以生物柴油副产物粗甘油为碳源的微生物油脂制备方法

摘要

本发明提供一种以生物柴油副产物粗甘油为碳源的微生物油脂制备方法，属于微生物油脂制备技术领域。该方法利用生物柴油副产物粗甘油为碳源，粘红酵母32489为产油微生物制备微生物油脂，解决了葡萄糖或纯甘油（AR）作为碳源制备微生物油脂成本较高的问题，也使粗甘油得到有效利用；生成的微生物油脂和植物油的成分几乎一致。与植物油相比，微生物油脂具有制备周期短，不需占用耕地等优势，是制备生物柴油的非粮生物质廉价原料，可降低生物柴油制备成本，具有较大的应用前景。

说明书

 

技术领域

本发明涉及微生物油脂制备技术领域，特别是指一种以生物柴油副产物粗甘油为碳源的微生物油脂制备方法。

 

背景技术

近年来，人类所需的油脂总量仅仅靠植物油脂和动物油脂来提供已经出现了很大的问题，寻找其它油脂原料来生产人们所需油脂变得越来越重要。另外，伴随着石油价格日益攀升并且不可再生的资源石油的日渐枯竭，利用其它可再生资源生产能源就成了必然趋势。微生物油脂是制取生物柴油的优质原料，微生物油脂还含有对人体健康有利的多种不饱和脂肪酸，因此，在改善人类人体健康程度和医疗保健方面具有重要的开发和利用价值。目前工业化生产生物柴油的原料主要以植物油为主，但原料成本占到总成本的70%-85%，经济可行性差。那么，寻求能够低成本替代现行生物柴油的生产原料就变成了一个迫切需要解决的问题。产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、开发潜力大等优点，因此微生物油脂具有良好的发展前景，可能在未来生物柴油产业中发挥重要的作用。微生物油脂，能被快速的合成和积累，其脂肪酸成分和植物油很相似。相比于植物油，微生物产油脂具有生命周期短，不需要占用耕地等优点。在微生物转化期间，微生物需要大量的碳源，发明专利“一种含油微生物耦合培养生产油脂的方法”（CN103045663A），利用粘红酵母或者小球藻为产油微生物，葡萄糖作为碳源培养基，制备微生物油脂。此种方法的瓶颈是葡萄糖的价格昂贵限制了其工业化，所以可再生的碳源和廉价的碳源越来越受到青睐。粗甘油是生物柴油主要的副产物，每生产1t生物柴油会产生0.1t粗甘油，随着世界范围内生物柴油产量的增加，粗甘油的产量会越来越大很大，发明专利“一种生物柴油副产物粗甘油精制的方法”（CN103664523A），将粗甘油经过皂化，酸化，吸附后得到精制甘油。此种方法的瓶颈是，精制成本是非常昂贵的。本发明为解决上述问题，利用生物柴油副产物粗甘油为碳源，粘红酵母32489为产油微生物制备微生物油脂，解决了葡萄糖和精制甘油作为碳源制备微生物油脂成本昂贵的问题，也解决了目前粗甘油的利用和处理处置问题；生成的微生物油脂和植物油的成分几乎一致，相比于植物油具有制备周期短，不需占用耕地等优势，是制备生物柴油的非食物原材料的良好渠道，解决了生物柴油制备原材料成本高的问题，是一种非常有前景的粗甘油利用技术。

 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以生物柴油副产物粗甘油为碳源的微生物油脂制备方法，解决了葡萄糖和精制甘油作为碳源制备微生物油脂成本昂贵的问题，也解决了目前粗甘油的利用和处理处置问题，同时解决了制备生物柴油原材料昂贵的问题。

该方法据具体步骤为：

（1）将活化好的粘红酵母放入灭菌后的葡萄糖接种培养基中，在摇床中培养24小时；

（2）将步骤（1）中培养好的接种液按5%-10%的比例加入到灭菌后的粗甘油发酵培养基中，在摇床中培养6-12天；

（3）将步骤（2）中发酵后得到的粘红酵母放在离心机中，在4000r/min的转速下离心30min，取下层细菌放入烘箱中，在45-65℃的温度下烘干至恒重；

（4）将步骤（3）中得到的烘干后的粘红酵母放入离心管中，加入一定量的盐酸，置于振荡器混匀后在室温放置一段时间，再在沸水浴中煮一定时间，然后放入-20℃的冰箱速冷将粘红酵母菌体破碎；

（5）将步骤（4）中破碎后的菌液中加入2倍体积的氯仿-甲醇溶液，震荡混匀，放入离心机中在4000r/min的转速下离心25-30min，取下层氯仿溶液转移至蒸馏瓶中，用旋转蒸发器挥发出氯仿层，得到最终产品微生物油脂。

其中，上述粘红酵母为粘红酵母32489，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

步骤（1）中葡萄糖接种培养基的组成为葡萄糖20g/L，NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L；培养基的的pH为5.8-6.0，葡萄糖接种培养基灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min，摇床培养时，摇床的转速为180-220r/min。

步骤（2）中粗甘油发酵培养基的组成为粗甘油20-100g/L，NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L，培养基的pH为5.8-6.0，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min，摇床转速为180r-220r/min；粗甘油是以NaOH、对甲苯磺酸或者离子交换树脂作为催化剂，餐饮废油和混合甲乙醇制备生物柴油后剩余的混合液，混合液成分为：甘油25-45%，甲醇15-25%，乙醇5-15%，水20-45%，脂肪酸钠0-2%，脂肪酸酯0-2%，NaCl 0-2%。

步骤（4）中每克干菌体加入4mol/L的盐酸6-10ml，室温放置时间为20-30min，在沸水浴中煮3-5min，放入冰箱速冷30-40min。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

上述方案中，利用生物柴油副产物粗甘油为碳源，粘红酵母32489为产油微生物制备微生物油脂，解决了葡萄糖或纯甘油（AR）作为碳源制备微生物油脂时成本较高的问题，也使粗甘油得到有效利用；生成的微生物油脂和植物油的成分几乎一致。与植物油相比，微生物油脂具有制备周期短，不需占用耕地等优势，是制备生物柴油的非粮生物质廉价原料，可降低生物柴油制备成本，具有较大的应用前景。

 

附图说明

图1为本发明的以生物柴油副产物粗甘油为碳源的微生物油脂制备方法所制得的微生物油脂的主要成分GC分析。

 

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明针对现有的葡萄糖和精制甘油作为碳源制备微生物油脂成本昂贵的问题，提供一种以生物柴油副产物粗甘油为碳源的微生物油脂制备方法。下面是利用生物柴油副产物粗甘油为碳源，粘红酵母32489为产油微生物制备微生物油脂的实施例以及利用其作为原材料制备生物柴油的实施例，通过实施例进一步描述本发明，进一步了解到不同工艺条件下制备的微生物油脂及生物柴油的效果。

种子接种液制备：

将活化好的粘红酵母32489放入灭菌后的葡萄糖接种培养基中培养24小时，pH为6.0，灭菌温度121℃，灭菌时间30分钟，摇床转速为180r/min。葡萄糖培养基组成：葡萄糖20g/L，NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L。（该种子液用于以下所有的对比例和实施例）

微生物产油脂实施例

对比例1：

将上述接种液按10%的比例加入到灭菌后的葡萄糖培养基中培养7天，培养基pH为6.0，灭菌温度121℃，灭菌时间30分钟，摇床转速为200r/min, 葡萄糖培养基组成：葡萄糖20g/L，NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L。取发酵后得到的粘红酵母32489 5ml放入离心机中，4000r/min下离心30分钟，取下层细菌放入烘箱中，55℃烘干至恒重。此时测得细胞的干重为18.5g/L。烘干后向干菌体加入4mol/L的盐酸6ml，放置振荡器混匀，室温放置30分钟后，沸水浴中煮3分钟，然后放入-20℃的冰箱速冷30分钟，将菌体破碎。将破碎后的菌液加入2倍体积的氯仿-甲醇溶液，震荡混匀，放入离心机中4000r/min离心25分钟，取下层氯仿溶液转移至蒸馏瓶中，用旋转蒸发器挥发出去氯仿层，得到微生物油脂产品。此时测得细胞干重中的油脂含量为42.3%。

对比例2：

将上述接种液按10%的比例加入到灭菌后的甘油培养基中培养7天，培养基pH为6.0，灭菌温度121℃，灭菌时间30分钟，摇床转速为200r/min, 甘油培养基组成：纯甘油(AR)20.44g/L（保证培养基中的含碳量与20g/L的葡萄糖一致），NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L。其余实验条件和步骤同对比例1。此时测得细胞的干重为17.2g/L，细胞干重中的油脂含量为39.7%。

实施例1

将上述接种液按10%的比例加入到灭菌后的培养基中培养7天，培养基pH为6.0，灭菌温度121℃，灭菌时间30分钟，摇床转速为200r/min, 粗甘油成分组成：甘油27%，甲醇18%，乙醇10%，水45%。培养基组成：粗甘油27g/L（保证培养基中的含碳量与20g/L的葡萄糖一致），NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L。其余实验条件和步骤同对比例1。此时测得细胞的干重为20.5g/L，细胞干重中的油脂含量为47.8%。

从对比例1、对比例2和实施例1可以看出，以粗甘油为碳源制备微生物油脂的细胞干重和油脂产率都高于以葡萄糖和纯甘油(AR)为碳源时的细胞干重和油脂产率，说明粗甘油完全可以替代葡萄糖和纯甘油(AR)为碳源来制备微生物油脂，且能够获得较高的油脂产率。

实施例2

将接种液按5%的比例加入到灭菌后的培养基中培养6天，pH为5.8，灭菌温度121℃，灭菌时间30分钟，摇床转速为180r/min, 粗甘油成分：甘油25%，甲醇25%，乙醇15%，水30%，脂肪酸钠2%，脂肪酸酯1%，NaCl 2%。粗甘油培养基组成：粗甘油100g/L，NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L。取发酵后得到的粘红酵母32489 5ml放在离心机中，4000r/min离心30分钟，取下层细菌放入烘箱中，65℃烘干至恒重。此时测得细胞的干重为16.5g/L。将烘干后的粘红酵母32489放入离心管中，向干菌体加入4mol/L的盐酸10ml，放置振荡器混匀，室温放置30分钟后，沸水浴中煮5分钟，然后放入-20℃的冰箱速冷40分钟，将菌体破碎。将破碎后的菌液加入2倍体积的氯仿-甲醇溶液，震荡混匀，放入离心机中4000r/min离心25分钟，取下层氯仿溶液转移至蒸馏瓶中，用旋转蒸发器挥发出去氯仿层，得到微生物油脂产品。此时测得细胞干重中的油脂含量为32.4%。

实施例3

将接种液按10%的比例加入到灭菌后的培养基中培养10天，pH为6.0，灭菌温度121℃，灭菌时间30分钟，摇床转速为220r/min, 粗甘油成分：甘油45%，甲醇15%，乙醇5%，水31%，脂肪酸钠1%，脂肪酸酯2%，NaCl 1%。粗甘油培养基组成：粗甘油20g/L，NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L。取发酵后得到的粘红酵母32489 5ml放在离心机中，4000r/min离心30分钟，取下层细菌放入烘箱中，45℃烘干至恒重。此时测得细胞的干重为13.5g/L。将烘干后的粘红酵母32489放入离心管中，向干菌体加入4mol/L的盐酸10ml，放置振荡器混匀，室温放置30分钟后，沸水浴中煮4分钟，然后放入-20℃的冰箱速冷30分钟，将菌体破碎。将破碎后的菌液加入2倍体积的氯仿-甲醇溶液，震荡混匀，放入离心机中4000r/min离心25分钟，取下层氯仿溶液转移至蒸馏瓶中，用旋转蒸发器挥发出去氯仿层，得到微生物油脂产品。此时测得细胞干重中的油脂含量为36.7%。

实施例4 

最佳工艺条件下制备微生物油脂进而制备生物柴油的实施例

将接种液按10%的比例加入到灭菌后的培养基中培养8天，pH为5.9，灭菌温度121℃，灭菌时间30分钟，摇床转速为200r/min, 粗甘油成分：甘油40%，甲醇22%，乙醇13%，水20%，脂肪酸钠2%，脂肪酸酯2%，NaCl 1%。粗甘油培养基组成：粗甘油40g/L，NH₄SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，酵母浸粉0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L。取发酵后得到的粘红酵母32489 5ml放在离心机中，4000r/min离心30分钟，取下层细菌放入烘箱中，50℃烘干至恒重。测得最佳条件下的细胞的干重为24.5g/L。将烘干后的粘红酵母32489放入离心管中，向干菌体加入4mol/L的盐酸10ml，放置振荡器混匀，室温放置30分钟后，沸水浴中煮4分钟，然后放入-20℃的冰箱速冷30分钟，将菌体破碎。将破碎后的菌液加入2倍体积的氯仿-甲醇溶液，震荡混匀，放入离心机中4000r/min离心25分钟，取下层氯仿溶液转移至蒸馏瓶中，用旋转蒸发器挥发出去氯仿层，得到微生物油脂产品。此时测得最佳条件下细胞干重中的油脂含量为52.6%。对此油脂进行GC成分分析，如图1所示，其主要成分为C16:0（棕榈酸）、C18:0（硬脂酸）、C18:1（油酸）和C18:2（亚油酸），其主要成分和植物油，菜籽油基本相同，可作为生物柴油的原材料。

取100g 以上微生物油脂置于烧瓶中、加入微生物油脂质量1%的NaOH作为催化剂、加入一定量的混合甲乙醇作为酯交换剂，醇油的摩尔比为10:1，甲乙醇的摩尔比为7:3。将混合液进行搅拌并加热，搅拌速度为120r/min，反应温度为85℃，反应时间为1小时，使其发生酯化和酯交换反应，得到生物柴油及其副产物甘油等混合物。将得到的生物柴油及其副产物粗甘油放入分液漏斗分层回收副产物粗甘油，上层经干燥脱水得到淡黄色、澄清、透明的液体产品，即生物柴油。此条件下生物柴油的产率为96.5%。

通过以上实施例可以发现，以粗甘油为碳源制备微生物油脂，能获得较高的油脂产率，所制备的微生物油脂和植物油的成分几乎一致，是制备生物柴油的非食物原材料的良好渠道，解决了生物柴油制备原材料成本高的问题，是一种非常有前景的粗甘油利用技术。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。