一种发酵培养海洋真菌生产抗癌化合物1403C的方法

摘要

本发明涉及一种发酵培养海洋真菌生产抗癌化合物1403C的方法。本发明人经过深入的研究，通过对微生物发酵过程的多参数协同控制，找到了影响发酵过程的关键因素，开发出系统有效的海洋真菌反应器发酵控制工艺。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工艺学技术领域，更具体地，涉及用于反应器发酵培养海 洋真菌的生物工艺，特别是指一种用于搅拌式生物反应器发酵培养海洋红树林 内生真菌(Halorosellinia sp.)高产抗癌化合物1403C的生产工艺。

背景技术

海洋生态系统按照生物群落划分，一般分为红树林生态系统、珊瑚礁生态 系统和藻类生态系统等。红树林生态系统的微生物资源既丰富又不失特色，主 要类群包括细菌、真菌、放线菌、微型藻类等，目前已分离鉴定的红树林真菌 就已超过200种，成为海洋真菌的第二大类群。海洋真菌可以产生众多天然化 合物，且大部分化合物结构新颖、活性独特，应用价值较高。

海洋红树林内生真菌No.1403属于盐生坚座壳种(Halorosellinia sp.)，由香 港城市大学L.L.P.Vrijmoed教授从中国南海的红树树叶内部分离得到，经液体 或固体发酵可产生多种有重要价值的代谢产物。1403C是其产生的一种蒽醌类 次级代谢物，亦称SZ-685C，结构式如下式(I)，纯品为红色颗粒状结晶，分子 式为C₁₆H₁₆O₈，分子量336Da。1403C及其乙酰化产物具有显著的抗肿瘤活性， 对体外培养的人乳腺癌细胞有高效抑制作用，是一种潜在的抗癌候选药物。

(I)

然而，现有技术中，海洋红树林内生真菌在初始环境下1403C产量很低， 而本领域又需要生产大量的1403C，因此有必要提高1403C的产量，为其大规 模应用提供可能。

至此可知，海洋红树林内生真菌(No.1403)的发酵工艺优化工作是突破抗肿 瘤抗癌药物极度匮乏之瓶颈的当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵培养海洋真菌生产抗癌化合物1403C的方 法。

在本发明的第一方面，提供一种用于提高海洋红树林内生真菌 (Halorosellinia sp.)生产化合物1403C产量的方法，所述方法包括：将海洋红树 林内生真菌种子液接种到发酵培养基中液体培养，每升培养基接种干重0.22± 0.05g的菌体；和如下调节发酵培养基的pH值：发酵初始时调节培养基的pH6.2 ±0.4；之后当pH值低于3.8-4.2(选自3.8-4.2范围内的一个值)时，加入碱液避 免pH进一步降低；待碳源耗尽后不再调节pH值。

在一个优选例中，pH采用如下调节策略：发酵初始时调节培养基的pH6.2 ±0.2；之后当pH值低于4.0-4.2(选自4.0-4.2范围内的一个值)时，加入碱液 避免pH进一步降低；待碳源耗尽后不再调节pH值。

在另一优选例中，所述的海洋红树林内生真菌是海洋红树林内生真菌 No.1403。

在另一优选例中，所述的发酵培养中，培养温度28±2℃。

在另一优选例中，发酵罐装液量是罐体容量的60-80%(较佳地为65-75%)； 和/或发酵过程中维持发酵罐的罐内压力为0.01～0.04Mpa(较佳地为 0.02～0.03Mpa)。

在另一优选例中，发酵罐中装备1-3层搅拌桨(如双层六平叶涡轮桨或三层 组合搅拌桨)，搅拌转速80～500r/min(较佳地100-400r/min，搅拌转速以发酵 罐体积而定)。

在另一优选例中，发酵罐中初始通气量为0.3-0.6vvm(较佳地0.4-0.5vvm)， 发酵过程的最低溶氧不低于30%(即：发酵前期，尤其是生长期，当溶氧低于 30%时，调节通气量避免溶氧进一步下降；发酵后期，通过通气与搅拌转速偶 联控制，维持溶氧为30-40%；当高于30%时则不调节)。

在另一优选例中，发酵规模为5-1000L发酵罐发酵。

在另一优选例中，发酵规模为5-500L发酵罐发酵。

在另一优选例中，所述的碱液包括：NaOH溶液。

在另一优选例中，发酵时间为60-150小时；较佳地为70-120小时。

在另一优选例中，所述的发酵培养基含有：

(1)-(4)的组分溶于10-60%(v/v)浓度的人工海水中。

在另一优选例中，所述的人工海水含有：

(a)-(g)的组分溶于水中。

在另一优选例中，发酵培养基中，还加入按照体积0.3‰的消泡剂；较佳 地，所述消泡剂是：聚醚改性硅油消泡剂。

在另一优选例中，用于接种的海洋红树林内生真菌为二级种子液，将一级 种子液(见专利，申请号：201210067014.6)按照5%(v/v)接入相同种子培养基， 发酵培养24～48h。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。

具体实施方式

针对现有技术中在较大发酵规模下难以利用海洋红树林内生真菌 (Halorosellinia sp.)高产抗癌化合物1403C的技术缺陷，本发明人经过深入的研 究，通过对微生物发酵过程的多参数协同控制，找到了影响发酵的关键因素， 开发出系统有效的海洋真菌反应器发酵控制工艺。

(a)菌株

本发明中，应用海洋红树林内生真菌(Halorosellinia sp.)来生产1403C；较 佳地，所述的海洋红树林内生真菌是编号为No.1403(Haloroselliniasp.)的菌株， 其保藏在中国典型微生物保藏中心(CCTCC，No.M201018)。其它的海洋红树林 内生真菌No.1403的同功能变异菌株也适用于本发明中。

(b)接种量优化

本发明人经过反复研究发现，在进行发酵培养的初期，菌株的接种量对于 后续的发酵过程控制具有影响，并且影响产量。例如，当接种量为0.1g菌体(干 重)/L培养基时，发酵的1403C产量很低。而当接种量过高时，由于菌体代谢 过于旺盛，可能导致反馈抑制以及副产物增加。

因此，本发明人在反复研究后，采取每升培养基接种干重0.22±0.05g的 菌体的接种量来将海洋红树林内生真菌接种到发酵培养基中，这一接种量对于 5-1000L规模的发酵体系，是非常合适的，有利于菌体的生产代谢，并且在代 谢过程中趋向于高产1403C，低产其它副产物。

(c)pH值优化

本发明人经过反复研究发现，培养基的pH值是较大规模培养时影响菌体 状态进而影响发酵产量的较为关键的因素，而根据发酵过程中自然pH值进行 培养，将导致发酵过程长期低于4.0，使得1403C产量很低。

因此，通过深入研究海洋红树林内生真菌对于培养液pH值的偏好，本发 明人采用如下调节发酵培养基pH值的策略：发酵初始时调节培养基的pH6.2 ±0.4；之后当pH低于3.8-4.2(选自3.8-4.2范围内的一个值)时，加入碱液使pH 值维持在4.0，避免进一步降低；待碳源耗尽后不再调节pH值。也即，整个发 酵过程，pH值先高后低、之后再升高，这有利于高产1403C。

用于调节pH值的碱液没有特别的限制，可以采用任何强碱性或弱碱性的 溶液。例如，所述的碱液包括：NaOH溶液。

(d)其它发酵工艺

作为本发明的优选方式，所述的发酵培养中，培养温度28±2℃；较佳地 培养温度是28±1℃。

作为本发明的优选方式，所述的发酵培养中，发酵罐中装入发酵培养基的 量是罐体容量的60-80%；较佳地为65-75%。

作为本发明的优选方式，发酵过程中维持发酵罐的罐内压力为 0.01～0.04Mpa；较佳地为0.02～0.03Mpa。

作为本发明的优选方式，发酵罐中装备1-3层搅拌桨，搅拌转速80～500 r/min；较佳地100-400r/min。所述的搅拌浆如双层六平叶涡轮桨或三层组合搅 拌桨。在中试生产中，可按照桨尖线速度(v_tip)相同的放大准则计算中试规模搅 拌转速。

作为本发明的优选方式，发酵罐中初始通气量为0.3-0.6vvm；较佳地 0.4-0.5vvm。

作为本发明的优选方式，发酵过程的最低溶氧按照体积不低于30%；当低 于30%时，调控溶氧为20-30%；当高于20-30%时则不调节。更佳地，保证发 酵前期(对数生长期和稳定期前期)的最低溶氧不低于30%，发酵后期(稳定期后 期和衰亡期)的溶氧维持在30～40%。

在另一优选例中，所述的碱液包括：NaOH溶液。

(e)培养基

作为本发明的优选方式，应用于培养海洋红树林内生真菌的培养基包含葡 萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏和一水硫酸锰。更优选地，各组分及其用量如表1所 示。

表1

  含量 优选量 更优选量 最优选量 葡萄糖 7-20g/L 9-15g/L 11-13g/L 12.36g/L 蛋白胨 0.5-2g/L 0.9-1.6g/L 0.95-1.2g/L 1.05g/L 牛肉浸膏 2-8g/L 3-7g/L 5.5-6.5g/L 6.08g/L 一水硫酸锰 0.1-0.5g/L 0.2-0.4g/L 0.2-0.3g/L 0.246g/L

上述配方的营养成分被溶于10-60%(v/v)、较佳地30-50%(v/v)、更佳地 40%(v/v)浓度人工海水中，从而为海洋红树林内生真菌提供适宜的生长环境。

作为本发明的优选方式，用于配制本发明的人工海水的各组分的用量如表 2所示。

表2

  含量 优选量 最优选量 氯化钠 15-25g/L 18-22g/L 19.624g/L 无水硫酸钠 3-7g/L 4-6g/L 4.908g/L 无水氯化钙 1-2g/L 1.2-1.5g/L 1.392g/L 六水氯化镁 4-8g/L 5.5-6.8g/L 6.240g/L 硼酸 0.02-0.04g/L 0.025-0.035g/L 0.032g/L 溴化钾 0.06-0.1g/L 0.07-0.09g/L 0.081g/L 碳酸氢钠 0.1-0.2g/L 0.14-0.18g/L 0.161g/L

经本发明人优化后的培养基配方，它含有足够且合理的营养成份，有利于 海洋红树林内生真菌No.1403的生长及大量生产蒽醌类化合物1403C。

(f)分离和检测1403C

作为本发明的优选方式，还提供了一种发酵液样品快速萃取及产量检测的 方法：自接种时刻起，每隔12h取样一次，取适量混合均匀的发酵液于50ml 有盖离心管，加入适量乙酸溶剂，密封后摇匀，置于超声清洗机超声振荡以充 分萃取产物，然后转移至恒温槽水浴一定时间。趁热吸取适量混合液至离心管， 13000×g、离心3min；取上清液留样，样品稀释若干倍并高速离心后可直接进 行HPLC分析，测定1403C的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中 1403C的实际含量。

本发明提供的海洋红树林内生真菌No.1403的生物反应器发酵控制工艺的 主要优点如下：

1.本发明的生物反应器发酵控制工艺涉及发酵液pH、溶氧、接种量、搅 拌转速和搅拌桨型5种过程参数，考察全面，操作具体，参数详细准确；

2.本发明的生物反应器发酵控制工艺针对常见搅拌式生物反应器的液体 发酵过程，有利于工艺的推广与普及；

3.按照本发明的生物反应器发酵控制工艺，海洋红树林内生真菌No.1403 产新型抗癌化合物1403C的产量提高效果明显，5-L反应器发酵的1403C的产 量由最初的0.61g/L提至1.32g/L，提高幅度达到116%；500-L中试发酵的产 量由最初的0.50g/L提高至1.10g/L，增幅达到120%。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版， 科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、培养工艺1

1、制备菌种液

海洋红树林内生真菌No.1403菌种由中山大学提供。将-80℃保存的菌种复 苏后，用接种针在固体平板培养基中央进行点样，然后置于28℃恒温培养箱， 湿度保持在50%以上，活化培养4～6天，菌丝覆盖整个培养皿，即获得新鲜固 体平板。用直径1cm的打孔器在从已经活化好的固体平板上挖取相同大小的琼 脂块，每个琼脂圆块均匀切割成4块，然后接种至含有种子培养基的挡板瓶中， 28℃、170r/min摇床培养72h，获得新鲜一级种子液。将一级种子液按照5%(v/v) 接入相同种子培养基，发酵培养36h，获得二级种子液。

用于上述过程的固体平板培养基、种子培养基配方为：

固体平板培养基：每升固体培养基包含有葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母干粉 1g，琼脂粉15～20g，其余为100%浓度的人工海水I。

种子培养基：每升培养基包含有葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母干粉1g，其余 为100%浓度的人工海水I；

以上培养基均在121℃，灭菌20～30min。

人工海水I：氯化钠24.5g，无水硫酸钠4.0g，无水氯化钙0.56g，六水氯化镁 5.0g，硼酸0.026g，氯化钾0.664g，溴化钾0.1g，碳酸氢钠0.2g，去离子水溶解并 定容至1L。

2、配制发酵培养基

葡萄糖12.36g/L，蛋白胨1.05g/L，牛肉浸膏6.08g/L，一水硫酸锰0.246g/L， 用40%(v/v)浓度的人工海水II溶解并定容至3.3L，加入按照体积0.3‰的消泡剂 (聚醚改性硅油)，罐体灭菌(121℃、30min)。

人工海水II：氯化钠19.624g，无水硫酸钠4.908g，无水氯化钙1.392g，六 水氯化镁6.240g，硼酸0.032g，溴化钾0.081g，碳酸氢钠0.161g，去离子水溶 解并定容至1L。

3、发酵工艺控制过程

5-L搅拌式生物反应器，培养温度28℃，装液量70%(体积)，罐内压力 0.02～0.03Mpa，以每升培养基净接入菌体干重等于0.1g的二级种子液作为接 种标准；发酵过程中基本维持自然pH，其中pH低于4.0的时间长达66h，96h 起pH缓慢上升；装有双层六平叶涡轮桨，搅拌转速恒定300r/min；初始通气 量为0.5vvm，保证发酵过程的最低溶氧不低于30%。

1403C测定方法如下：

取10ml混合均匀的发酵液样品于50ml有盖离心管，加入20ml乙酸溶剂， 密封后摇匀，置于超声清洗机(额定功率800W，水温低于65℃)超声振荡30 min，转移至65℃恒温槽水浴30min，然后重复超声和水浴过程。趁热吸取1ml 混合液至离心管，13000×g、离心3min；取上清液留样，样品稀释若干倍并高 速离心后可直接进行HPLC分析。

最后测得目标产物1403C的最高产量为0.61g/L，出现在96h。

实施例2、培养工艺2

1)制备菌种液

同实施例1的步骤1。

2)配制发酵培养基

同实施例1的步骤2。

3)发酵工艺过程控制

5-L搅拌式生物反应器，培养温度28℃，装液量70%(体积)，罐内压力 0.02～0.03Mpa，以单位体积培养基净接入菌体干重等于0.22g的二级种子液作 为接种标准；初始pH6.10，过程中短期维持较低pH，pH低于4.0的时候加入 NaOH使之维持在约4.0，该时间大约持续16h，48h(碳源耗尽)起pH快速上 升至6.0以上；装有双层六平叶涡轮桨，搅拌转速恒定300r/min；初始通气量 为0.5vvm，保证发酵过程的最低溶氧不低于30%。

最后测得目标产物1403C的最高产量为0.92g/L，出现在96h。

实施例3、培养工艺3

1)制备菌种液

同实施例1的步骤1。

2)配制发酵培养基

同实施例1的步骤2。

3)发酵工艺过程控制

5-L搅拌式生物反应器，培养温度28℃，装液量70%(体积)，罐内压力 0.02～0.03Mpa，以单位体积培养基净接入菌体干重等于0.22g的二级种子液作 为接种标准；初始pH6.20，过程中短期维持较低pH，pH低于4.2的时候加入 NaOH使之维持在约4.2，该时间大约持续24h，50h(碳源耗尽)起pH快速上 升；装有双层搅拌桨，上层三斜叶推进桨，下层六平叶涡轮桨，搅拌转速恒定 400r/min；初始通气量为0.5vvm，保证发酵过程的最低溶氧不低于30%。

最后测得目标产物1403C的最高产量为0.89g/L，出现在72h。

实施例4、培养工艺4

1)制备菌种液

同实施例1的步骤1。

2)配制发酵培养基

同实施例1的步骤2。

3)发酵工艺过程控制

5-L搅拌式生物反应器，培养温度28℃，装液量70%(体积)，罐内压力 0.02～0.03Mpa，以单位体积培养基净接入菌体干重等于0.22g的二级种子液作 为接种标准；初始pH6.20，过程中短期维持较低pH，pH低于4.2的时候加入 NaOH使之维持在约4.2，该时间大约持续26h，56h(碳源耗尽)起pH快速上 升；装有双层六平叶涡轮桨，搅拌转速恒定400r/min；初始通气量为0.5vvm， 保证发酵过程的最低溶氧不低于30%。

最后测得目标产物1403C的最高产量为1.05g/L，出现在108h。

实施例5、培养工艺5

1)制备菌种液

同实施例1的步骤1。

2)配制发酵培养基

同实施例1的步骤2。

3)发酵工艺过程控制

5-L搅拌式生物反应器，培养温度28℃，装液量70%(体积)，罐内压力 0.02～0.03Mpa，以单位体积培养基净接入菌体干重等于0.22g的二级种子液作 为接种标准；初始pH6.20，过程中短期维持较低pH，pH低于4.2的时候加入 NaOH使之维持在约4.2，该时间大约持续28h，58h(碳源耗尽)起pH快速上 升；装有双层六平叶涡轮桨，初始搅拌转速400r/min；初始通气量为0.5vvm， 保证发酵前期(对数生长期和稳定期前期)的最低溶氧不低于30%，发酵后期(稳 定期后期和衰亡期)的溶氧维持在30～40%。

最后测得目标产物1403C的最高产量为1.32g/L，出现在108h。

实施例6、培养工艺6

1)制备菌种液

同实施例1的步骤1，50-L种子罐培养36h。

2)配制发酵培养基

参照实施例1的步骤2，配制335L发酵培养基。

3)发酵工艺过程控制

500-L搅拌式生物反应器，培养温度28℃，装液量70%(体积)，罐内压力 0.02～0.03Mpa，以单位体积培养基净接入菌体干重等于0.22g的二级种子液作 为接种标准；初始pH6.40，过程中短期维持较低pH，pH低于4.0的时候加入 NaOH使之维持在约4.0，该时间大约持续30h，52h(碳源耗尽)起pH快速上 升；装有三层组合搅拌桨，即下层为半圆管涡轮桨，中层为斜叶推进桨，上层 为平叶涡轮桨，初始搅拌转速100r/min；初始通气量为0.5vvm，保证发酵前 期(对数生长期和稳定期前期)的最低溶氧不低于30%，发酵后期(稳定期后期和 衰亡期)的溶氧维持在50～60%。

最后测得目标产物1403C的最高产量为1.10g/L，出现在84h。

以实施例1为初始对照，分析实施例2～6可以发现：通过对反应器规模 的微生物发酵过程进行多参数协同控制，使5-L反应器发酵的1403C的产量由 最初的0.61g/L提至1.32g/L，提高幅度达到116%；500-L中试发酵的产量由 最初的0.50g/L提高至1.10g/L，增幅达到120%，基本建立了一种用于生物反 应器发酵培养海洋红树林内生真菌No.1403(Haloroselliniasp.)高产抗癌化合物 1403C的生产工艺。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。