用于筛选种公牛精子活力的HIBADH基因SNP位点、方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于早期筛选种公牛精子活力高低的HIBADH基因SNP位点、单倍型组合、方法及其试剂盒，所述SNP位点分别为g.26736T>C和g.90209C>T；其中，g.26736T>C位点为种公牛HIBADH基因第26736位碱基；g.90209C>T位点为种公牛HIBADH基因第90209位碱基，通过测定种公牛基因组DNA中HIBADH基因第26736位和第90209位碱基多态性，根据种公牛第26736位和第90209位的单倍型组合预测种公牛的精子活力高低。本发明首次阐明了HIBADH基因SNP位点与公牛精子活力的相关性，减少种公牛饲养的盲目性，节约成本，增加经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种用于早期筛选种公牛精子活力高低 的HIBADH基因SNP位点、单倍型组合、方法及其试剂盒。

背景技术

随着规范化奶牛牧场迅速发展，奶牛的饲养数量成倍数的增长。然而，仅是依靠自然条 件下配种显然不能满足这种增长的需求。日益增长的对奶牛数量的需求与自然配种效率低的 矛盾，已成为限制奶牛业发展的重要因素。直到人工授精和冷冻精液的出现，这种矛盾才逐 步得以缓和。种公牛的精液品质优劣是制约这两项技术是否可以在实际中高效应用的最重要 因素，显得尤为重要。在此，精子活力作为国际公认的衡量种公牛精液品质的重要指标之一， 引起了广泛的关注。精子活力可进一步细分为鲜精和冻后精子活力，受到众多基因的联合调 控，遗传力极低(0.05～0.3)，因此，常规手段对其直接选育的效果甚微。同时，精子活力 高低等性状必须在公牛性成熟后正常采精才能判别，如发现某些公牛因精子活力较低而淘汰， 将造成较大的人力物力浪费。20世纪80年代后，随着各类生物学科交融发展，人们可以在DNA 水平上研究影响精子活力的候选基因，通过标记辅助选择(marker assisted selected，MAS) 育种，为未来早期选育高繁殖力种公牛提供参考。

SNP即单核苷酸多态性，指在基因组上，单个位点突变，引起的序列多样性。研究表明， SNP可以改变基因的表达量及功能，导致表型多样化。在家畜分子生物学的领域，SNP主要作 为家畜各种性状MAS选育的分子基础，指导家畜的选种和选配。Fallin等(2001)研究报道个 体中单倍型的传递比单个SNP位点的传递更有效。Ju等(2011)也通过实验得出，仅用单一SNP 位点来估计某一SNP位点的基因型效应时可能会受到其它SNP位点的影响，所得结果可能不 只是单一SNP位点本身的作用，而是几个SNP位点之间相互作用的结果。这说明单倍型组合 的效应不是各自基因型效应的简单相加减，因此评估品种或种群的遗传改良最好以单倍型组 合的影响效应为准。

3-羟基异丁酸脱氢酶(3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase，HIBADH)是一种二聚物 酶，在进化上高度保守，是缬氨酸代谢组中的一个关键分子，在生命现象中扮演着不可或缺 的角色。近年来，关于HIBADH蛋白的研究进展十分迅速，其功能作用涉及到了生命活动各个 方面。在生殖方面，台湾医科大的一项研究表明HIBADH在人睾丸及精子中含量丰富，且集中 分布于成熟或者正在延伸精子的中段，而精子中段是由线粒体特化而来的结构。由此可见， HIBADH可能参与行使了精子的线粒体功能，对精子活力的维持意义显著。其编码基因HIBADH 被认作是影响精子活力的一个重要标记，在牛群中，HIBADH基因单核苷酸多态性是导致不同 牛个体间精子活力差异的遗传学基础，但利用其SNP及单倍型组合与种公牛精子活力的关系检 测种公牛精子活力高低的试剂盒未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提出一种用于早期筛选种公牛精子活力高低的 HIBADH基因的SNP位点。

本发明的另一目的在于提出利用上述HIBADH基因单倍型组合筛选种公牛精子活力高低 的方法。

本发明的再一目的是通过上述HIBADH基因单倍型组合与种公牛精子活力的关系，进而提 供一种新的用于早期筛选种公牛精子活力高低的试剂盒，在种公牛的早期选育中进行应用。

为实现上述目的，本发明提出一个新的种公牛HIBADH基因的单倍型组合H1H3(TCCC)， 是检测种公牛在第26736位脱氧核糖核苷酸是T还是C，第90209位脱氧核糖核苷酸是C还 是T，核苷酸位置的编号基于Genbank登录号为AC_000161.1(68926598..69034392)的HIBADH 基因序列，且以HIBADH基因的起始密码子ATG作为+1。确定种公牛在这两个位点的单倍型组 合，然后通过单倍型组合确定种公牛的精子活力状况。

本发明的具体技术方案如下：

一种用于早期筛选种公牛精子活力高低的SNP位点，所述SNP位点分别为g.26736T>C和 g.90209C>T；其中，g.26736T>C位点为种公牛HIBADH基因第26736位碱基，位于第4内 含子；g.90209C>T位点为种公牛HIBADH基因第90209位碱基，位于第5外显子。核苷酸位 置的编号基于Genbank登录号为AC_000161.1(68926598..69034392)的HIBADH基因序列， 且以HIBADH基因的起始密码子ATG作为+1。

一种早期筛选种公牛精子活力高低的方法，所述方法为：提取种公牛基因组DNA，测定 种公牛HIBADH基因第26736位和第90209位碱基多态性，根据种公牛第26736位和第90209 位的单倍型组合预测种公牛的精子活力高低。

所述单倍型组合按照如下方法构建：

以种公牛基因组DNA为模板，依据所设计的两对特异性引物进行PCR扩增，然后将PCR 产物分别用FastDigest限制性核酸内切酶AvrII和AciI进行酶切。酶切结束后，用琼脂糖 凝胶电泳检测酶切产物，最终依据电泳的结果进行判定。对于HIBADH基因的第26736位SNP 位点：若酶切后产物片段为325bp和184bp是TT基因型；片段为509bp、325bp和184bp 是TC基因型；片段为509bp是CC基因型。对于HIBADH基因的第90209位SNP位点：若酶 切后产物片段为497bp和407bp是CC基因型；片段为904bp、497bp和407bp是TC基 因型；片段为904bp是TT基因型。

依据测定出的种公牛HIBADH基因的第26736位和第90209位SNP位点，首先构建出四种 单倍型，分别是H1(TC)、H2(TT)、H3(CC)、H4(CT)。四种单倍型经组合后出现9种情况 H1H1(TCTC)、H1H2(TCTT)、H1H3(TCCC)、H1H4(TCCT)、H2H2(TTTT)、H2H4(TTCT)、H3H3(CCCC)、 H3H4(CCCT)、H4H4(CTCT)。其中H1H3(TCCC)单倍型组合种公牛个体精子活力最高。

上述所需的基因组DNA均是利用苯酚/氯仿抽提法从公牛犊血液中提取得到，基因组DNA 经浓度和纯度的检测后，最终被稀释到50ng/μL，-20℃保存备用。

上述的FastDigest限制性核酸内切酶AvrII用于识别HIBADH基因的第26736位SNP位 点，FastDigest限制性核酸内切酶AciI用于识别HIBADH基因的第90209位SNP位点。

一种用于早期筛选种公牛精子活力高低的引物，所述引物的序列为序列表SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。所述引物可以特异性扩增出 含HIBADH基因第26736位核苷酸(如SEQ ID NO.1所示)和含有HIBADH基因第90209位核 苷酸(如SEQ ID NO.4所示)的序列。

一种用于早期筛选种公牛精子活力高低的试剂盒，所述试剂盒包括扩增含有HIBADH基因 第26736位核苷酸的基因组片段所用的上游引物(如SEQ ID NO.2所示)和下游引物(如SEQ  ID NO.3所示)，扩增含有HIBADH基因第90209位核苷酸的基因组片段所用的上游引物(如 SEQ ID NO.5所示)和下游引物(如SEQ ID NO.6所示)。

所述试剂盒还包括PCR反应液、限制性内切酶和酶切反应液；所述PCR反应液为Taq PCR  MasterMix和ddH₂O，所述限制性内切酶为AvrII和AciI，所述其酶切反应液为10×FastDigest  buffer。

具体的，用于早期筛选种公牛精子活力高低的试剂盒，为100头牛检测剂量，试剂盒的 保存温度为-20℃，试剂盒的组成如下：

两条上游引物各20μL，浓度均为50μmol/L；

两条下游引物各20μL，浓度均为50μmol/L；

2×Taq PCR Master Mix 1.5mL；

ddH₂O 2.5mL；

所述两条上游引物的序列分别为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序 列；

所述两条下游引物的序列分别为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序 列。

所述试剂盒中还包括识别HIBADH基因中第26736位和第90209位突变的限制性内切酶 AvrII和AciI及其酶切反应液10×FastDigest buffer。

所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

26736位T→C；90209位C→T；

其中核苷酸位置编号基于Genbank登录号为AC_000161.1(68926598..69034392)的 HIBADH基因序列，且以HIBADH基因的起始密码子ATG作为+1。

本发明的有益效果：

(1)在种公牛HIBADH基因中，经鉴定发现了第26736位和第90209位两处SNP位点，并成 功构建出一个新的单倍型组合H1H3(TCCC)，经国际基因组数据库和文献专利检索，证明为新 的SNP位点和单倍型组合。

(2)利用SNP分子标记手段进行标记辅助育种，这种筛选手段消除了常规育种的局限性， 具有高可靠、高效率、低成本等优势。新分离鉴定出的一个HIBADH基因单倍型组合H1H3，该 组合的种公牛个体精子活力最高，可以进行早期辅助育种。

(3)本发明提供了一种新型的应用性试剂盒，利用HIBADH基因第26736位和第90209位SNP 位点对种公牛精子活力的高低进行筛选，减少种公牛饲养的盲目性，节约成本，增加经济效 益。

(4)本发明的试剂盒检测简单方便，可用于种公牛的早期检测，提高了检测效率，降低 了检测成本。

附图说明

图1为种公牛HIBADH基因第26736位和90209位的SNP及位置示意图；其中，I4：第4 内含子；E5：第5外显子；

图2a为种公牛HIBADH基因第26736位SNP位点琼脂糖凝胶电泳分型图；

图2b为种公牛HIBADH基因第90209位SNP位点琼脂糖凝胶电泳分型图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明， 并不对其内容进行限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人，分子 克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件 或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：种公牛HIBADH基因的SNP位点及单倍型组合的鉴定

本发明采用直接测序和PCR-RFLP的手段对种公牛HIBADH基因进行SNP鉴定。

1.1种公牛血液的采集

本实施例共选取实验公牛404头，其中115头来自北京奶牛中心、195头来自上海光明荷 斯坦牧业有限公司、94头来自山东奥克斯种公牛站。对这404头种公牛进行颈静脉血液采集， ACD抗凝，放于-20℃中保存。

1.2血液基因组DNA的提取

采用苯酚/氯仿抽提法提取血液基因组DNA，利用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行 纯度和浓度的检测，并最终稀释成50ng/μL，-20℃保存备用。

1.3引物的设计

根据Genbank登录号为AC_000161.1(68926598..69034392)的HIBADH基因序列，利用 Primer Premier5.0软件设计引物，所设计的两对引物的序列(5'-3')如下所示：

第一对引物：

I4F:TCTGGCAGCTTTTAGCAGA，如序列表SEQ ID NO.2所示；

I4R:CCCTACCCACAGGATTCTGGAGA，如序列表SEQ ID NO.3所示；

第二对引物：

E5F:GAGGGAGTGAGTGAGCC，如序列表SEQ ID NO.5所示；

E5R:ACAAAGTTAGAGGGTGGATA，如序列表SEQ ID NO.6所示。

1.4PCR扩增反应

25μL的PCR反应体系：1μL模板DNA(50ng/μL)，12.5μL 2×Taq PCR MasterMix， 上游引物和下游引物(10μmol/L)各1μL，9.5μL ddH₂O。

PCR扩增反应条件：94℃变性5min；94℃变性30s，59-60℃退火30s，72℃延伸 30s，总共35个循环；72℃延伸10min。

1.5SNP的检测

PCR产物，由北京华大基因进行测序，测序结果与Genbank提供的HIBADH基因序列(登 录号：AC_000161.1)进行比对，发现两个SNP位点，分别是第26736位的g.26736T>C以及 第90209位的g.90209C>T。结果如图1所示。

1.6SNP基因分型

HIBADH基因的第26736位SNP位点可以被FastDigest限制性核酸内切酶AvrII识别。

HIBADH基因的第90209位SNP位点可以被FastDigest限制性核酸内切酶AciI识别。

20μL酶切反应体系：PCR扩增产物5μL；10×FastDigest Buffer 4μL；FastDigest 限制性核酸内切酶1μL；ddH₂O 10μL。

酶切反应条件：37℃消化30min。

26736位点被AvrII酶识别后，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳发现3种基因型，结果见图 2a，分别为TT基因型(325bp，184bp)、TC基型型(509bp，325bp，184bp)及CC基 因型(509bp)。

90209位点被AvrII酶识别后，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳发现3种基因型,结果见图2b， 分别为CC型(497bp，407bp)、CT基因型(904bp，497bp，407bp)及TT基因型(904 bp)。

1.7单倍型构建

依据测定出的HIBADH基因第26736位和第90209位SNP位点，首先构建出四种单倍型， 分别是H1(TC)、H2(TT)、H3(CC)、H4(CT)。四种单倍型经组合后发现9种情况：H1H1(TCTC)、 H1H2(TCTT)、H1H3(TCCC)、H1H4(TCCT)、H2H2(TTTT)、H2H4(TTCT)、H3H3(CCCC)、H3H4(CCCT)、 H4H4(CTCT)。

实施例2 种公牛HIBADH基因单倍型组合与种公牛精子活力的关联分析

采用SAS 9.0，比较种公牛HIBADH基因不同单倍型组合与精子活力的相关性。其模型为：

Y_ijk＝μ+G_i+Y_j+H_k+e_ijk

Y_ijk为公牛精子活力性状的观察值；μ为群体平均值；G_i:单倍型组合的固定效应；Y_j：季 节的固定效应；H_k：场次的固定效应；e_ijk：随机残差效应。

单倍型组合关联的结果显示：9种单倍型组合中，H1H3单倍型组合的公牛个体，鲜精活 力(P<0.05)、冻后活力(P<0.05)显著的高于其他单倍型组合，结果见表1。

表1HIBADH基因不同单倍型组合与精子活力的相关性分析

注：同一列中不同的小写字母代表差异显著(P<0.05)

由表1可知，具有HIBADH基因H1H3单倍型组合的个体鲜精活力、冻后活力显著高于具 有其他单倍型组合的个体(P<0.05)。因此这种H1H3单倍型组合可以作为高效分子标记，用 于高精子活力个体的筛选。育种工作者实际对公牛犊进行选育的过程中，如果发现某个公牛 犊个体携带这种单倍型组合，那么此个体与其他个体相比期望有更加高的精子活力性状。据 此，可以指导对种公牛进行早期筛选，减少奶牛饲养的盲目性，节约成本，增加经济效益。

实施例3 检测试剂盒

如实施例1所述，种公牛HIBADH基因第26736位的T→C突变以及第90209位的C→T突 变均与种公牛的精子活力性状密切相关。基于此，可以发明一种适用于筛选种公牛精子活力 高低的HIBADH基因SNP分子标记检测试剂盒，即根据这两个SNP位点设计种公牛HIBADH基 因的特异性引物进行扩增及检测。

制备用于种公牛精子活力高低检测的试剂盒(100次)，详细成分如表2所示：

表2检测试剂盒组成

我们对种公牛犊进行血液采集，提取血液的总DNA。利用上述试剂盒并以提取的DNA为 模板进行PCR扩增。首先将试剂盒中的PCR引物浓度从50μmol/L稀释至10μmol/L。然 后按照实施例1所述的PCR体系和条件进行反应。25μL的PCR反应体系：1μl模板DNA(50 ng/μl)，12.5μl 2×Taq PCR MasterMix，上游引物和下游引物(10μmol/L)各1μl，9.5 μl ddH₂O。PCR扩增反应条件：94℃变性5min；94℃变性30s，59-60℃退火30s，72℃ 延伸30s，总共35个循环；72℃延伸10min。

利用PCR-RFLP方法对PCR扩增产物进行分型。具体酶切的条件及体系同实施例1所述， 酶切反应条件：37℃消化30min。20μL酶切反应体系：PCR扩增产物5μL；10×FastDigest  Buffer 4μL；FastDigest限制性核酸内切酶1μL；ddH₂O 10μl。酶切结束后，电泳(1.5％ 琼脂糖凝胶)检测产物。

根据实施例1中所述：HIBADH基因的26736位点被AvrII酶识别后，可以产生3种基因型， 分别为：TT基因型(325bp，184bp)、TC基型型(509bp，325bp，184bp)及CC基因型(509 bp)；HIBADH基因的90209位点被AvrII酶识别后，可以产生3种基因型，分别为CC型(497bp， 407bp)、CT基因型(904bp，497bp，407bp)及TT基因型(904bp)。将上述产物检测结 果与之进行比对，确认所测种公牛的基因型。再进一步按实施例1所述方法确认所测种公牛 的单倍型组合，最终判断所测种公牛的精子活力的高低，决定留种与否。

在此，如果直接测序同样可以检测出种公牛HIBADH基因第26736位的T→C突变以及第 90209位的C→T突变。但是通过直接测序的成本高，操作偏于复杂，仅适用小批量样品的检测。 本实施例所发明的试剂盒则可以很好的解决这个问题。

本发明具有实用性的例证：

1)本发明涉及的种公牛精子活力相关基因SNP位点的检测方法，适用于分析种公牛 HIBADH基因上的2个SNP位点，进一步适用于种公牛精子活力的早期诊断的分析，有助于未来 高品质的种公牛选育。

2)本发明中的高效检测种公牛HIBADH基因SNP位点和种公牛精子活力相关位点方法，可 类似的在种公牛精子活力相关基因诊断的试剂盒中得以应用。

综上所述，我们得出结论，种公牛HIBADH基因的SNP位点g.26736T>C及g.90209C>T与 种公牛精子活力高低的关系显著，并借以此思路，进行方法的创新及试剂盒的研发，在实践 中应用到基因诊断中。

本发明提供了一种用于筛选种公牛精子活力高低的方法。根据本发明，我们只需要少量 DNA样品就可以高效鉴定出种公牛HIBADH基因的SNP位点。进一步构建单倍型组合，分析这 些单倍型组合对种公牛精子活力高低的影响，本发明又提供了一种适用于种公牛精子活力高 低筛选的试剂盒。最终结果，本发明提供了一种用于筛选种公牛精子活力高低的基因诊断方 法。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限 制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付 出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。