；带2，去N-链糖后人血清总蛋白；带3，α1-acid glycoprotein；带4，去N-链糖后αl-acid glycoprotein；带5，PNGase F酶。 

图5.在二向SDS-PAGE胶上，4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法与其它染色方法检测实际样品效果的比较。(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。分离样品为大鼠肝脏总蛋白；IPG胶条长13cm，pH4-7；分离胶的浓度为11.4％；样品上样量为25μg/胶条。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。 

实验例1 4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特异性荧光染色 

图1是4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化学结构式。 

4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法采用如下述步骤进行： 

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于40％乙醇和10％乙酸水溶液中固定30min，弃固定液； 

2)在高碘酸溶液里氧化20min，其中高碘酸溶液为含重量体积比0.5％的高碘酸及按体积比1％的乙酸水溶液。然后用按体积比1％的乙酸水溶液冲洗3次，每次5min； 

3)加入染色液染色10min，其中染色液为含重量体积比0.0002％的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及按体积比1％的乙酸水溶液； 

4)加入含体积比1％乙酸，40％乙醇及1％乙醇胺水溶液的洗脱液，洗脱20min； 

5)检测，可在激光扫描仪下观察染色后的蛋白。 

按照上述方法分别用4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的钠盐、钾盐、铵盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能够得到类似于4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的检测结果。 

实验例2 4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法与其它染色法对标准蛋白检测效果对比。 

(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法和SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记载；采用Sigma公司的8种不同标准蛋白质为样品。带1，1000ng；带2，500ng；带3，250ng；带4，125ng；带5，64ng；带6，32ng；带7，16ng；带8，8ng；带9，4ng；带10，2ng。结果如图2所示，表明4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法检测灵敏度接近Pro-Q Emerald488糖蛋白荧光染色法。 

实验例3 4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法与其它染色法对人血清总蛋白检测效果对比。 

(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法和SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作；采用提取的人血清总蛋白为样品。带1，5000ng；带2，2500ng；带3，1250ng；带4，625ng；带5，312ng；带6，160ng；带7，80ng；带8，40ng；带9，20ng；带10，10ng。结果如图3所示，表明4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法检测灵敏度接近Pro-Q Emerald488糖蛋白荧光染色法。 

实验例4 4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法与其它染色法对大鼠肝脏总蛋白检测效果对比。 

取大鼠肝脏，加入液氮中研磨成粉末后，0.02g分装，向每管中加入500μ1裂解液，细胞超声破碎仪破碎3次(1min/次)，离心15000g/min，15min，取部分上清液用Bradford试剂盒测定蛋白浓度，其余上清液分装于Eppendorf管中，-80℃保存以备用。 

将上述大鼠肝脏经二向凝胶电泳分离后，分别采用(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法进行染色，结果如图4所示。显示4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法能检测到Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法检测到的绝大部分蛋白斑点，而且能检测到部分Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法检测不到的斑点，表明4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法是一种操作简单，而且灵敏度可同Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法媲美的方法。 

实验例5 4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法针对糖蛋白特异性检测的考察。 

用PNGase F去除标准蛋白α1-acid glycoprotein和人血清总蛋白中N-链糖。将上述蛋白经一向凝胶电泳分离后，分别采用(A)4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法和(C)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法进行染色。结果如图5所示。去除N-链糖后的标准蛋白α1-acid glycoprotein和人血清总蛋白可被SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，但几乎不能被4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法及Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法识别。进一步说明4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光染色法对糖蛋白检测具有高度特异性。 

图2-5中的参考染色方法及其相关文献 

Pro-Q Emerald488糖蛋白染色法操作方法参见文献：Courtenay Hart.，Birte Schulenberg.，Thomas H.Steinberg.，Wai-Yee Leung.，Wayne F.Patton，R.(2003)Detection of glycoproteins in polyacrylamide gels and on electroblots using Pro-Q Emerald488dye，a fluorescent periodate Schiff-base stain.Electrophoresis24，588-598。 

SYPRO Ruby荧光染色法操作方法参见文献：Malone，J.，Radabaugh，M.，Leimgruber，R.，Gerstenecker，G(2001)Practical aspects of fluorescent staining for proteomic application.Electrophoresis22，919-932。