法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-04-17
授权
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2015-11-11
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/866 申请日:20140827
实质审查的生效
2014-12-03
公开
公开
技术领域
本发明涉及PCR、基因重组及蛋白质分析领域,特别涉及一种 提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法。
背景技术
杆状病毒多角体基因和p10基因是杆状病毒在感染宿主后的晚 期产生的高水平表达蛋白。p10和多角体基因都是杆状病毒复制过程 中的非必须基因,缺失这两个基因后病毒粒子仍可以完成复制和组织 侵染。多角体启动子是杆状病毒极晚期超强表达启动子,现已成功应 用于杆状病毒表达系统,用于外源基因的高水平表达。多角体蛋白聚 合后可形成超大分子蛋白质结晶多角体。目前的研究表明多角体可保 护包埋在多角体内部的病毒粒子和蛋白,使之长时间保存活性。
E25蛋白是杆状病毒的一种囊膜蛋白,其位于杆状病毒病毒粒子 的囊膜。E25蛋白存在核定位信号,融合外源蛋白后可以将外源蛋白 引导入细胞核并固定入病毒粒子囊膜。过量表达E25后,可提高多角 体中E25的蛋白水平。
本发明利用杆状病毒这些特性,构建在多角体启动子下表达外源 蛋白的重组病毒。为了不影响多角体基因的表达,通过同源重组方法 将体外构建的多角体启动子外源蛋白基因替代杆状病毒自身p10基 因。为了提高多角体的内部外源蛋白含量,将E25和外源蛋白融合表 达。这样提高外源蛋白在多角体中的含量,为进一步开发利用杆状病 毒表达创造了条件。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题,本发明的目的在于提供一种提 高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法。利用基因重组技术, 构建在多角体启动子下E25与EGFP融合表达的重组病毒。重组病 毒感染草地贪夜蛾培养细胞,使融合蛋白固定于多角体内部,并且使 固定于多角体内部重组蛋白的含量上升。
为达到上述目的,本发明的技术方案为:
(1)按以下方法克隆e25基因:
以AcMNPV基因组为模板,利用PCR技术得到e25基因,e25基 因的序列见以下网址
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/510708?report=genbank&log $=nuclalign&blast_rank=2&RID=Z40W2AX3013);PCR所用的引物 分别为e25-F(5’-CGGATCCATGTGGGGAATCGTGTTACT-3’,下 划线为BamHI酶切位点)和e25-R(5’-GCTCTAGACTA CAGGAACAGGTGGTG-3’,下划线为XbaI酶切位点);所述PCR 扩增反应为:首先,94℃,预变性5分钟,一个循环;接下来30 个循环,94℃变性40秒,55℃退火40秒,72℃延伸40秒;最后, 72℃延伸7分钟,1个循环。
(2)按以下方法克隆egfp基因:
以egfp基因为模板,egfp基因序列见以下网址
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/595644660?report=genbank& log$=nuclalign&blast_rank=5&RID=Z40WRB21016)
利用PCR技术扩增egfp基因;PCR所用的引物分别为egfp-F (5’-GCTCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3’)和egfp-R(5’- CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’,);所述PCR 扩增反应同e25基因扩增反应方法一致。
(3)构建重组载体pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp:
通过琼脂糖凝胶电泳对egfp和e25PCR产物进行分析和纯化, 随后将egfp基因PCR产物经XbaI和HindIII酶切后克隆至pFastBacI 载体,得到pFastBacI-egfp,随后e25基因经BamHI和XbaI酶切后 PCR产物克隆入pFastBacI-egfp,获得pFastBacI-e25-egfp;利用双脱 氧链终止法在核苷酸测序仪上对所插入基因的顺序及正确性进行验 证;
(4)构建重组病毒
以pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp为模板,利用引物P10-F (5’-ATGTCAAAGCCTAACGTTTTGACGCAAATTTTAGACGCCG TTACGGAAACTAACACAAAGGTTGGTTGGCTACGTATACTCC -3’)和P10-R(5’- CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAAT CGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCC ATG-3’)PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-egfp; 所述PCR扩增反应为:首先,94℃,预变性5分钟,一个循环;接 下来30个循环,94℃变性40秒,56℃退火40秒,72℃延伸1.5 分钟;最后,72℃延伸7分钟,1个循环。
以pFastBacI-e25-egfp为模板,利用引物P10-F (5’-CAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATT ACATTTTATTTACAATCTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’)和 P10-R(5’- CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCA AAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’) PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-e25-egfp;所述 PCR扩增反应为:首先,94℃,预变性5分钟,一个循环;接下来 30个循环,94℃变性40秒,56℃退火40秒,72℃延伸2分钟; 最后,72℃延伸7分钟,1个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳对pPH-egfp和pPH-e25-egfpPCR产物进行 分析和纯化。随后在聚苯乙烯锥形管中以加入野生型AcMNPV基因 组DNA、脂质体和PCR产物(pPH-egfp或pPH-e25-egfp)各10μg, 加入270μL无血清TC-100培养并混匀;将所述混合物在27℃孵育 30分钟后共转染Sf-9培养细胞;转染后的培养细胞加入无血清 TC-100培养基培养12小时;随后,吸出培养基后在细胞上覆盖低熔 点琼脂糖,并在其实添加含有10%胎牛血清的TC-100培养基;在 27℃条件下培养5天,通过荧光显微镜标记进行空斑筛选重组病毒,; 重组病毒通过五轮筛选,获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液,病毒分 别命名为vAc-egfp和vAc-e25-egfp。
(5)使用Sf-9培养细胞,接种vAc-egfp和vAc-e25-egfp,27 ℃感染5天,后通过离心收集培养细胞。
(6)收集多角体及重组蛋白鉴定分析:将所收集的细胞样品进 行超声波破碎,使用蔗糖密度梯度离心纯化多角体,随后将多角体裂 解,利用Western blot技术,对多角体内的重组蛋白进行鉴定。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:
本发明通过外源蛋白与E25蛋白融合表达的方法,提高固定入多 角体内部外源蛋白的含量。为实现重组蛋白的高水平表达,在杆状病 毒高效强力启动子—多角体启动子下表达该重组基因。由于杆状病毒 P10蛋白为杆状病毒复制过程中的非必须基因,通过同源重组的方法 将融合基因连同多角体启动子替换p10基因,实现不影响多角体的形 成和融合蛋白高水平表达的目的。通过对多角体内部融合蛋白含量分 析表明,融合E25蛋白后,外源蛋白固定入多角体内部的含量提高 25%,明显提高了外源蛋白的固定水平。该技术为进一步开发利用杆 状病毒-昆虫表达系统,提高其表达利用效率创造了条件。
附图说明
图1.杆状病毒转移载体pFastBacI的图谱;
图2.2a重组病毒感染培养细胞,图2b分离纯化多角体荧光显微 镜照片;
图3.3aWestern blot检测重组蛋白,3b为分析多角体内重组蛋白 含量。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明方案做进一步详细描述,
以下实施例涉及的相关材料及其来源如下:
(1)苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV和egfp基因:由 浙江省农业科学院蚕桑研究所提供。
(2)DNA处理和PCR扩增试剂盒:购于日本Takara。
(3)杆状病毒转移载体pFastBacI和lipofectin:购自美国 Invitrogen。
(4)DNA测序试剂盒:购于PEAppliedBiosystems。
(5)EGFP抗体、胎牛血清FCS和昆虫细胞培养基TC-100:购 于美国Gibco。
以下以具体实施例详细说明本发明一种提高AcMNPV多角体内 部外源蛋白含量的方法,它包括如下部分:
(1)按以下方法克隆e25基因:
以AcMNPV基因组为模板,利用PCR技术得到e25基因;PCR 所用的引物分别为e25-F(5’-CGGATCCATGTGGGGAATCGTGTTA CT-3’)和e25-R(5’-GCTCTAGACTACAGGAACAGGTGGTG-3’); 所述PCR扩增反应为:首先,94℃,预变性5分钟,一个循环;接 下来30个循环,94℃变性40秒,55℃退火40秒,72℃延伸40 秒;最后,72℃延伸7分钟,1个循环。
(2)按以下方法克隆egfp基因:
以egfp基因为模板,利用PCR技术扩增egfp基因;PCR所用 的引物分别为egfp-F(5’-GCTCTAGAATGCCGAATTATTCATACA CC-3’)和egfp-R(5’-CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA TG-3’);所述PCR扩增反应同e25基因扩增反应方法一致。
(3)构建重组载体pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp:
通过琼脂糖凝胶电泳对egfp和e25PCR产物进行分析和纯化, 随后将egfp基因PCR产物经XbaI和HindIII酶切后克隆至pFastBacI 载体如图1所示,得到pFastBacI-egfp,随后将e25基因经BamHI和 XbaI酶切后PCR产物克隆入pFastBacI-egfp,获得pFastBacI-e25-egfp; 利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上对所插入基因的顺序及正确 性进行验证;
(4)构建重组病毒
以pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp为模板,利用引物P10-F (5’-ATGTCAAAGCCTAACGTTTTGACGCAAATTTTAGACGCCG TTACGGAAACTAACACAAAGGTTGGTTGGCTACGTATACTCC -3’)和P10-R(5’- CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAA TCGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTC CATG-3’)PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-egfp; 所述PCR扩增反应为:首先,94℃,预变性5分钟,一个循环;接 下来30个循环,94℃变性40秒,56℃退火40秒,72℃延伸1.5 分钟;最后,72℃延伸7分钟,1个循环。
以pFastBacI-e25-egfp为模板,利用引物P10-F (5’-CAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATT ACATTTTATTTACAATCTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’)和 P10-R(5’- CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCA AAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’) PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-e25-egfp;所述 PCR扩增反应为:首先,94℃,预变性5分钟,一个循环;接下来 30个循环,94℃变性40秒,56℃退火40秒,72℃延伸2分钟; 最后,72℃延伸7分钟,1个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳对pPH-egfp和pPH-e25-egfpPCR产物进行 分析和纯化。随后在聚苯乙烯锥形管中以加入野生型AcMNPV基因 组DNA、脂质体和PCR产物(pPH-egfp或pPH-e25-egfp)各10μg, 加入270μL无血清TC-100培养并混匀;将所述混合物在27℃孵育 30分钟后共转染Sf-9培养细胞;转染后的培养细胞加入无血清 TC-100培养基培养12小时;随后,吸出培养基后在细胞上覆盖低熔 点琼脂糖,并在其实添加含有10%胎牛血清的TC-100培养基;在 27℃条件下培养5天,通过荧光显微镜标记进行空斑筛选重组病毒,; 重组病毒通过五轮筛选,获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液,病毒分 别命名为vAc-egfp和vAc-e25-egfp。
(5)使用Sf-9培养细胞,接种vAc-egfp和vAc-e25-egfp,27 ℃感染5天,后通过离心收集培养细胞。
(6)收集多角体及重组蛋白鉴定分析:将所收集的细胞样品进 行超声波破碎,在4℃条件下,使用45%-60%的蔗糖梯度5000转/ 分钟,离心30分钟,纯化多角体。所得的多角体重悬于无菌水中, 并用血细胞计数板统计多角体的数目。重组病毒感染细胞与纯化多角 体在荧光显微镜下检测结果参见图2a及图2b;随后取5×108多角体, 将多角体用多角体裂解液(0.1mol/L Na2CO3,0.15mol/L NaCl pH 11) 冰上裂解30分钟,以充分裂解多角体。利用从华安生物公司所购买 的EGFP抗体,通过Western blot技术,对多角体内的重组蛋白进行 鉴定,Western blot分析如图3a所示,在vAc-egfp和vAc-e25-egfp 的多角体分别检测到26KDa和50KDa蛋白条带,与预测的蛋白分 子量大小一致。利用ImageJ软件对其浓度分析,经三次独立重复实 验验证,表明重组蛋白的浓度为对照的2.5倍(图3b),由于重组蛋 白的分子量为对照的2倍,实际固定入多角体内部重组蛋白比对照提 高25%。这一结果表明利用E25融合外源蛋白可显著提高多角体内 部外源蛋白的水平。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并 不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在 本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书 所限定的保护范围为准。
机译: 杆状病毒部分多角体蛋白融合表达增强外源重组蛋白表达的方法
机译: 杆状病毒部分多角体蛋白融合表达增强外源重组蛋白表达的方法
机译: 一种用于治疗组合物中的外源剂的方法,其使用多核苷酸构建体,针对多核苷酸构建体的表达产物的升高的抗体和部分试剂盒,以及制备药物组合物的方法。