一种SNP分子标记及HRM法进行猪肉DNA溯源法

摘要

本发明属于食品技术领域，提供猪肉DNA溯源的SNPs分子标记，同时提供利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法。本发明提供了10个SNP分子标记，彼此间相互独立，基因杂合度均至少是0.4，适合作为猪肉溯源的SNPs分子标记。本发明通过HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法获得10个SNP分子标记，再由所获得的有效SNPs位点组成一个猪肉的SNPs信息组，进而进行猪肉DNA溯源。本发明基于SNPs分子标记采用的HRM法进行猪肉DNA溯源具有简单、快捷、低成本的特点，10个SNPs分子标记稳定广泛的存在于猪基因组DNA中，有助于DNA溯源技术的大规模推广。

说明书

技术领域

本发明属于食品技术领域，涉及猪肉DNA溯源的SNP分子标记即单核苷酸多态性标记， 具体涉及利用HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法进行猪肉DNA溯源的方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，食品的安全性越来越受到人们的关注。肉制品作为人类食物 中蛋白质的主要来源，其安全性自然也备受关注，溯源技术越来越成为肉品安全保障和监管 的重要手段。

肉类食品溯源的技术方法有很多，如标签溯源技术、虹膜溯源技术和DNA溯源技术等。 与其他溯源技术相比，DNA溯源技术具有易分型、便于规模化自动化检测等优点。它不仅可 以对活体动物进行溯源，还可以对胴体分割后的每一块肉，甚至是经过加工后的熟肉进行溯 源，能够真正的做到从生产到餐桌的全程溯源。可以大大强化政府部门的肉品质量安全监管， 提供有用的信息处理食品安全应急事件，将有助于社会的稳定。

DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异。它是通过分析特定的DNA分子标记， 获得动物个体的DNA指纹图谱从而达到鉴别个体、品种或是物种的目的。本研究选取了第 三代分子标记——SNPs标记(单核苷酸多态性标记)。目前，国内外相关的研究中，对于SNPs 标记的检测，主要采用两种方法，RFLP-PCR法和TaqMan探针法。但是RFLP-PCR法检测 时间长，TaqMan探针法检测费用高的缺点，这成为了DNA溯源技术广泛应用的一个障碍。 因此，若能找到一种简单、快捷、低成本的检测方法，来代替这两种检测方法，将有助于DNA 溯源技术的大规模推广。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中，猪肉DNA溯源方法操作复杂，检测周期长，成本高 等问题，通过HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法检测取自猪肉的SNPs分子标记，达到快速 准确检测猪肉来源的目的。

本发明的目的通过以下方法获得

本发明提供一种用于猪肉DNA溯源的SNP分子标记，分别为：

SNP1：序列如SEQ ID NO.1所示，等位基因突变位点为：A/G；

SNP2：序列如SEQ ID NO.2所示，等位基因突变位点为：C/T；

SNP3：序列如SEQ ID NO.3所示，等位基因突变位点为：C/G；

SNP4：序列如SEQ ID NO.4所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP5：序列如SEQ ID NO.5所示，等位基因突变位点为：C/T

SNP6：序列如SEQ ID NO.6所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP7：序列如SEQ ID NO.7所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP8：序列如SEQ ID NO.8所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP9：序列如SEQ ID NO.9所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP10：序列如SEQ ID NO.10所示，等位基因突变位点为：A/G

序列表中的n分别代表各个分子标记的突变位点。

本发明还提供一种利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，包括如下步骤：

1)从已发表文献或NCBI中选取SNPs位点，其中，SNPs位点应满足以下要求：A.任意 相邻的SNP间的距离≥1Mb，保证SNPs间相互独立，不存在连锁现象；B.任意SNP位点与 其他SNP位点不存在任何关联；3)SNP侧翼序列不存在任何变异；

2)取猪肉、猪血或猪毛发样品≥299个，提取其DNA；

3)根据选取的SNPs位点，设计引物，利用HRM法对每个样品进行SNPs位点基因型 分析；计算出每个单核苷酸多态性SNP的等位基因频率及杂合度；

4)记录每一样品的SNPs位点信息；

5)后期，选择的步骤2)中的猪有问题，将有问题的猪肉按照步骤2)到4)的方法，对 作为DNA溯源的SNPs位点进行检测；

6)将步骤5)得到的SNPs位点信息与步骤4)中记录的信息进行对比；

7)根据溯源标记的SNPs的特征信息追溯猪肉来源。

其中，步骤1)中选择的文献为Rohrer G A,Freking B A,Nonneman D.Single nucleotide  polymorphisms for pig identification and parentage exclusion[J].Animal Genetics,2007,38(3): 253-258.

SNPs位点均为猪DNA基因组中的突变位点；猪肉、猪血或者猪毛的样品均取自不同猪 体，即每头猪身上要么取猪肉要么取猪血要么取猪毛发，猪样品均取自江苏淮安苏食屠宰场。 当然，本发明所用的猪肉样品的来源并无限制，任何需要进行跟踪溯源的猪肉都可以作为检 测样品，记录其SNPs位点信息，从而对猪肉样品进行溯源追踪，检测其质量。

利用HRM法对每个样品进行SNPs位点基因型分析指的是利用设计好的测序引物在实时 荧光PCR扩增仪上进行荧光PCR扩增，通过获得的熔解曲线，进行分析从而得到每个样品 的每个SNP位点的基因型。本发明只提供10个SNP位点，即每个样品将获得10个SNP位 点的基因型。

步骤6)中的SNPs位点信息指的是该猪肉样品中，在步骤1)中选择的10个SNP位点 上的基因型。

3.上述2提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中所用引物分别为：

SNP1：上游引物snp1-f如SEQ ID NO.11所示；下游引物snp1-r如SEQ ID NO.12所示；

SNP2：上游引物snp2-f如SEQ ID NO.13所示；下游引物snp2-r如SEQ ID NO.14所示；

SNP3：上游引物snp3-f如SEQ ID NO.15所示；下游引物snp3-r如SEQ ID NO.16所示；

SNP4：上游引物snp4-f如SEQ ID NO.17所示；下游引物snp4-r如SEQ ID NO.18所示；

SNP5：上游引物snp5-f如SEQ ID NO.19所示；下游引物snp5-r如SEQ ID NO.20所示；

SNP6：上游引物snp6-f如SEQ ID NO.21所示；下游引物snp6-r如SEQ ID NO.22所示；

SNP7：上游引物snp7-f如SEQ ID NO.23所示；下游引物snp7-r如SEQ ID NO.24所示；

SNP8：上游引物snp8-f如SEQ ID NO.25所示；下游引物snp8-r如SEQ ID NO.26所示；

SNP9：上游引物snp9-f如SEQ ID NO.27所示；下游引物snp9-r如SEQ ID NO.28所示；

SNP10：上游引物snp10-f如SEQ ID NO.29所示；下游引物snp10-r如SEQ ID NO.30所 示。

4.上述3提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中进行SNPs位点 基因型分析时，反应条件为：95℃热启动反应10min；95℃反应10s，touchdown程序20s，72℃ 反应20s，20s末收集单个荧光，共进行40个循环；95℃反应1min，60℃反应2min，同时收集 荧光信号，1个循环；60-95℃读取熔解曲线，20次/℃。

touchdown程序又叫递减程序。

5.上述4提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中touchdown程序 为：

SNP1：64℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP2：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP3：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP4：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP5：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP6：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP7：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP8：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃；

SNP9：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP10：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃；

6.上述5提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中计算每个单核 苷酸多态性SNP的公式为

根据个体的基因型计算等位基因频率，如位点1的299个样品中有AA型135个，AB型65个， BB型99个，则基因A的等位基因频率为：(2*135+1*65)/(299*2)＝0.56；基因B的等位基因频 率为(2*99+1*65)/(299*2)＝0.44，位点1的基因杂合度则为1-0.56*0.56-0.44*0.44＝0.4928。如 此，得到SNP位点基因杂合度的通用计算公式。

7.本发明还提供上述SNP分子标记在猪肉检测中的应用。

本发明具有如下优点：

1.本发明选择的SNPs分子标记的杂合度均至少是0.4，基因多态性较高，适合应用于猪 肉的DNA溯源中，尤其是其中的SNP1、SNP6、SNP7和SNP8的基因杂合度均在0.49以上， 十分适合应用于DNA溯源中。

2.本发明通过HRM法获得SNPs分子标记的方法，具有快速、简便的特点，整个过程仅 需2个小时完成，而传统的RFLP-PCR法检测时间长，通常需要20个小时。HRM法不需要 合成探针，在PCR结束后直接通过荧光强度与时间曲线获得SNP分子标记，具有快速、准 确、简便的特点。相较TaqMan探针法检测法每个样品检测费用(平均每个样品为5元)，HRM 法平均每个样品为2.5元，检测成本较低。因此，本发明是一种简单、快捷、低成本的检测 方法，来代替上述两种检测方法，将有助于DNA溯源技术的大规模推广。

3.利用本发明获得的SNPs分子标记对猪肉DNA进行溯源检测，从猪生长开始进行标识， 可以使其从屠宰、加工和销售过程都达到可检测状态，从而可以随时快速对猪肉质量进行监 控，达到连续动态的目的，为今后食品安全监控系统建立提供基础。

4.每个SNP分子标记，理论上可以检测3个基因型样品，那么，有n个SNP分子标记， 理论上能够检测3ⁿ个样品。本发明提供10个可检测的SNP分子标记，理论上可以检测3¹⁰样品，满足了一批猪肉样品的溯源追踪。并且，通过本发明提供的方法，为今后大规模利用 SNPs分子标记对猪肉DNA溯源奠定了基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明。

实施例1：

(1)SNPs位点的选取

从NCBI上选取SNPs位点，保证①任意相邻的SNP间的距离≥1Mb，保证SNPs间相互 独立，不存在连锁现象；②任意SNP位点与其他分子标记不存在任何关联；③SNPs侧翼序列 不存在任何变异。本研究中选取的SNPs位点见表1。

表1 SNP位点相关信息

如表1所示，选择的10个SNP位点，SNP1位于猪基因组1号染色体，SNP2位于猪基 因组2号染色体，SNP3位于猪基因组12号染色体，SNP4位于猪基因组14号染色体，SNP5 位于猪基因组3号染色体，SNP6位于猪基因组13号染色体，SNP7位于猪基因组17号染色 体，SNP8位于猪基因组8号染色体，SNP9位于猪基因组6号染色体，SNP10位于猪基因组 10号染色体，由此可见，该10个SNP位点均位于猪不同染色体上，保证了彼此独立，不存 在发生连锁反应。等位基因位点表示各个SNP位点的突变基因，具体位置见序列表。其中， SNP1的序列如SEQ ID NO.1；SNP2的序列如SEQ ID NO.2所示；SNP3的序列如SEQ ID NO. 3所示；SNP4的序列如SEQ ID NO.4所示；SNP5的序列如SEQ ID NO.5所示；SNP6的序 列如SEQ ID NO.6所示；SNP7的序列如SEQ ID NO.7所示； SNP8的序列如SEQ ID NO.8所示；SNP9的序列如SEQ ID NO.9所示；SNP10的序列如SEQ  ID NO.10所示。

2)猪的DNA样品制备

采集299个猪样品，其中，血样155份，肉样144份；肉样每份采集刚宰杀的猪胴体肌 肉组织5g，标准抗凝血管收集血样，每份样品准确进行编号。用天根试剂盒法从猪的肌肉、 血液提取其总DNA，并经紫外分光光度计检测后稀释，保证每份样品中DNA的浓度为 18ng/ul。

3)HRM法即高分辨率熔解曲线法检测

根据选取的SNPs分子上下游序列的信息，设计HRM法检测的引物。本发明中所用的引 物信息见表2，由生工生物(上海)有限公司合成。

表2 HRM法检测的引物信息

其中，长度指的是经过PCR扩增后的核苷酸序列。

实时荧光PCR反应条件见表3：

表3 HRM法PCR反应体系

Evagreen qPCR Master Mix是一种荧光定量PCR中使用的DNA结合染料。

实时荧光PCR反应条件为：95℃热启动反应10min；95℃反应10s，touchdown程序20s， 72℃反应20s，20s末收集单个荧光，共进行40个循环；95℃反应1min，60℃反应2min，同 时收集荧光信号，1个循环；60-95℃读取熔解曲线，20次/℃

其中，touchdown程序为：

SNP1：64℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP2：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP3：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP4：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP5：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP6：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP7：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP8：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃；

SNP9：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP10：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃。

4)基因杂合度分析

利用提取的猪DNA样品对选取的位点进行基因杂合度分析。基因杂合度大于0.3的位点 即可应用于猪肉的DNA溯源中。基因杂合度越接近于0.5，说明该位点的基因多态性越丰富， 也就越适合应用于DNA溯源中。本研究选取了299个样品对10个SNP位点进行了杂合度分 析。基因杂合度的计算公式如下：

根据公式个体的基因型计算等位基因频率，如位点1的299个样品中有AA型135个， AB型65个，BB型99个，则基因A的等位基因频率为：(2*135+1*65)/(299*2)＝0.56；基 因B的等位基因频率为(2*99+1*65)/(299*2)＝0.44，位点1的基因杂合度则为 1-0.56*0.56-0.44*0.44＝0.4928。如此，得到SNP位点基因杂合度的通用计算公式 计算结果详见表4。SNP1分子中的突变位点中1代表纯合子AA型，2代 表杂合子AG型，3代表纯合子GG型，该突变位点的基因杂合度为0.4975；SNP2分子突变 位点中1代表纯合子TT型，2代表杂合子CT型，3代表纯合子CC型，该突变位点的基因 杂合度为0.4805；SNP3分子中突变位点1代表纯合子CC型，2代表杂合子CG型，3代表 纯合子GG型，该突变位点的基因杂合度为0.4527；SNP4分子中突变位点1代表纯合子AG 型，2代表杂合子AA型，3代表纯合子GG型，该突变位点的基因杂合度为0.4250；SNP5 分子中突变位点中1代表纯合子CC型，2代表杂合子CT型，3代表纯合子TT型，该突变 位点的基因杂合度为0.4799；SNP6分子中突变位点1代表杂合子AG型，2代表杂合子GG 型，3代表纯合子AA型，该突变位点的基因杂合度为0.4996；SNP7分子中突变位点1代表 杂合子AG型，2代表纯合子GG型，3代表纯合子AA型，该突变位点的基因杂合度为0.4962； SNP8分子中突变位点1代表纯合子GG型，2代表杂合子AG型，3代表纯合子AA型，该 突变位点的基因杂合度为0.4999；SNP9分子突变位点1代表纯合子AA型，2代表纯合子 GG型，3代表杂合子AG型，该突变位点的基因杂合度为0.4026；SNP10分子中突变位点1 代表纯合子GG型，2代表杂合子AG型，3代表纯合子AA型，该位点的基因杂合度为0.4831。 等位基因1分别表示1所代表基因型的基因频率，等位基因2分别表示2所代表基因型的基 因频率。

表4 各位点基因杂合度信息

从计算结果可以看出10个SNP位点的基因杂合度均在0.4以上，其中SNP1、SNP6、SNP7 和SNP8的基因杂合度均在0.49以上，十分适合应用于DNA溯源。而SNP9的基因杂合度仅 为0.40，相对来说，比其他位点低，但仍可用于猪肉的DNA溯源中。

本试验利用HRM法检测技术对299个样品的10个SNP标记分别进行了检测。在这些样 品中有个别样品的个别位点没能检测到相应的基因型，这些样品为SNP1位点的样品47，SNP4 位点的样品284和样品289，SNP6位点的样品241和样品282。造成这种结果的原因可能是 由于提取的DNA不够完整或是DNA浓度过低所引起的，此外也有可能是由于在采样或是提 取过程中造成了交叉污染，使得无法检测出样品的基因型。其余各位点各样品的基因型如表 5所示。从表5中可以看出，除上述已经说明的个别情况外，选取的299个样品中，均检测 到各SNP突变位点中存在的基因型。说明选择的10个SNP分子标记稳定广泛的存在于猪基 因组DNA中。利用选择的10个SNP分子标记记录在养殖生产中各头猪的基因型，获得基因 信息，利用HRM法快速获得相应待检测猪样品中的10个SNP位点的基因型，从而能快速实 时监测猪肉动态，保证猪肉安全质量。

实施例2：

1)猪DNA样品制备

选择上述299个样品中的1、2、5、6、30、31、40、48、49、53号的新鲜猪肉个体， 在实施例1采集猪肌肉组织和血液的同时，于此10个猪个体上切取带猪毛的猪皮样本10个， 记录每个样本的个体编号，标记样本，并打乱待检测样本。

从每份样品的猪皮上拔取带有完整毛囊的猪毛15根，尽量剪短只剩下毛囊的部分，放 入干净的1.5ml离心管中，加入200ulDNA裂解液及蛋白酶K10ul，充分混匀。56℃消化2h， 期间用手指轻弹样品以加速消化过程。加入5mol/L NaCl60ul，充分混匀；加入饱和酚/氯仿/ 异戊醇(25:24:1)260ul，颠倒混匀5min，使蛋白质充分变性，1000r/min离心5min，取上清 液于另一新离心管中，加入2倍上清液体积的冰乙醇，轻轻颠倒混匀5min，置于冰上静置 30min，使DNA成沉淀析出，1200r/min离心5min,使DNA沉淀至离心管管底，弃掉上清液。 将沉淀用乙醇70％漂洗2此，吸除剩余乙醇，自然晾干得DNA，溶于50ul的TE缓冲液中， -20℃保存。

2)HRM法检测

选择实施例1中的10个SNP检测位点作为分子标记，进行HRM法检测。实时荧光PCR 反应体系和过程同实施例1。

3)记录每一个样品的10个SNP位点信息。与表4中获得的299样品中的10个SNP位 点基因型进行比较，确定每个样品对应的个体编号，与采样时记录的样品对应的个体编号进 行比较，检验结果相一致。即通过HRM法检测样品，确定的样品号为1、2、5、6、30、31、 40、48、49、53号，对应的样品在采集过程中的个体编号为1、2、5、6、30、31、40、48、 49、53号。检测结果准确，用HRM法可有效进行猪肉DNA溯源。

本实验共选取10个SNP检测位点，理论上可以检测3¹⁰个个体，当一批待监控的猪个 体数>3¹⁰个时，可以按照本发明提供的方法选择SNP检测位点个数>10个。

表5 选择的299样品中对于10个SNP位点的基因型。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅 限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进 和变更也属于本发明的保护范围。