聚天冬氨酸衍生物,其制备,纳米结构,排铅活性和应用

摘要

聚天冬氨酸衍生物,其制备,纳米结构,排铅活性和应用。本发明公开了式Ia-b代表的聚天冬氨酸衍生物，式中AA为L-Met，L-Cys残基，公开了它们的制备方法，公开了它们的纳米结构，公开了它们与Pb(II)络合的逐级稳定常数，公开了它们在小鼠醋酸铅中毒模型上的排铅作用，进一步公开了它们在小鼠体内并无毒性作用。因而本发明阐明了聚天冬氨酸衍生物Ia-b作为铅驱排剂的临床应用前景。。

说明书

发明领域

本发明涉及Ia-b代表的聚天冬氨酸衍生物，式中AA为L-Met，L-Cys残基，涉及它们的制备方法，涉及它们的纳米结构，涉及它们与Pb(II)络合的逐级稳定常数，涉及它们在小鼠醋酸铅中毒模型上的排铅作用，进一步涉及了它们在小鼠体内并无毒性作用。因而本发明阐明了聚天冬氨酸衍生物Ia-b作为铅驱排剂的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。 

背景技术

铅作为人类最早使用的重金属之一，给我们生活带来便宜的同时，也给我们带来重金属污染的问题。铅经过呼吸系统，消化系统及皮肤进入我们的血液循环，从而对我们的组织器官产生毒副作用。临床上经常使用的驱铅治疗药物(青霉胺等)或由于金属离子络合选择性差，或由于对器官毒副作用，或会排出人体必需金属元素，不能用以预防铅中毒。寻找安全，可口服，毒副作用小，铅螯合能力强，不影响人体必需金属元素的铅中毒解毒剂有明确的应用前景。 

聚天冬氨酸衍生物和羟基化合物具有潜在的驱排重金属的作用，不容易积蓄。聚天冬氨酸是一类具有优良生物降解性的高分子，在人体内能生物降解成内源性物质天冬氨酸，不产生毒副作用。发明人的前期将聚天冬氨酸和L-Met，L-Cys形成缀合物，发现其对各个器官均有一定的排铅能力，但是对血铅没有驱排效果。发明人前期认识到，用2-氨基-1，3-丙二醇对铅中毒小鼠进行治疗，其对血铅表现出确切的驱排效果。按照这些认识，发明人以L-Met和L-Cys为连接臂将2-氨基-1，3-丙二醇与聚天冬氨酸缀合，使排器官铅和血铅的活性更优异。发明人还认识到，以L-Met和L-Cys为连接臂将2-氨基-1，3-丙二醇与聚天冬氨酸缀合不会影响人体必需的微量元素。发明人进一步认识到，以L-Met和L-Cys为连接臂将2-氨基-1，3-丙二醇与聚天冬氨酸缀合可以形成纳米结构，有利于体内输送。根据这些认识，发明人提出了本发明。 

本发明的突出创造性在于，1)以L-Met和L-Cys为连接臂将2-氨基-1，3-丙二醇与聚天冬氨酸缀合，使排器官铅和血铅的活性更优异；2)以L-Met和L-Cys为连接臂将2-氨 基-1，3-丙二醇与聚天冬氨酸缀合不会影响人体必需的微量元素；3)以L-Met和L-Cys为连接臂将2-氨基-1，3-丙二醇与聚天冬氨酸缀合可以形成纳米结构，有利于体内输送。 

发明内容

本发明的第一个内容是提供Ia-b代表的新型排铅剂。 

本发明的第二个内容是提供Ia-b代表的新型排铅剂的制备方法，包括以下步骤： 

1)冰浴四氢呋喃作溶剂下，经硼氢化钠还原制备L-甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇，L-半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇； 

2)在蒸馏水中用三乙胺调节L-甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇，L-半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇的pH为8，在40℃下，与聚丁二酰亚胺进行反应生成聚天冬酰甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ia)，聚天冬酰半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ib)。 

本发明的第三个内容的是测定Ia-b代表的新型排铅剂的纳米结构。 

本发明的第四个内容的是测定Ia-b与铅的络合作用。 

本发明的第五个内容的是测定Ia-b代表的新型排铅剂的排铅活性。 

本发明的第六个内容的是测定Ia-b代表的新型排铅剂对体内的微量元素的影响。 

本发明的第七个内容的是测定Ia-b代表的新型排铅剂的毒性。 

附图说明

图1聚天冬酰甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ia)，聚天冬酰半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ib)的合成路线图。 

图2聚天冬酰甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ia)浓度为10^-9M的透射电镜照片。 

图3聚天冬酰半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ib)浓度为10^-9M的透射电镜照片。 

实施方式

为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例。必须指出的是，这些实施例完全 是例证性的。给出这些实施例的目的是为了充分明示本发明的意义和内容，决不对本发明造成任何形式的限制。 

实施例1加热减压法制备链长为59的聚丁二酰亚胺 

5g(37.6mmol)研细的L-天冬氨酸、2mL(85％)磷酸和2mL蒸馏水彻底混匀。反应混合物在180℃空气浴下减压反应2.5小时后趁热加入20mL DMF，待溶液澄清后滴到100mL蒸馏水中。收集沉淀，用蒸馏水洗至中性，干燥，得2.9g(84％)标题化合物，为无色固体。元素分析(C₄H₃NO₂)_n：C：48.70％，H：3.64％，N：14.22％。 

实施例2制备叔丁氧酰-L-甲硫氨酰丝氨酸甲酯 

在冰浴下，996mg(4mmol)叔丁氧酰-L-甲硫氨酸用无水THF溶解，加入540mg(4mmol)1-羟基苯并三唑(HOBt)，加入988mg(4.8mmol)DCC活化0.5h。将684mg(4.4mmol)丝氨酸甲酯盐酸盐溶于无水四氢呋喃中，用N-甲基吗啉(NMM)调pH7-8，将混合液加入反应瓶内，再用NMM调pH7-8，撤去冰浴，室温反应。TLC监测原料斑点消失，将反应液过滤，减压浓缩，用乙酸乙酯溶解，过滤，酯层用饱和碳酸氢钠溶液洗3次，饱和氯化钠溶液3次，5％硫酸氢钾洗3次，饱和氯化钠3次，5％碳酸氢钠洗3次，饱和氯化钠洗3次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。得980mg(70％)标题化合物，为无色透明油状物。 

实施例3制备叔丁氧酰-L-甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇 

在冰浴下将700mg(2mmol)的叔丁氧酰-L-甲硫氨酰丝氨酸甲酯用THF溶解，缓慢滴加到83.2mg(2.2mmol)的NaBH₄的THF悬浮中，反应混合物于室温下搅拌，TLC检测。反应完成后，用的盐酸(1M)调pH至7，过滤，减压浓缩至干，用甲醇磨洗，过滤，减压浓缩得到无色油状物，产物经过柱层析硅胶分离(CH₂Cl₂∶MeOH，10∶1)得386mg(60％)标题化合物，为无色油状物。ES I-MS(m/e)323[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝7.38(d，J＝8.1Hz，1H)，6.93(d，J＝7.8Hz，1H)，4.60-4.63(t，J＝6.0Hz，2H)，3.99(m，1H)，3.66-3.72(m，1H)，3.39-3.42(m，4H)，2.43(t，J＝15.0Hz，2H)，2.03(s，3H)，1.71-1.91(m，2H)，1.38(s，9H)。 

实施例4制备叔丁氧酰-l-半胱(苄硫醚)氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇 

按照实施例3的方法，从300mg(0.73mmol)的叔丁氧酰-L-半胱(苄硫醚)氨酰丝氨酸甲酯得151.4mg(54％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)385[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝7.38(d，J＝8.1Hz，1H)，7.14(m，5H)，4.82(m，1H)，3.70-3.85(m，7H)，2.82-3.02(dd，2H)，1.38(s，9H)。 

实施例5制备L-甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇 

在冰浴下，将300mg(0.9mmol)叔丁氧酰-L-甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇与2mL氯化氢对乙酸乙酯溶液(4M)混合，接干燥管，室温搅拌2小时，TLC显示原料点消失，停止反应。水泵减压去除乙酸乙酯。残留物用乙酸乙酯溶解并减压去除乙酸乙酯。该操作重复三次。残留物用乙醚溶解并减压去除乙醚。该操作重复三次。甲醇-乙醚重结晶，得200mg(97％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)223[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.41(d，J＝7.5Hz，2H)，4.76(s，1H)，3.84(t，J＝12.3Hz，1H)，3.74(q，J＝16.2Hz，1H)，3.38-3.45(m，4H)，2.47-2.51(m，2H)，2.05(s，3H)，1.95-2.02(m，2H)。 

实施例6制备L-半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇 

在冰浴下，将100mg(0.26mmol)叔丁氧酰-L-半胱(苄硫醚)氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇与1m L三氟甲磺酸混合，接干燥管，室温搅拌反应2小时，TLC显示原料点消失，停止反应。加冰乙醚使得产物析出，用乙醚反复磨洗3次，过滤得39.3mg(78％)标题化合物，为黄色油状物。ESI-MS(m/e)195[M+H]⁺。 

实施例7制备聚天冬酰甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ia) 

将100mg(0.45mmol)L-甲硫氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇用适量水溶解，用三乙胺调节pH8，减压抽去剩余的三乙胺，将其慢慢滴加到含45mg(0.45mmol)的聚丁二酰亚胺(按丁二酰亚胺分子量计算)蒸馏水悬浮液中。40℃下反应，反应大约7d后，反应液基本澄清，离心，上清液经Sephadex G10纯化，通过TLC监测无原料剩余。冻干得到58.0mg(40％)标题物，为无色粉末，水溶性良好，具有吸湿性。Mp：206-208℃；[α]_D²⁵＝-19.3(c＝0.60，水)；IR(KBr)：3385，3259，3078，2943，2644，1718，1654，1560，1400，1249，1062，997cm^-1。 

实施例8制备聚天冬酰半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇(Ib) 

按照实施例5的方法，从30mg(0.15mmol)的L-半胱氨酰-2-氨基-1，3-丙二醇得15.3mg(34％)标题化合物，为深黄色固体，水溶性良好，具有吸湿性。Mp：198-204℃；[α]_D²⁵＝-61.5(c＝0.40，水)；IR(KBr)：3475，2951，2366，1718，1654，1608，1527，1406，1261，1174，1037，644，516cm^-1。 

实施例9对Ia，b氨基酸组成分析 

仪器采用全自动氨基酸分析仪(Sykam S433D)。采用厌氧管充氮密封水解法，称取样品5mg Ia，b于20mL厌氧水解管中，加入10mL HCl(6M，含0.1％的苯酚)，将样品全部浸没，放入冰水中冷冻10min，充高纯氮气1min-2min，移开氮气后立即盖好软塞，旋紧密封盖，将水解管置于110℃恒温烘箱中水解20h，水解完成后冷却，混匀，取0.5mL水解液，与45℃浓缩至干，加入2mL样品稀释液，震荡混匀，用0.22μm针式过滤器过滤后，进样。最终测得Ia-b的接入率分别为13.4％和14.9％。 

实验例1评价Ia，b的排铅活性 

取体重为18-20g的健康ICR雄性小鼠，腹腔注射(0.1mL/10g)用去离子水配成醋酸铅水溶液，剂量是8.2mg Pb(CH₃CO₂)₂·3H₂O/kg，连续注射7天，停止染毒，将实验动物随机分成4组，每组12只。所有动物在48h之后开始灌胃，阳性对照组用青霉胺(D-PA)灌胃，剂量为0.4mmol/kg。治疗组用Ia-b灌胃，剂量为10nmol/kg，空白组对照组用生理盐水灌胃，剂量为2ml/kg。 

每日给药2h之后，开始收集小鼠24h尿液和粪便；持续7天，每日1组小鼠的尿，粪分别作为一个样本。最后一次给药24h之后，摘除小鼠眼球取全血后，脱颈处死，观察内脏变化，分离并取出脑，心脏，肝，肾，脾及左侧股骨，与全血一并作为样本。 

所有生物样本均用HNO₃∶H₂O₂(2∶1)在MARS-xpress微波硝解仪中硝化至成澄清溶液，转移至10mL容量瓶中，用三蒸水定容，用Varian ICP-700ES电感耦合等离子光谱仪测定样本中铅及其它微量元素的含量。 

将Varian ICP-700ES电感耦合等离子体发射光谱所测样本中金属离子浓度进行数据处理，计算出每克样本中铅含量(尿为每毫升样本中铅含量)，进行统计检验。各组织中的铅的含量(μg/g)列入表1和表1续，粪和尿中铅的含量(μg/g粪或尿μg/mL)列入表2。结 果表明，Ia，b对血铅有着显著的驱排作用，并且在心铅、脑铅、肝铅上的驱排率明显。 

表1 Ia，b治疗的铅中毒小鼠器官中铅的蓄积量 

铅蓄积量用μg/g器官表示，n＝12.a)与生理盐水组比p＜0.05；b)与生理盐水组比p＜0.01. 

表1续Ia，b治疗的铅中毒小鼠器官中铅的蓄积量 

铅蓄积量用μg/g器官表示，n＝12. 

表2 Ia-b治疗的铅中毒小鼠粪和尿中铅的含量 

铅含量用μg/mL尿或μg/g粪表示，n＝6.a)与生理盐水相比p＜0.05；b)与生理盐水相比p＜0.01. 

实验例2Ia，b量效关系 

本发明还将Ia，b做了量效关系的考察，将10nmol/kg/d的剂量分别降低10倍和100倍。各组织中的铅的含量(μg/g)列入表3和表3续，粪和尿中铅的含量(μg/g粪或μg/mL尿)列入表4。 

表3 不同剂量的Ia，b治疗铅中毒小鼠后器官中铅的蓄积量 

铅蓄积量用μg/g器官表示，n＝12.a)与Pb+NS相比，p＜0.05；b)与Pb+NS相比，p＜0.01；c)分别代表Ia的不同剂量，单位为nmol/kg/d，以下均同；d)分别代表Ib的不同剂量，单位为nmol/kg/d，以下均同 

表3续不同剂量的Ia，b治疗铅中毒小鼠后器官中铅的蓄积量 

铅蓄积量用μg/g器官表示，n＝12.a)与Pb+NS相比，p＜0.05；b)与Pb+NS相比，p＜0.01； 

表4 不同剂量Ia-b治疗的铅中毒小鼠粪铅和尿铅的含量 

铅含量用μg/mL尿或μg/g粪表示，n＝6.a)与生理盐水相比p＜0.05；b)与生理盐水相比p＜0.01. 

实验例3评价Ia，b对必需元素的影响 

本发明还评价了Ia，b治疗对必需微量元素的影响。将Varian ICP-700ES电感耦合等离子光谱仪所测样本中各种金属元素的浓度进行数据处理，进行方差分析，结果见表5至表8。结果表明，Ia，b治疗对微量元素无明显影响。 

表5 Ia，b治疗铅中毒小鼠肝中微量元素的含量 

铅蓄积量用μg/g肝表示，n＝12.a)与生理盐水相比p＜0.01. 

表6 Ia，b治疗铅中毒小鼠脑中微量元素的含量 

铅蓄积量用μg/g脑表示，n＝12. 

表7 Ia，b治疗铅中毒小鼠骨中微量元素的含量 

铅蓄积量用μg/g骨表示，n＝12.*.单位是mg/g组织 

表8 Ia，b治疗铅中毒小鼠血中微量元素的含量 

铅蓄积量用μg/g血表示，n＝12. 

实验例4Ia急性毒性试验 

以Ia为例，将ICR雄性小鼠随机分为4组，每组10只，分别为NS组，Ia100，Ia400，Ia1600(分别代表给药剂量为100nmol/kg、400nmol/kg、1600nmol/kg)。采用一次性灌胃给药，正常饲喂14天，观察小鼠的生存和活动情况。结果表明，小鼠在接受灌胃后的6小时内，未观察到震颤、跳跃、抽搐等毒性表现，在之后14天的观察中未见皮毛异常或行为上的异常，14天后所有小鼠均正常存活，体重均处于正常范围，与生理盐水相比没有显著性差异。于第15天眼球取血，处死并解剖小鼠，未见各脏器的异常，各个脏器同样没有显著性差异。将血液做生化指标测试，结果如表9。说明Ia没有肝，肾毒性。 

表9 Ia治疗小鼠血液生化指标表 

GPT和GOT用U/L表示，血肌酐用μM表示，n＝10 

实验例5Ia，b的粒径表征 

本发明中的Ia，b在水溶液中可形成纳米粒。本发明用纳米粒度仪测定了其模拟血液生理环境下的粒径。测试温度为37℃，pH为7.4的情况下设立络合组与非络合组，络合组开始加入Pb(NO₃)₂，使溶液中Pb²⁺浓度为2g/mL(与血铅浓度相当)，采用英国MaLvern公司Zeta Sizer(Nano-ZS90)型激光纳米粒度仪，连续测5天，结果见表10。结果表明，Ia的粒径由络合前的220-420nm降至络合后的60-350nm，并且浓度较小的粒径降低的幅度更大些；Ib的粒径由络合前的220-460nm降至络合后的100-400nm。 

表10 模拟生理环境下Ia，b络铅前后的粒径 

实验例6测定Ia，b的透射电镜照片 

将Ia，b溶于水中配置成浓度为10^-9M溶液，滴在特制铜网上，室温自然挥发干，在透射电子显微镜(TEM，JEM-200CX；JEOL，Tokyo，Japan)下观察其形态及粒径并用照片记录。结果表明，当浓度为10^-9M时Ia，d在水中以纳米球的形态存在。作为代表性照片，图2和图3是Ia，b的透射电镜照片。它们的纳米球的直径为25-205nm。 

实验例7测定Ia，b与二价铅络合物的逐级稳定常数 

采用211A，HANNA型pH计，用pH6.86和pH4.01的标准缓冲溶液分别校准仪器。配制0.0459M KOH标准溶液，0.0912M HCl标准溶液，0.10946M硝酸铅标准液，0.5MKCl溶液。 

以测量Ia与二价铅络合物的逐级稳定常数为例，首先精密称量Ia48.15mg，用移液管分别移取1.5mL HCl，6.0mL KCl，7.5mL H₂O于50mL烧杯中，加入搅拌子，在电磁搅拌器上搅拌均匀，测量pH值。用20mL碱式滴定管，装入KOH标准溶液，进行滴定。每滴0.2mLKOH，测一次溶液pH值。 

其次称量Ia48.15mg，用移液管分别移取1.5mL HCl，6.0mL KCl，3.75mL H₂O，3.75mLPb(NO₃)₂于50mL烧杯中，按以上同样方法以KOH标准溶液滴定。 

用Origin7.5软件计算Ia的加质子常数和再根据pH用Origin7.5软件通过非线性拟合求出逐级稳定常数K₁，K₂的对数值。Ib与二价铅络合物的逐级稳定常数测定方法同Ia，数据如表11。 

表11 Ia，b与二价铅络合物的逐级稳定常数对数值 

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