草莓高效快速稳定基因转化方法

摘要

本发明公开了一种草莓‘红颜’高效快速稳定基因转化方法，包括菌种活化、植物材料准备、侵染、共培养、筛选培养、生根培养步骤，解决传统农杆菌介导法中农杆菌和杂菌的污染问题；解决草莓‘红颜’转化效率低的问题；解决草莓‘红颜’转基因从转基因、转基因检测、大田移栽周期长的问题，缩短周期；解决转基因检测工作量大，工作繁重的问题，简化检测方法，加快检测速度。在已经建立的‘红颜’草莓叶片再生体系的基础上，对影响根癌农杆菌转化‘红颜’草莓叶片的各项因素进行了研究，优化各种参数，简化操作过程，确定最佳转化条件。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域领域，尤其涉及一种草莓的转基因技术。

背景技术

草莓（Fragaria ananassa）是一种经济价值较高的作物，营养价值高，近年来草莓产业在我国许多地区飞速发展，已经成为有些地区农业产业化的重要组成部分。因此近年来我国科研工作者在草莓的研究中也投入了大量的精力，尤其是随着近年来分子生物学和基因工程的飞速发展，研究热点转向草莓种质资源优良基因的深度挖掘，并进行分子标记和基因表达序列的鉴定和测定。同时在抗逆性、耐贮运、风味品质等遗传改良等方面的研究结果相继有所报道，草莓育种正朝着分子育种方向发展。而草莓分子育种的过程中最重要的手段就是草莓转基因。自1990年James等成功获得了农杆菌介导的草莓遗传转化植株以来，通过近二十年的研究，草莓已经成为继核桃、苹果之后，第3个获得转基因植株的果树。迄今，各国学者利用农杆菌介导法将多种有经济价值的外源目的基因导入草莓基因组中。另一方面，对于果树来说，草莓从开花到结果周期短，一年中能够多次成花，花序多，可以四季结果，植株矮小，种植方便。因此对果树作物来说，草莓研究来作为果树研究的一种模式研究，尤其是在研究果实的生长发育方面，研究草莓的果实生长发育机理更容易，具有高效快速的优点。

目前常用的草莓基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌介导的叶盘法是草莓遗传转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中研究最为成熟最常用的一种转基因方法。虽然草莓的遗传转化技术路线成熟，但转化效率很低，获得的转基因植株太少，给转基因植株的后期鉴定工作带来了障碍，而且从转基因、转基因检测、大田移栽整个周期较长，转基因检测工作量大，工作繁重。传统的农杆菌介导法操作过程比较繁琐，在转基因的过程中容易出现许多问题，比如合适载体的选择、合适菌株的选择、杂菌的污染、农杆菌无法抑制、菌液浓度过高或者过低导致转基因不成功、侵染时间长短的控制等等，这些问题都会影响草莓转基因的效率以及速度，传统方法获得的草莓植株转基因效率不到百分之一。因此如何获得一个高效快速的草莓稳定转化体系，是草莓转基因中亟待解决的一个问题。

草莓品种‘红颜’丰产性好，品质优良，适于设施栽培，目前国内大范围的栽培此品种，也获得了较大的经济效益，但是由于此品种还存在多方面的缺陷，比如抗性差，容易感染病虫害以及果实不耐贮藏等。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种草莓‘红颜’高效快速稳定基因转化方法，不仅解决传统农杆菌介导法中农杆菌和杂菌的污染问题、草莓转化效率低的问题；而且还解决草莓转基因从转基因、转基因检测、大田移栽周期长的问题，、转基因检测工作量大，工作繁重的问题。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种草莓‘红颜’高效快速稳定基因转化的培养基，

草莓继代培养基FMS1，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，6-BA0.5mg/L，NAA0.1mg/L，且培养基的pH值为5.8； 

草莓共培养培养基FMS2，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L，且培养基的pH值为5.8；

草莓筛选培养基FMS3，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L，卡那霉素0-50mg/L，羧苄青霉素100-400 mg/L，且培养基的pH值为5.8；

草莓生根筛选培养基FMS4，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，IBA 0.1mg/L，卡那霉素0-50mg/L，羧苄青霉素100-400 mg/L，且培养基的pH值为5.8。

进一步所述草莓筛选培养基FMS3，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L，卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400 mg/L；草莓生根筛选培养基FMS4，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，IBA 0.1mg/L，卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素300 mg/L。

进一步所述各培养基每1L中MS培养基粉剂的用量为4.4g；草莓共培养培养基FMS2高压灭菌后冷却至60℃分装平板备用；草莓筛选培养基FMS3与草莓生根筛选培养基FMS4高压灭菌后冷却至60℃加入卡那霉素、羧苄青霉素分装培养瓶备用。

一种草莓‘红颜’高效快速稳定基因转化方法，该方法包括如下步骤：

1）菌种活化：将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在固体培养基上划线，28 ℃培养2天，接种到液体培养基中于28 ℃菌摇培养至OD600值0.4～0.6，将菌液离心后倒去上层清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS 液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液浓度为0.2～0.6，将重悬后的菌液放于冰箱备用；

2）植物材料准备：取在草莓继代培养基FMS1上继代草莓“红颜”组培苗的叶片，剪去剪去叶尖和叶缘，剪成0.4 cm²的叶块，

3）侵染：将菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染40～60 分钟，侵染完成后倒出菌液，将叶片在滤纸上吸干；

4）共培养：侵染后的叶片接种在草莓共培养基FMS2中，25±2  ℃培养箱中黑暗培养2～3天；

5）筛选培养：将共培养3天的草莓‘红颜’的叶片，接种在草莓筛选培养基FMS3上，在培养室中25±2 ℃，光照培养20～30天，草莓叶片边缘有愈伤组织长出，检测后保留抗性愈伤，去除非抗性愈伤，将抗性愈伤经过40～50 d的培养，分化出植株，再次检测保留整个植株叶片和叶柄都呈抗性的抗性植株；

6）生根培养：抗性植株长到2-3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基FMS4上生根，获得完整的抗性苗，检测后保留抗性苗的叶片、叶柄以及根都呈抗性的植株。

进一步所述步骤1）中，固体培养基为： LB固体培养基50 mL+壮观霉素50mg /L+利福平100mg/ L；其中LB固体培养基配方：每一升LB固体培养基中包含胰蛋白胨 10g,酵母提取物 5g,氯化钠 10g以及 Agar (琼脂) 15g；

液体培养基为：LB液体培养基50mL+壮观霉素50mg /L+利福平100mg/ L；其中LB液体培养基配方：每一升LB液体培养基中包含胰蛋白胨 10g,酵母提取物 5g,氯化钠 10g。

进一步所述步骤1）中重悬后测定菌液浓度为0.2～0.3。

所述步骤5）、步骤6）中使用体式荧光显微镜检测，观察到绿光即呈抗性。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）提高草莓转基因效率，转化率可达到30%以上；

 2）将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率；

 3）传统方法中常添加乙酰丁香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力，而侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂，能减小对草莓叶片的伤害，提高叶片培养的成活率和再生率；

4）使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作，缩短了转基因的周期。

附图说明

图1为转基因草莓‘红颜’的荧光检测图片，其中：

FA：愈伤组织荧光  FB：叶片荧光  FC：叶柄荧光  

FD：组培苗荧光    FE：花荧光    FF：果实荧光

图2为卡那霉素浓度对草莓再生率的影响；

图3为羧苄青霉素对草莓转基因的影响；

图4为不同菌液浓度和侵染时间对Egfp基因表达率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

一、材料准备

1、植物材料

草莓“红颜”组培苗，在草莓继代培养基上继代供试验用。

2、培养基配方及配制方法：

草莓‘红颜’继代培养基FMS1：

MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，6-BA0.5mg/L，NAA0.1mg/L， pH5.8，高压灭菌，备用；

草莓‘红颜’共培养培养基FMS2：

MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L， pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃左右分装平板备用；

草莓‘红颜’筛选培养基FMS3：

MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L， pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素0-50mg/L，羧苄青霉素100-400 mg/L分装培养瓶备用；

草莓‘红颜’生根筛选培养基FMS4：

MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，IBA 0.1mg/L， pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素0-50mg/L，羧苄青霉素100-400 mg/L分装培养瓶备用。

MS：MS是MS培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。本发明使用由美国sigma公司生产MS培养基粉剂（Murashige and Skoog basal salt mixture），此MS培养基粉剂要求每配制一升培养基添加4.4克粉剂，在本培养基的配制中，每配制一升培养基需要加入MS培养基粉剂4.4克。

TDZ：TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，它可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，并且可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节剂，在农业上有广泛的应用和推广价值在草莓的组织培养中也很常用，本发明中添加2.0mg/L的TDZ能够很好诱导‘红颜’叶片形成不定芽。将TDZ配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。

2,4-D：2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，对于愈伤组织的诱导和生长非常有效，是组织培养中常用的植物生长调节剂。本发明中添加0.1mg/L的2,4-D就能够很好的诱导‘红颜’不定芽形成。将2,4-D配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。

6-BA：6-BA 是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。6-BA的主要作用是促进芽的形成，本发明中用于草莓‘红颜’继代培养中。将6-BA配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。

IBA：IBA是吲哚丁酸，能够促进植物主根生长，提高发芽率，成活率。高浓度吲哚丁酸也可促进部分组培苗的增殖。本发明中IBA主要用于转基因植株的生根。配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。

卡那霉素：是生物抗生素类药剂，购买自美国sigma公司，药品为白色粉剂，配制成50mg/mL的浓度供试验用；卡那霉素是转基因中的植物筛选标记，通过在培养基中添加卡那霉素，可以剔除掉一部分非转基因的芽或者植株。转基因植株抗卡那霉素，因此可以在添加卡那霉素的培养基中成活，而普通植株不抗卡那霉素，会死亡。

Rif：利福平是生物抗生素类药剂，购买自美国sigma公司，药品为深红色粉剂，配制成25mg/mL的浓度供试验用。

壮观霉素：是生物抗生素类药剂，购买自美国sigma公司，药品为白色粉剂，配制成50mg/mL的浓度供试验用；卡那霉素是转基因中的载体的筛选标记，通过在LB培养基中添加壮观霉素，能够准确筛选单菌落,减小杂菌污染的几率。

羧苄青霉素：羧苄青霉素用于抑制转基因后期农杆菌的生长。

3、菌株和植物表达载体

本发明中使用的菌株是农杆菌菌株EHA105，该菌株是草莓转基因中常用菌株，侵染能力较强。该菌株购买于美国模式培养物集存库ATCC (American type culture collection)。

植物表达载体选用基于Gateway?技术的pK7WG2D植物表达载体，Gateway?技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，Gateway?利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。此外pK7WG2D植物表达载体携带超强表达的报告基因Egfp，便于转基因植株的检测。载体购买于Invitrogen生物技术公司。

 

二、草莓‘红颜’高效快速稳定基因转化方法

1、菌种活化

1）将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在固体培养基上划线，28 ℃培养2天；其中固体培养基为： LB固体培养基50 mL+壮观霉素50mg /L+利福平100mg/ L；其中LB固体培养基配方：每一升LB固体培养基中包含Tryptone(胰蛋白胨) 10g, Yeast Extract(酵母提取物) 5g, NaCl(氯化钠) 10g以及 Agar (琼脂) 15g。。

2）挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4（约12-16 h）；其中液体培养基为：LB液体培养基50mL+壮观霉素50mg /L+利福平100mg/ L；其中LB液体培养基配方：每一升LB液体培养基中包含Tryptone(胰蛋白胨) 10g, Yeast Extract(酵母提取物) 5g, NaCl(氯化钠) 10g。

3）常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2，此数据为最佳(这个OD600值很重要，不能低于0.2，不能高于0.3，控制在0.2～0.3之间，要接近0.2)。活化好的菌液可以用来做下一步植物材料侵染。

2、植物材料准备

取在草莓继代培养基FMS1上继代草莓“红颜”组培苗上的幼嫩、平展的30天叶龄的叶片，剪去剪去叶尖和叶缘，剪成大约0.4 cm²的叶块用于菌液侵染。尽量使得草莓叶片上四周都有伤口，这样剪容易长愈伤。

3、侵染

将悬浮的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染40 分钟，过程中每隔5分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液。

4、共培养

侵染后的叶片接种在草莓共培养基FMS2中，25±2  ℃培养箱中黑暗培养3 天。

5、筛选培养

将共培养3天的草莓‘红颜’叶片，接种在草莓筛选培养基FMS3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，光照培养。培养20天左右，草莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小下一步工作量。保留下的抗性愈伤经过约40 d左右的培养以后，可分化出抗性植株。此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉。

6、生根培养

抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基FMS4上生根，获得完整的抗性苗。此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄都发亮绿光的可以确定为转基因植株，如图1中FB,FC,FD所示，转基因植株的叶片叶柄都有荧光。

本发明还能对获得果实进行果实的试验：移栽后等草莓开花结果，开花结果后为了进一步确定转基因的稳定性，可在荧光显微镜下再次检测花和果实不同发育阶段的荧光如图1中FE,FF所示，转基因的草莓花和果实都有强荧光发出。

三、下面通过试验来进一步阐述本发明的有益效果。

1、植物筛选标记卡那霉素浓度的确定：

将外植体接种于分别含卡那霉素为0、10、15、20、25、50mg/L 的FMS2培养基上，暗培养14天，转至光下再培养20天，统计叶片褐化率，愈伤形成率和不定芽再生率确定最适的卡那霉素选择压。

草莓叶片再生对卡那霉素的浓度比较敏感，随着培养基中卡那霉素浓度的增加外植体失绿、褐化、皱褶、坏死的现象加重，外植体再生率也随之下降，白化芽增多。因此，确定合适的卡那霉素浓度是成功获得转基因植株的关键。从图2可以看出在卡那霉素浓度为20mg/L时，叶片褐化率达到65.7%，有一定数量的愈伤组织形成，但是没有不定芽生成，因此卡那霉素浓度达到20mg/L时已完全抑制了草莓不定芽的再生。可作为不定芽分化阶段的选择压（图2）。

2、抑菌抗生素（羧苄青霉素）浓度的选择  

侵染后经过共培养后的叶片分别接种于含羧苄青霉素100、200、300、400mg/L的 FMS2培养基上，经暗培养14天，筛选培养至40天后，统计叶片褐化率，愈伤形成率和不定芽再生率及农杆菌的抑菌程度确定最佳抑菌抗生素浓度。

抑菌抗生素使用的最重要的作用是抑制转基因过程中农杆菌的生长，因此，抑菌抗生素的浓度要求既能够抑制农杆菌生长，又不能对植物生长造成伤害。所以确定抑菌抗生素浓度在整个转基因实验中是非常重要的。本试验中抑菌抗生素浓度在300mg/L时能够良好抑制农杆菌生长，同时也不伤害植株的正常生长，如图3所示，培养基中没有农杆菌溢出，而且植株能够正常生长。

3、菌液浓度、侵染时间优化

将传统方法中的菌液浓度OD600=0.6，侵染时间8min，与本方法中菌液浓度OD600=0.2，浸染时间40min相比较，比较出两种不同方法的侵染效率高低、侵染以后叶片成活率以及后期农杆菌的污染程度确定最佳的菌液浓度和侵染时间。

用Egfp基因表达率来衡量侵染时间、和菌液浓度的选择。方法是将侵染转化后长出愈伤的叶片放在体式荧光显微镜下检测荧光表达，统计有非常亮的绿光和没有绿光的叶片个数。

Egfp基因表达率＝（有绿色亮光叶片数/总的外植体数）×100%

菌液浓度和侵染时间的优化是本发明中最重要的以部分，不同于传统的草莓转基因方法中的菌液浓度高时间短的侵染方法，本发明中使用低浓度菌液，长时间侵染，经过多次试验证明，低浓度长时间侵染能够大幅度提高转化效率，而且培养后期不容易产生农杆菌污染。如图4所示采用低浓度菌液长时间侵染能够显著提高Egfp基因表达率，提高转化效率。

 

实施例2：与实施例1基本相同，所不同的是：草莓‘红颜’高效快速稳定基因转化方法，具体如下：

步骤1菌种活化中的第二步，挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.6。

步骤3侵染工序：将悬浮的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染60 分钟，过程中每隔5分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液。

步骤4共培养工序：侵染后的叶片接种在草莓共培养基FMS2中，25±2  ℃培养箱中黑暗培养2 天。

步骤5筛选培养工序：

将共培养2天的草莓‘红颜’叶片，接种在草莓筛选培养基FMS3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，光照培养。培养30天，草莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小下一步工作量。保留下的抗性愈伤经过约50 d的培养以后，可分化出抗性植株。此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉。