H5亚型禽流感疫苗候选株rS-156-/170+/181-及其构建方法及应用

摘要

本发明涉及一株H5亚型禽流感疫苗候选株及其构建方法和应用。该疫苗候选株是以A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株为母本，对HA蛋白上的糖基化位点进行修饰而筛选得到，具体是缺失HA蛋白181位糖基化修饰的rS-156-/170+/181-。该疫苗候选株血清交叉中和能力好，可用于制备广谱性H5亚型AIV疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过反向遗传技术对H5亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白糖基化位点进行 修饰构建广谱性H5亚型AIV疫苗的方法，主要涉及的AIV分布于2.3.4分枝、2.3.2.1分枝 和7.2分枝中。

背景技术

H5N1亚型高致病性禽流感可导致家禽的高发病率和高病死率，在中国、越南、印度尼西 亚、印度、孟加拉国和埃及呈地方流行性(联合国粮农组织，http://www.fao.org)，给养禽业 带来了巨大的经济损失。自1997年首次报道AIV能直接感染人以来，先后有H5N1、H9N2、 H7N7和H7N9亚型AIV感染人类的报道。截止2013年10月8日为止，世界卫生组织(WHO) (http://www.who.int)报道全世界已有641例人感染H5N1亚型AIV，其中380例死亡，死亡率接 近60％。因此，高致病性H5亚型AIV既危害养禽业的发展，又危害人类健康，是非常重要的 人兽共患病。

接种疫苗是防控流感病毒(Influenza virus,IV)最有效的手段，但IV是分节段的RNA病 毒，由于RNA聚合酶的复制保真性较低，故病毒基因组变异较快，需要使用匹配流行株的疫 苗进行疫病防控。当前，在我国普遍使用的多为反向遗传技术构建的全病毒灭活疫苗，如Re-4、 Re-5和Re-6。利用反向遗传技术可快速替换当前流行株表面糖蛋白构建出疫苗候选株，进行 疫苗株的升级换代以应付禽流感疫情。由于反向遗传技术构建的疫苗大多以PR8为骨架，因 此在大流行时期可以用MDCK细胞大量生产疫苗株病毒，以缓解鸡胚供应的压力。目前我国 家禽中流行的H5N1亚型AIV主要分布于2.3分枝中的2.3.4和2.3.2分枝及7分枝中的7.2分枝，不 同分枝病毒间交叉保护性较差。而且这些优势流行病毒又进一步进化出第四级分枝，抗原性 和免疫原性发生进一步变化，现有疫苗不能提供完全保护。显然，依靠匹配流行株的疫苗研 制速度永远跟不上病毒变异的速度。因此，广谱性疫苗因其可以提供交叉保护性而受到广泛 关注。2008年，Chen等基于一段HA保守序列制备了一种DNA疫苗，攻毒保护试验表明，该 疫苗可对1分枝、2.2分枝及2.1分枝感染小鼠提供较好的保护。2012年，Janulikova等基于HA2 蛋白的胞外区和融合肽段制备了偶联多肽苗，此疫苗可在小鼠上抵挡H3或H7亚型流感病毒的 攻击。由此可见，多数研究者都致力于挖掘通用的抗原表位，并将其制备成疫苗。通过文献 调查可以发现，糖基化修饰会影响AIV的抗原性和免疫原性。Wang等(2009)以去糖基化 修饰的HA蛋白作为免疫原，其攻毒保护性能明显优于野生型HA蛋白，且其血清显示较强的 交叉中和能力。

发明内容

高致病性H5亚型AIV给养禽业带来了巨大的危害，病毒变异较频繁且基因型较多，不 同基因型间交叉保护性较差。因此，急需研制交叉保护性较好的新型广谱性疫苗来应对H5 亚型禽流感疫情。

本发明以2.3.4分枝的A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株为母本，母本病毒的糖基化位 点为S-156-/170+/181+，主要通过增加HA蛋白156位糖基化修饰，缺失其HA蛋白170和 181位糖基化修饰，形成不同组合模式，利用反向遗传技术拯救出6株H5亚型AIV疫苗候 选株。病毒灭活后制成油佐剂疫苗免疫SPF鸡制备血清，评价其对不同分枝H5亚型AIV交 叉中和性，筛选出交叉中和能力好的疫苗候选株。制备灭活疫苗免疫动物，通过攻毒保护试 验测定其免疫保护作用。

本发明所述的一株H5亚型禽流感疫苗候选株，是rS-156-/170+/181-，它的结构是以 A/mallard/Huadong/S/2005株为母本骨架，缺失HA蛋白181位糖基化修饰。

所述H5亚型禽流感疫苗候选株rS-156-/170+/181-的构建方法，是以 A/mallard/Huadong/S/2005株为母本骨架，缺失HA蛋白181位糖基化修饰而获得。

本发明还公开了所述H5亚型禽流感疫苗候选株rS-156-/170+/181-在制备广谱性H5亚型 AIV疫苗中的应用。

以对鸡和鸭均为高致病性的H5N1亚型AIV 2.3.4分枝中代表病毒SY株作为母本，通过 点突变技术和反向遗传技术构建HA蛋白不同位点糖基化修饰缺失组合的重组AIV [156+/170-/181-，156-/170+/181-，156-/170-/181+，156+/170+/181-，156+/170-/181+， 156+/170+/181+和156-/170+/181+(WT)]。以母本病毒作为对照，将各重组病毒灭活后免疫SPF 鸡制备血清，测定各血清对母本病毒及不同分枝H5N1亚型AIV的血凝抑制及中和抗体效价， 并以其血凝抑制及中和抗体效价高的重组AIV作为灭活疫苗，通过攻毒保护试验测定其免疫 保护作用，筛选出一株对H5N1亚型不同分枝的AIV具有广泛的交叉反应性的重组病毒 rS-156-/170+/181-，该疫苗可对多种H5N1亚型AIV攻毒的免疫鸡提供保护和抑制机体排毒， 克服临床上现有疫苗只能保护单一基因型及交叉保护差的问题，为H5N1亚型高致病性AIV 的防制提供新的方法。

附图说明

图1分段PCR扩增结果

M，Marker；1，156突变前段；2，156突变后段；3，170突变前段；4，170突变后段；5，181突变 前段；6，181突变后段。

图2全长PCR扩增结果

M，Marker；1，156突变全长；2，170突变全长；3，181突变全长。

具体实施方式

本发明中所涉及的生物材料如下：

A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株(Tang Y,Wu P,Peng D,Wang X,Wan H,Zhang P, Long J,Zhang W,Li Y,Wang W,Zhang X,Liu X.Characterization of duck H5N1 influenza  viruses with differing pathogenicity in mallard(Anas platyrhynchos)ducks.Avian Pathol. 2009 Dec；38(6):457-67.Yanfang Li,Sujuan Chen,Xiaojian Zhang,Qiang Fu,Zhiye Zhang, Shaohua Shi,Yinbiao Zhu,Min Gu,Daxin Peng*,Xiufan Liu*.A 20-amino-acid deletion in  the neuraminidase stalk and a five-amino-acid deletion in the NS1 protein both contribute to  the pathogenicity of H5N1 avian influenza.Plos one.2014)。

本发明的具体技术方案如下：

1.点突变和疫苗株的拯救

1.1 引物设计

根据A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株病毒HA序列(Genebank序列号：EU195392.1， Tang,Y.,Wu,P.,Sun,Q.,Peng,D.,Zhang,W.,Li,Y.,Wang,W.,Long,J.,Zhang,P.,Liu,X.,2008, Role of amino acid residues at positions 322 and 329 of hemagglutinin in virulence of H5N1 avian  influenza virus.Chinese journal of virology 24,340-344.)设计点突变引物(表1)，共涉及3个 突变位点：TPS 156 NSS，NNT 170 NNA和NNT 181 NNA。

表1引物设计

引物名称 引物序列(5’-3’) HA-1^bTATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGTT(SEQ ID NO.1) HA-2^bATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG(SEQ ID NO.2) 156-F CCTTACCAGGGAAACTCCTCCTTTTTCAC^a(SEQ ID NO.3) 156-R GTGAAAAAGGAGGAGTTTCCCTGGTAAGG^a(SEQ ID NO.4) 170-F AAAAGAACAATGCATACCCAACAATAAAGAGAAGC^a(SEQ ID NO.5) 170-R TTGTTGGGTATGCATTGTTCTTTTTGATAAGCCATA^a(SEQ ID NO.6) 181-F CAATAAAGAGAAGCTACAATAATGCCAACCAGGAAG^a(SEQ ID NO.7) 181-R CTTCCTGGTTGGCATTATTGTAGCTTCTCTTTATTG^a(SEQ ID NO.8)

^a突变碱基用下划线标出。^bSY株HA基因全长PCR扩增引物上游和下游。

1.2 Overlapping-PCR定点突变

以SY株全病毒核酸(Tang,Y.,Wu,P.,Sun,Q.,Peng,D.,Zhang,W.,Li,Y.,Wang,W.,Long, J.,Zhang,P.,Liu,X.,2008,Role of amino acid residues at positions 322 and 329 of hemagglutinin  in virulence of H5N1 avian influenza virus.Chinese journal of virology 24,340-344.)为模板，全 长引物(HA-1和HA-2)反转录PCR(RT-PCR)扩增HA基因，采用25μL体系：10×Buffer 2.5μL，Mg²⁺1.5μL，dNTP 0.2μL，引物HA-1和156-R、156-F和HA-2、HA-1和170-R、170-F 和HA-2、HA-1和181-R、181-F和HA-2各0.5μL(浓度均为25μmol/μL)，TaqDNA聚合酶 (1U/μL)1.5μL，DNA模板2μL，用无菌的超纯水补齐到25μL。反应程序：94℃预变性 4min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸7min。将PCR 产物加上样缓冲液后加到1％的琼脂糖凝胶中，以1000bp marker为标准参照，用80伏电压 跑1h后，染色后观察结果，SY株HA基因片段全长为1704bp(碱基)。将PCR产物条带切 下后，用凝胶纯化回收试剂盒回收PCR产物，测定浓度，并将其克隆至vector(购 自Invitrogen公司)，连接产物转化感受态大肠杆菌，挑斑小提质粒，质粒送金斯瑞生物工程 有限公司测序验证，阳性质粒命名为pCR2.1-SY-HA。

以pCR2.1-SY-HA为模板，全长引物与突变引物组合后分别PCR扩增HA的上下两段， 其中156突变扩增出480bp和1320bp的条带，170突变扩增出568bp和1260bp的条带， 181突变扩增出600bp和1200bp的条带(图1)。

经凝胶纯化回收试剂盒回收PCR产物，测定浓度，将前后两段按1:1混合后作为模板PCR 扩增HA全长基因。所有样品均扩增出1800bp的条带(图2)。

将PCR产物条带切下后，用凝胶纯化回收试剂盒回收PCR产物，测定浓度，并将其克 隆至vector，连接产物转化感受态大肠杆菌，挑斑小提质粒，质粒送金斯瑞生物工 程有限公司测序验证，阳性质粒分别命名为pCR2.1-156+/170-/181-、pCR2.1-156-/170+/181-、 pCR2.1-156-/170-/181+、pCR2.1-156+/170+/181-、pCR2.1-156+/170-/181+、 pCR2.1-156-/170+/181+、pCR2.1-156+/170+/181+，-20℃保存备用。

1.3 表达质粒构建

用限制性内切酶Bsa I(购自NEB公司)将HA片段从阳性质粒(pCR2.1-156+/170-/181-、 pCR2.1-156-/170+/181-、pCR2.1-156-/170-/181+、pCR2.1-156+/170+/181-、 pCR2.1-156+/170-/181+、pCR2.1-156-/170+/181+、pCR2.1-156+/170+/181+)上消化下来，与 BsmB I(购自NEB公司)消化的pHW2000(Hoffmann,E.,Neumann,G.,Kawaoka,Y.,Hobom, G.,Webster,R.G.,2000,A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight  plasmids.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6108-6113.)连接，连接产物转化DH5α感受态细胞 并在氨苄平板上筛选重组子。鉴定正确的重组质粒分别命名为pHW-156+/170-/181-、 pHW-156-/170+/181-、pHW-156-/170-/181+、pHW-156+/170+/181-、pHW-156+/170-/181+、 pHW-156-/170+/181+、pHW-156+/170+/181+，经扩大培养后用QIAGEN质粒纯化试剂盒提取 高纯度阳性重组质粒，与含S株其他7个基因的转录/表达质粒(pHW251-PB2,pHW252-PB1, pHW253-PA,pHW254-HA,pHW255-NP,pHW256-NA,pHW257-M,and pHW258-NS)(Tang,Y., Wu,P.,Sun,Q.,Peng,D.,Zhang,W.,Li,Y.,Wang,W.,Long,J.,Zhang,P.,Liu,X.,2008,Role of  amino acid residues at positions 322 and 329 of hemagglutinin in virulence of H5N1 avian  influenza virus.Chinese journal of virology 24,340-344.)一起用于转染。测定质粒各自的浓度， 并将其都调整为200ng/μL以用于转染。

1.4 病毒拯救

病毒拯救参照Hoffmann等方法进行。转染前一天，取等量的293T和MDCK细胞混合 后加入6孔细胞培养板，细胞覆盖面积达80％时进行转染。取8种质粒各1μL加入到50μL 无抗生素无血清DMEM培养基中并轻轻混匀。使用前轻轻混匀Lipofectamine^TM 2000(购自 Invitrogen公司)，取10μL稀释到50μL无抗生素无血清DMEM培养基中并轻轻混匀。将质 粒稀释液与Lipofectamine^TM 2000(购自Invitrogen公司)稀释液混合，并轻轻混匀，在室温 下作用20min。作用完毕，将混合液逐滴加入到细胞表面，转染后72h收集细胞上清，接种 10日龄SPF鸡胚，每日观察鸡胚死亡情况，收集鸡胚尿囊液进行血凝试验，阳性鸡胚尿囊液 置于-70℃冰箱中保存备用。反向遗传拯救的重组病毒分别命名为rS-156-/170+/181+(wild-type, WT)、rS-156-/170-/181+、rS-156-/170+/181-、rS-156+/170+/181+、rS-156+/170-/181+、 rS-156+/170+/181-、rS-156+/170-/181-。

2.病毒灭活及血清制备

取出重组病毒(rS-156-/170+/181+(wild-type,WT)、rS-156-/170-/181+、rS-156-/170+/181-、 rS-156+/170+/181+、rS-156+/170-/181+、rS-156+/170+/181-、rS-156+/170-/181-)尿囊液，先 以8000rpm离心5min后取上清测定各病毒血凝效价(HA)，再以43:7的比例在尿囊液中加 入1/50预稀释的甲醛溶液，此过程需逐滴加入灭活液，并且不断混匀防止灭活不完全，灭活 液加完后将病毒移至4℃放置，每隔两小时混匀一次，在4℃灭活总时间超过24h。取出灭活 的病毒尿囊液，测定其血凝效价(>2⁴才满足要求)。

将灭活的病毒尿囊液与弗氏完全佐剂1:1混合后充分乳化制成疫苗，取0.2mL疫苗注射 4w SPF鸡，每种灭活疫苗注射4只SPF鸡。在免疫后14d加强免疫一次，二免后21d采集 鸡血，分离血清并测定其效价。

3.血清交叉反应性

交叉血凝抑制试验：测定各病毒尿囊液HA效价，将病毒HA价调至2²(4单位病毒)， 以PBS将各血清倍比稀释，再加入已调整好的4单位病毒，37℃条件下作用15min，作用完 毕加入1％鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用15min后观察结果。交叉血凝抑制试验测定 不同分枝的H5亚型AIV与重组病毒抗血清的反应性。

交叉中和试验：在CEF细胞上测定不同分枝病毒组织细胞半数感染量(TCID₅₀)，中和 试验前一天将CEF细胞铺到96孔板中，待细胞铺满整个孔底方可使用，使用前将细胞以无 菌PBS清洗细胞两次。以维持液将各突变病毒抗血清在96孔板中作倍比稀释，并与100个 TCID50的病毒在37℃条件下作用10min，作用完毕将中和产物转移到CEF细胞上，细胞继 续在37℃ 5％ CO₂条件下培养4d，而后统计各血清能中和病毒的最大稀释度为中和效价， 取每组4份血清中和效价的平均值为最后结果。

根据我国目前禽流感流行情况，我们选取了4株H5亚型禽流感病毒进行交叉反应性试 验。病毒SY为野生骨架病毒且属于2.3.4分枝(Tang Y,Wu P,Peng D,Wang X,Wan H,Zhang  P,Long J,Zhang W,Li Y,Wang W,Zhang X,Liu X.Characterization of duck H5N1 influenza  viruses with differing pathogenicity in mallard(Anas platyrhynchos)ducks.Avian Pathol.2009 Dec；38(6):457-67.)，DT属于7.2分枝(Zhang,W.,Xue,T.,Wu,X.,Zhang,P.,Zhao,G.,Peng,D., Hu,S.,Wang,X.,Liu,X.,Liu,W.,2011,Increase in viral yield in eggs and MDCK cells of  reassortant H5N1 vaccine candidate viruses caused by insertion of 38 amino acids into the NA stalk. Vaccine 29,8032-8041.)，WXD属于2.3.2.1分枝，ZJC为2.3.4.6分枝(Gu,M.,Zhao,G.,Zhao, K.,Zhong,L.,Huang,J.,Wan,H.,Wang,X.,Liu,W.,Liu,H.,Peng,D.,Liu,X.,2013,Novel  variants of clade 2.3.4 highly pathogenic avian influenza A(H5N1)viruses,China.Emerg.Infect. Dis.19,2021-2024.)。从结果中(表2)我们可以看出，野生型病毒rS-156-/170+/181+免疫血 清对SY株有较高的中和效价和血凝抑制效价，对其它分枝病毒的中和效价和血凝抑制效价 较低。而重组病毒rS-156-/170+/181-免疫血清对SY株中和效价和血凝抑制效价与SY免疫血 清相似，而对其它分枝病毒中和效价和血凝抑制效价均显著高于SY免疫血清。因此，选取 重组病毒rS-156-/170+/181-作为疫苗候选株，并以野生型病毒rS-156-/170+/181+为对照，进 行免疫保护性试验。

表2候选株血清交叉反应性

^a病毒WXD属于2.3.2.1分枝，SY为野生骨架病毒且属于2.3.4分枝，ZJC为2.3.4分枝变异病毒，DT属 于7.2分枝。

4.免疫保护性试验

4周龄SPF鸡随机分成3大组，每大组30只鸡，其中一组用于免疫野生型病毒 rS-156-/170+/181+，另一组用于免疫候选疫苗株rS-156-/170+/181-，还有一组为PBS免疫对 照组。接种途径均为颈部皮下注射，剂量为0.2mL/只，在免疫后21d采集血清，并用血凝 抑制试验(HI)测定其抗体效价，同时用野生型的母本毒株SY和7.2分枝AIV DT株攻毒， 攻毒剂量为10⁶EID₅₀/只鸡，攻毒途径为滴鼻点眼，并设空白对照组。攻毒后，全部试验鸡连 续观察14d，并记录其发病和死亡情况。分别在攻毒后的1、3、5和7d采集喉拭子和泄殖 腔拭子，以鸡胚滴定其中病毒含量，统计排毒情况。所有攻毒对照组SPF鸡在攻毒后均出现 典型的禽流感症状，且全部死亡。SY和DT株流感病毒攻毒后，结果如表3，两免疫组均能 有较好的保护(100％)，而且相对于野生型rS-156-/170+/181+免疫组来说，rS-156-/170+/181- 免疫组能更好地抑制排毒，特别是在DT株流感病毒攻毒组中，两免疫组在攻毒后7d泄殖腔 排毒率上存在显著性差异(P<0.05)。

表3 SPF鸡免疫保护试验

注：O，喉拭子；C，泄殖腔拭子。

^a差异显著,P<0.05。