一种检测肺癌热点突变基因的组合物及其使用方法

摘要

本发明公开了一种检测肺癌热点突变基因的组合物，所述组合物包含SEQ NO：1至SEQ NO：53的引物序列，还包括SEQ NO：54至SEQ NO：63的block序列。本发明对肺癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肺癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肺癌患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的价值。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及检测肺癌驱动基因热点突变的组合物。 

背景技术

肺癌是一类高发病率、高死亡率的恶性肿瘤。近10年来，我国肺癌的发病率与死亡率快速增长。肺癌的发病部位有所不同，根据各型肺癌的分化程度和形态特征，目前将肺癌分为两大类，即小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。 

研究发现，肺癌的发生与EGFR、KRAS、PIK3CA热点基因的突变有很大的关系。 

EGFR基因表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。 

K-ras基因位于12号染色体短臂上，35kb，属于Ras基因家族的一员。在Ras基因中，K-Ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信 号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。 

PIK3CA基因编码Ⅰ类磷脂酰肌醇-3-激酶的p110催化亚单位，正常情况下在肺、乳腺、胃肠和卵巢等器官中均有表达，具有调控体细胞增殖、分化、存活等许多重要功能。研究发现PIK3CA基因产生突变与肺癌等多种癌症发病存在相关性，4％的肺癌患者体内基因PIK3CA存在突变。 

目前检测基因突变的方法主要有以下几种： 

(1)直接测序法。直接测序法是运用探针进行PCR扩增并对扩增产物进行测序和TA克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。 

(2)变性高效液相色谱法(DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。 

(3)高分辨率熔解曲线(HRM)。高分辨率熔解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。 

(4)探针扩增阻滞突变法(ARMS)。利用PCR引物的3’端 末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物,该检测方法的灵敏度在1％左右。 

(5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1～0.1％左右。 

但这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，误诊率高，不能满足对肺癌检测的需求。 

发明内容

本发明的目的是提供一种肺癌热点基因无创检测的组合物，该组合物及其使用方法特异性强且灵敏度高。 

为达上述目的，本发明的技术方案是：一种检测肺癌热点突变基因的组合物，所述组合物包含SEQ NO：1至SEQ NO：53的引物序列，还包括SEQ NO：54至SEQ NO：63的block序列。 

其中，所述组合物在用于PCR扩增时的反应体系为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM正向引物、0.1～1μM反向引物、0.1～2μM block、0.05～2ng/μL模版DNA、Eva Green染料0.5～2μL、0.01～0.10U/μl TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。 

其中，所述block序列为PCR扩增反应中所用，是一段与野生型DNA序列完全匹配的可偏向性扩增突变DNA序列的突变型特异性引物。 

其中，所述模板DNA浓度可以低至0.1～1ng/μL。 

其中，所述肺癌热点基因为EGFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变型。 

其中，所述EGFR、KRAS、PIK3CA基因包含G719A、G719S、G719C、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q、G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。 

本发明还提供了一种检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，所述使用方法的步骤为： 

第一步：将待测样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照进行PCR扩增反应，其中所述PCR扩增反应以待测DNA为模板，设计针对目的基因突变位点的特异性引物，同时加入LNA锁核酸修饰，通过对待测DNA样品中的目的基因进行偏向性PCR扩增反应； 

第二步：根据仪器检测结果中Ct值和MeltCure的判读，判断所述待测样品中目的基因的突变情况。 

其中，通过PCR扩增反应结果中扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴 别DNA特定突变。 

所述根据Ct值和MeltCure的判读来判断待测样品中目的基因的突变情况，其具体步骤为： 

1).运行CT值的计算，无模板对照应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信号增强；当Ct值≥45.0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分析试验情况； 

2.)运行内控，一般Ct值<40.0，可以继续分析，如果Ct值≥40.0,则说明样品DNA降解严重，不适合试验需要； 

3).运行阳性质控品，阳性质控的Ct值<45.0，熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果； 

4).符合上述条件，运行Tm calling程序，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否存在突变：运行Tm calling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a，无扩增；b，有扩增，Ct≥45；c，有扩增，Ct<45，但是运行Tm calling程序，熔解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内； 

5).如果不符合上述第1、3项要求，应重做本次实验；不符合第2项要求，建议重新从样本中提取DNA，再次检测。 

其中，所述待测DNA样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为含有EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒，所述阴性质控品为不含有EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒。 

其中，所述待测DNA为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织 基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。 

其中，所述肺癌热点基因为EGFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变型。 

其中，所述EGFR、KRAS、PIK3CA基因包含G719A、G719S、G719C、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q、G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。 

其中，所述样品的DNA浓度可以低至0.1～1ng/μL。 

其中，所述PCR扩增反应的具体过程分为2个阶段： 

(1)扩增反应，92～97℃预变性5～15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，并进行35～55个循环； 

(2)做熔解曲线，92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，60～97℃采集荧光，每秒采集荧光10～30次。 

本发明所用引物序列如表1和表2所示。 

表1 EGFR、KRAS、PIK3CA热点基因检测引物序列 

表2 EGFR、KRAS、PIK3CA热点基因检测block 

所述block是指一种寡核苷酸，其3′端做过以下修饰：磷酸化或者间臂：Spacer 3、Spacer 6和Spacer 18处理中的一种或多种处理， 在PCR反应过程中，没有引物延伸扩增的功能。block以锁核酸(LNA)修饰后的野生型DNA为模板，进行设计序列和合成。block和模板的特异结合的部位覆盖了引物的结合部位，当非突变DNA存在时，block特异性与之结合，进一步提高了突变特异性引物和突变DNA结合的特异性。所述检测基因为EGFR、KRAS、PIK3CA基因野生型、EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变型，待检测位点可能含有的突变位点为：G719A、G719S、G719C、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q、G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。 

本发明的使用步骤和条件如下： 

材料：待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。 

仪器：Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。 

试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCR Buffer(罗氏公司)、MgCl₂(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。 

引物：所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰 PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。 

(1)PCR反应的体系和反应条件 

所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM正向引物、0.1～1μM反向引物、0.1～2μM block、0.05～2ng/μL模版DNA、Eva Green染料0.5～2μL、0.01～0.10U/μl TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。 

(2)PCR反应的加样布局 

待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照均进行3个复孔检测。 

实验结束以后，按以下步骤进行检测结果的分析、判定(以Roche LightCyclerTM 480仪器为例进行说明)： 

1.运行CT值的计算，无模板对照(NTC)应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信号增强(运行Tm calling程序，熔解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内)。当Ct值≥45.0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分析试验情况。 

2.运行内控，一般Ct值<40.0，可以继续分析，如果Ct值≥40.0,则说明样品DNA降解严重，不适合试验需要。 

3.运行阳性质控品(STD)，阳性质控的Ct值<45.0，熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果。 

4.符合上述条件，运行Tm calling程序，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否存在突变。运行Tm calling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内(具体见表3)，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性： a，无扩增；b，有扩增，Ct≥45；c，有扩增，Ct<45，但是运行Tm calling程序，熔解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内。 

5.如果不符合上述第1、3项要求，应重做本次实验；不符合第2项要求，建议重新从样本中提取DNA，再次检测。 

表3  不同位点突变的Tm值范围 

本发明基于实时荧光定量PCR平台，利用偏向扩增PCR技术(Asymmetric PCR)和熔解曲线分析技术(Melting curve analysis)结合的技术检测DNA特定突变。PCR体系中，与野生型DNA匹配block序列特异遏制野生型DNA扩增，偏向扩增引物高特异性扩增特定突变模板，通过扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。本发明能检出含检测的基因包含KRAS、BRAF、PIK3CA基因，最低检出限为2～5拷贝突变序列。本发明对肺癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肺癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肺癌患者进行诊断、复发监控和疗效评估。 

本发明针对与肺癌发生相关的热点基因设计专用引物和block序列，特异性强、灵敏度高，能够覆盖热点的肺癌突变基因类型，一次性检测出可能的突变点，准确高效。 

相对于现有技术，本发明具有以下优势：(1)特异性强：加入能与野生型特异性结合的block；(2)灵敏度高，检测灵敏度达到0.005％；(3)检测过程为闭管反应，减少污染的可能性；(4)操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟；而直接测序法则需要2天的时间，且为开管操作，大大增加污染的可能性；(5)结果判读明确客观，只需根据扩增数据和熔解曲线即可完成对样本基因类型的判读；(6)安全，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。 

附图说明

图1是肺癌热点基因突变检测扩增曲线图。1是阳性曲线，2是阴性曲线。 

图2是肺癌热点基因突变检测熔解曲线图。3是阳性曲线，4是阴性曲线。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。 

实施例1，肺癌病人热点基因突变筛选 

一、实验材料 

1.收集30例病理已经诊断为肺癌患者的组织样本和配套的血浆样本。血浆样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。 

2.所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。 

3.所有试剂购买正规厂家：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCR Buffer(罗氏公司)、MgCl₂(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。 

二、主要仪器：Roche Light CyclerTM 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱。 

三、实验设计 

用本发明分别检测检测30例病人组织样本和配套的术前血液样本，然后对组织样本进行测序，根据组织样本测序结果来确定突变的类型。 

四、反应体系及程序 

1.根据实验室现有实验基础和经验研究，及参考分子克隆实验指南第三版第八章聚合酶链式反应体外扩增DNA内容及各种原材料的使用要求确定基础研究体系。 

确定的研究体系如下： 

2.根据以上反应体系进行上机，实验完成后，对实验结果进行数据处理与分析，反应程序：95℃预变性5分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，并进行50个循环；(2)做熔解曲线，95℃预变性1分钟，40℃退火1分钟，65～95℃采集荧光，每秒采集荧光30次。 

五、实验结果与分析 

图1是肺癌热点基因突变检测时得到的扩增曲线，其中的1,即左向曲线是阳性样本，2即右向曲线是阴性样本，可见运用本发明可以十分有效地扩增得到特异性的扩增曲线。 

图2是肺癌热点基因突变检测时得到的熔解曲线，其中的3,即单一高峰值曲线是阳性样本，4即多峰值曲线是阴性曲线，该曲线说明运用本发明能够得到峰值单一的熔解曲线，能够很好的区分阴性和阳性样品。 

30例临床样本血浆突变检测结果如表4所示，说明本发明能够有效地检测到肺癌患者体内存在的突变。 

根据采集的样本检测情况，血浆中EGFR、KRAS、PIK3CA基因42个突变位点的总突变率约为60％。 

表4  30例临床样本突变检测结果 

本发明检测的组织样本与测序方法检测组织样本的突变符合率是100％。本发明检测的血浆样本与测序方法检测的组织样本，符合率90％以上。说明本发明可以用于组织，尤其是血浆中肺癌驱动基因EGFR、KRAS、PIK3CA热点突变的检测。 

肺癌患者组织样本和血浆样本检测比较结果见表5所示。由表5可见，运用本发明进行血浆突变检测与肿瘤组织进行突变检测的结果一致。虽然人的血浆更容易获得，但是人体外周血内的血浆DNA含量非常少，检测更困难，但是本发明却能够十分有效的检测到血浆DNA的突变情况。 

表5  肺癌患者组织样本和血浆样本检测比较 

本发明基于实时荧光定量PCR平台，利用偏向扩增PCR技术(Asymmetric PCR)和熔解曲线分析技术(Melting curve analysis)结合的技术检测DNA特定突变。PCR体系中，与野生型DNA匹配block序列特异遏制野生型DNA扩增，偏向扩增引物高特异性扩增特定突变模板，通过扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。本发明能检出含检测的基因包含EGFR、KRAS、PIK3CA基因，最低检出限为2～5拷贝突变序列。本发明对肺癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肺癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肺癌患者进行诊断、复发监控和疗效评估。 

本发明针对与肺癌发生相关的热点基因设计专用引物和block序列，特异性强、灵敏度高，能够覆热点肺癌突变基因类型，一次性检测出可能的突变点，准确高效。 

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。