用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用

摘要

本发明公开了一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体与应用，本发明通过RNA-seq测序技术并结合生物信息学分析，第一次获得了较为完整的禾谷孢囊线虫侵染抗性植物时候的基因表达谱，并在相关数据库中找到了三条具有致死效应的RNAi特异位点序列，其序列为：RCCNY1：SEQ ID NO.1或RCCNY2：SEQ ID NO.2或RCCNY3：SEQ ID NO.3。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种用于生物防控的禾谷孢 囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用。

背景技术

禾谷孢囊线虫又称燕麦孢囊线虫、禾谷孢囊线虫， 对小麦、大麦、黑麦、燕麦及多种禾本科牧草具有严重危害性，是世 界上广泛存在的病原线虫，尤其对小麦的生产构成严重的威胁。我国 自1987年在湖北天门县发现该病害以来，迄今已在华北、西北、华 中以及华东等13个省区市发现有分布，且有逐渐蔓延之势。目前的 主要防治方法包括农业防治、化学农药防治和生物防治。长期以来我 国农民主要采取轮作、灌溉、增施有机厩肥、深翻和日晒土壤、种植 诱捕植物和调节播期等农业技术措施防治线虫,但是日常种植的作物 基本上都是禾谷孢囊线虫的寄主,因而防治效果并不显著。化学农药 防控线虫是有效的方法之一，但是它对环境和农产品造成的污染使得 该方法缺陷凸显。而生物防治目前报道最多的是食线虫真菌和线虫天 敌细菌,但因其效果不明显,商品化困难,至今尚没有一种生防制剂被 广泛推广。因此,寻找安全而又行之有效的线虫防治途径非常必要。

RNAi干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA (double-strand RNA,dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的 mRNA降解,使相应基因的表达关闭,从而引发的转录或转录后水平的 基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。 这种现象是生物为保护自身基因组免受外源(如病毒)和内源性(如转 座元件)序列的侵袭,特异性地调节或干扰基因表达的一种自身防御 “免疫”应答现象。

关于线虫研究中,已发现线虫体内存在着能把RNAi信号放大和 传递的机制，微量的dsRNA就能引导机体产生强烈的RNAi效应,而且 能够传递到子代。dsRNA可以通过微注射进入C.elegans成虫,也可 以把C.elegans成虫浸泡在含有dsRNA的溶液中或者喂饲含有dsRNA 的大肠杆菌。注射进入的dsRNA很容易在干细胞中扩散引起RNAi,而 且能将这种效应传递到子代。这种方法产生的表型外显率高,非常适 合胚胎基因的功能研究。然而注射法需要体外合成dsRNA和手工注射 操作,费时、花费高而且技术难度大,很难用于大规模的功能分析。浸 泡法是将线虫浸泡于高浓度的dsRNA溶液。相比注射法,浸泡法能够 同时对大量的线虫材料进行处理。但是,浸泡法同样需要体外合成大 量的dsRNA(一般为1-5mg/ml),成本很高。与注射法和浸泡法比较， 喂饲法有其独特的优势。喂饲法通过构建特殊载体,细菌体内诱导表 达dsRNA,再喂饲线虫,可以有效抑制靶标基因的表达，省钱省事,并 且可大规模进行实验。因而,如果建立一个RNAi细菌喂饲文库,该方 法就可高效地研究大批基因的功能，从而找出可用于农业生产中线虫 的防治方法。

禾谷孢囊线虫与根结线虫同属于固着性内寄生线虫，与寄主建立 寄生关系后雌虫固着在取食部位不再移动。由于不能在人工培养基上 培养,所以直接在寄生线虫中应用RNAi技术比较困难。根结线虫体形 小,微注射感染手段变得不再实用。另外，它们在感染寄主植物前不 正常吸收液体也使得研究无法开展。因而，近几年的一项重大突破即 是找到在植物寄生线虫上进行RNAi技术的方法。首次向植物寄生线 虫成功注入dsRNA的是Urwin等应用章鱼胺刺激大豆胞囊线虫 (Heterodea glycines)和马铃薯白线虫(Globodera pallida)的口腔, 使其吸半胱氨酸蛋白酶、hgctl、精子主蛋白(MSP)三个基因的dsRNA。 处理过的线虫侵染植物14天后分离,发现三个靶标基因的表达明显 受到抑制,相应的表观遗传性状也发生了改变。经优化后,此方法也被 用于根结线虫的研究。Bakhetia等把M.incognita幼虫浸泡在编码 过氧化物酶(dual oxidase)的dsRNA中，结果在线虫侵入大豆35天 后检测,总产卵量减少了70％。Shingles等应用RNAi技术敲除 Mi-cpl-1基因,降低了其转录本丰度，M.incognita的J2s幼虫的半 胱氨酸蛋白酶活性也降低了。几丁质合成酶是甘蓝根结线虫 (Meloidogyne artiellia)生成卵壳几丁质的一种重要的酶。Fanelli 等证明把卵块浸泡在几丁质合成酶dsRNA溶液中,可以使几丁质合成 酶基因的表达减少，卵孵化延迟。另外，Rosso等研究发现,间苯二 酚可刺激M.incognita对dsRNA的吸收,并且观察到了明显的RANi现 象。除了离体干扰线虫以外,有些学者通过构建表达dsRNA的转基因 植物达到减少根结线虫寄生的目的。Yadav等把RNAi用于转基因烟 草成功地干扰了M.incognita的生长发育，表明在寄主植物中表达 dsRNA是一种控制寄生线虫病的可行策略。Huang等在拟南芥内过表 达根结线虫寄生基因16D10，结果根结减少了63-90％,而且体积很小, 卵块的产量也减少了69-93％，成功地减少了4种根结线虫的寄生。 Fairbairn等构建转基因烟草(Nicotiana tabacum)表达dsRNA发夹 结构，沉默爪哇根结线虫(Melododogyne javanica)转录因子 MjTis11。结果虽然没有明显减少线虫的繁殖量和卵的孵化率,但是证 明植物可以作为一种传输体系诱导根结线虫RNAi介导的基因沉默。 由上可以看出,利用RNAi转基因植物来防治寄生线虫是一个新的防 治策略，将为植病防治工作带来新的前景。

但前述研究均是集中在模式动物秀丽线虫和植物寄生根线虫的 相关研究，由于禾谷孢囊线虫的基因组背景尚未阐明，所以没有相关 研究报道。随着近年来转录组测序技术的发展，利用基因组和转录组 技术相结合来研究植物寄生性线虫的方法流行起来。利用转录组技术 可以高通量的获得相关线虫的候选基因从而进一步鉴定相关功能基 因。我们利用对禾谷孢囊线虫(H.avenae)和根结线虫(Meloidogyne  naasi)具有双抗作用的材料易变山羊草的根部进行了深度的转录组 测序。通过对测序结果进行分析，在去除了植物，微生物，细菌和载 体序列后，首次得到了禾谷孢囊线虫在侵染抗性植物时表达的相关基 因846条。进一步和已有的线虫数据库进行比对分析后，去除和植物 (plant)，昆虫(insect)和人类(human)同源的基因，最后得到 三条和秀丽线虫(C.elegans)同源又具有致死效应的基因。在此基 础上构建了dsRNA干扰载体，进行dsRNA浸泡干扰实验，最后发现三 个基因位点均具有致死效应，其中两个基因具有显著致死效用。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用 于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列， 其序列为：RCCNY1：SEQ ID NO.1或RCCNY2：SEQ ID NO.2或RCCNY 3：SEQ ID NO.3。

进一步的，所述干扰序列的构建方法为：选用具有CCN抗性和 RKN抗性的易变山羊草1号作为转录组测序材料，之后通过RNA-seq 测序技术得到了第一个禾谷孢囊线虫侵染植物的转录组，进行转录组 测序，并通过序列比对，基于线虫数据库找到了36个禾谷孢囊线虫 的RNAi干扰位点序列，通过进一步的筛选，排除了和植物(Plant)、 昆虫(Insect)和人类(Human)同源的序列，最后得到了三个具有致 死效应的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列。

一种RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体含有上述的 RCCNY1或RCCNY2或RCCNY3的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列。

一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列在 禾谷孢囊线虫研究及生物防控方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明通过体外转录分 别合成禾谷孢囊线虫(CCN)的靶标基因片段RCCNY 1(Unigene38116)、RCCNY2(Unigene102492)和RCCNY3 (Unigene38007)的dsRNA,然后通过浸泡法对禾谷孢囊线虫(CCN)的 J2幼虫进行RNAi实验。本实验发现线虫长时间聚集容易死亡,采用 摇床培养悬浮线虫溶液,大大改善了这一状况。结果发现dsRNA明显 降低了幼虫的活性,说明靶标致死效应基因在线虫的生长发育中具有 重要作用。

由此证明本发明采用转录组技术找到相关功能基因研究基因功 能的方法切实可行,为大规模鉴定物种全基因组功能提供了新的思 路，同时也首次较为系统的鉴定并筛选了禾谷孢囊线虫与抗性植物拮 抗过程中表达的相关基因。

附图说明

图1.利用基因特异的干扰RNA喂饲线虫24h后线虫的存活率， dsRNA的浓度为25ng/μL，和对照相比较有显著差异的(p<0.05)已 用字母标出(a,b,c三组数据间存在显著性差异)。

图2为本发明3个禾谷囊胞线虫目的基因的dsRNA处理结果， 其中，A：水、B:基因RCCNY1(Unigene38116)、C:基因RCCNY 2(Unigene102492)、D:基因RCCNY3(Unigene38007)。

图3为转录组测序Unigene序列比对路线图。

图4为基因RCCNY1(Unigene38116)测序图,结果显示测序序列和 PCR序列完全一致。

图5为基因RCCNY2(Unigene102492)，测序图结果显示测序序列 和PCR序列完全一致。

图6为基因RCCNY3(Unigene38007)测序图，结果显示测序序列 和PCR序列完全一致。

图7为基于转录组中的候选Unigene基因片段的PCR电泳图，其 中，M：DNA标记，1：基因RCCNY1(Unigene38116)、2：基因RCCNY 2(Unigene102492)、3：基因RCCNY3(Unigene38007)、4：对照。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明方案做进一步详细描述：

试验例：一、实验材料和试剂

1.供试线虫材料

禾谷孢囊线虫山东肥城群体(H.avenae，致病型pathotype Ha43) 由山东农业大学刘峰教授提供。用采集受害的小麦根和根际土壤，取 200ml土壤于塑料盆中捻碎，用强水流冲洗，搅动，沉淀片刻，将水 溶液过20和80目的网筛，重复以上步骤3次，再用小水流轻轻清洗 80目筛残余物，用滤纸过滤，解剖镜下挑取健康可用的孢囊。

2.主要试剂和酶类

DNase Ⅰ和RNaseH购自全式金公司；高纯度质粒提取试剂盒购自 Promega；RNase Inhibitor、LITMUS281载体、T7RNA聚合酶NTPmix 购自NEB公司；梭甲基纤维素钠购自Sigma公司；Taq酶、DNA Marker、 pGMTeasy连接试剂盒均为全式金公司产品；间苯二酚购自北京化学 试剂厂。

二、分析及实验流程：

RNA-seq测序：

1.植物材料：选用具有CCN抗性和RKN抗性的易变山羊草作为 转录组测序材料，以测定它在接种CCN处理和不接种CCN两种情况 下根部所有基因的表达情况。首先将材料的种子进行表面灭菌处理 (在3％浓度的次氯酸钠和0.01％的Tween20混合液中浸泡5min 后再用灭菌水浸泡3次，再将种子均匀铺陈在持续湿润的滤纸上置 于5cm直径的培养皿中，在20℃左右的室温和16h/8h的光照周期 环境下发苗。十天后将幼苗均分为两组：一组用于接种CCN的J2幼 虫(每株接种1000条)，另一组不接虫而作为第一组的对照，同时 将接种CCN的时间点定义为0h/dpi(hours or days post  inoculation，hpi or dpi)。30个小时后(30hpi)，将所有植株 转到无线虫和无菌的环境下以避免未侵入根部的CCN持续侵染，从 而使得合胞体(syncytia)的发育同步化，同时确保周围环境为20 ℃左右的室温和16h/8h的光照周期以促使植株继续生长发育。

2.转录组测序：等量混合接种禾谷孢囊线虫和不接虫两种处理在 接虫后30小时、3天和9天的根部RNA进行Illumina HiSeq^TM2000测序平台4G深度的转录组从头测序，运用两个组装程序对测 序数据进行拼接。通过Trinity method获得了118,064条独立基 因(unigene)，其平均长度为500bp、N50为599bp、平均测序深 度为33.25倍。进一步对这些独立基因进行了注解。

线虫序列筛选：

1.通过注解获得全部长度超过200bp的转录组数据库在

Swiss-prot/trEMBL蛋白数据库进行比对，以得分超过50(bit  score>50)为筛选得分临界值；

2.对公共数据库(NCBI dbEST)中可以下载的全部线虫表达

序列标签(Nematode EST)基于生活周期分为三类：自由线虫 (FLN)、动物寄生线虫(APN)和植物寄生线虫(PPN)。将蛋白数据 库比对后序列在线虫表达数据库中进行本地比对(tblastX)来进一 步确定线虫相关基因，同时也通过核苷酸序列比对(blastN)和蛋白 质序列比对(blastX)在M.incognita和M.hapla的基因组数据 库中进行比对(genome project websites (http://www.inra.fr/meloidogyne_incognita, http://www.hapla.org)，以上比对结果均选择最佳比对值(Top  hits)。

转录组测序Unigene序列比对路线如图4所示。

RNAi位点的发现：

1.把预测得到的线虫基因序列采用本地比对，基于秀丽线虫基数

据库WormBase(http://www.wormbase.org,release WS227)， 将最为相似的基因序列作为禾谷孢囊线虫候选基因保留下来；

2.将前述比对得到的基因和秀丽线虫的RNAi位点数据库相比较

(WormMart section of WormBase(release WS220))，选出可 以对应到致死效应的位点的基因(比对得分临界值>40，bit  score>40)；

3.将前述得到的RNAi位点序列以比对得分临界值>40(bit  score>40)为标准，进一步和植物的非冗余蛋白数据库相比较(plant  nonredundant protein database，Embryophyta，NCBI txid3193)， 将比对不到(No hits)植物非冗余蛋白数据库的基因进一步和昆虫 (insect)的非冗余蛋白数据库(nonredundant insect protein  database(NCBI txid6960))及人类(human)的非冗余蛋白数据库 (nonredundant human protein database(NCBI txid9606))进行 比对(得分临界值>40，bit score>40)，最后只将致死型RNAi(lethal  RNAi)序列，同时又比对不到(No hits)植物、昆虫和人类非冗余蛋 白数据库的基因序列作为候选的RNAi位点。

3.三个禾谷孢囊线虫基因部分片段的PCR扩增

a.引物设计：

如表1所示，候选禾谷孢囊线虫转录组中具有致死效用基因序 列及秀丽线虫中同源基因

基于转录组中的候选Unigene基因片段(表1)，从WormBase下 载对应基因的全长，基于基因的保守区，利用Premier5.0设计引物：

Unigene_38116_AS,

CAACCTGCACCGAATACTTCACTACAAA

Unigene38116_S,

ACCCTAAATAATGGAGACCTCACTAACG；

Unigene102492_AS,

ACAAGATGACGGAAATGGAAGAAGAGTT

Unigene102492_siRNA_S,

CGTTAGTGAGGTCTCCATTATTTAGGGT；

Unigene38007_siRNA_AS,

AAGAGCCAACAATCTCCGAGTTCTCCCT

Unigene38007_siRNA_S,

CACCAAGACCAACTACCGAACCACAAGA；

b.PCR扩增

PCR扩增体系

PCR扩增程序如下：

PCR电泳结果如图7所示。

4扩增片段的回收、克隆、测序

a.扩增片段的回收

使用天根的回收试剂盒:

(1)用干净的刀片将目的DNA条带从琼脂糖胶上切下来,置于1.5 ml的离心管中,称取重量；

(2)每100mg胶加300μl溶胶液,50℃水浴10min,不断温和上 下翻转离心管,直到胶完全溶解；

(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB中(吸附柱放入收集管 中),12000r/min离心30sec,倒掉收集管中的废液；

(4)加700μl漂洗液PW,12000r/min离心30sec,弃掉废液；

(5)加500μl漂洗液PW,12000r/min离心30sec,弃掉废液；

(6)将离心吸附柱放回收集管中,12000r/min离心2min,尽量除 去漂洗液；

(7)将吸附柱放入一个干净的离心管中,在吸附膜中间位置加入 适量65-70℃预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2min。10⁴r/min离心l min。回收的DNA保存在-20℃备用。

b.连接

连接体系：

c.转化

(1)取感受态细胞(100μl),置于冰上溶化；

(2)用预冷的无菌吸头将连接产物(10μl)加入到感受态细胞中, 轻轻旋转混匀内容物,置于冰上30min，每隔10min混匀一次；

(3)将离心管在42℃水浴60-90sec,不要摇动,然后立即置于冰 上2-3min；

(4)加500μl的37℃预热的SOC培养基,置于37℃摇床 180r/min培养lh使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标一 记基因；

(5)取100μl-300μl己转化的感受态细胞转移到LB平板上(含 50mg/L Amp,16μl IPTG(50mg/L),40μl X-gal(20mg/ml)),用一无菌 的弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开；

(6)将平板置于室温直至液体被吸收,37℃倒置培养12-16h；

(7)筛选蓝白斑,挑取白斑进行菌液PCR、酶切鉴定。

d.质粒提取

(l)将5ml含相应抗生素的LB加入到通气良好的15ml的试管中, 接入单菌落,于37℃摇床220r/min培养过夜；

(2)取1.5ml培养物加入到1.5ml离心管中,12000r/min离心 30sec,倒掉上清,收集菌体。收集2次,最后一次吸去培养液,细菌沉 淀尽可能干燥；

(3)加入100μl预冷的溶液I,振荡,使菌体悬浮在溶液I中,室 温放置10min；

(4)加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒混匀,冰浴5min；

(5)加入150μl预冷的溶液Ⅲ,颠倒混匀,冰浴5min；

(6)12000r/min,4℃离心10min；

(7)转移上清,加入等体积的氯仿,混匀,室温放置5min,4℃ 12000r/min离心5min；

(8)转移上清,加入0.7倍体积的异丙醇,室温放置5min,4℃ 12000r/min离心15min；

(9)弃上清,用70％乙醇洗涤沉淀,室温风干沉淀；

e.测序

委托英俊公司进行

结果如图4-6所示。

5.载体构建

将含有测序正确的基因片段载体与表达dsRNA的载体 (LITMUS281)用SacI和Ncol酶进行双酶切,获得具有相同酶切位点的 片段和LJTMUS281载体,便于把片段构建到LITMUS281载体上。

用T4DNA Ligase16℃连接12-16h,将连接产物转化TOP10,通过 蓝白斑筛选,挑选白斑进行双酶切鉴定出阳性克隆,至此成功地在目 的基因的两段引入了T7序列。

6.高纯度质粒提取

为获得高纯度质粒,采用Promega公司的回收试剂盒,具体步骤 如下:

(1)将摇床培养过夜的3ml菌液分次倒入1.5ml离心管 中,104r/min离心2min；

(2)倒掉上清,加入300μl cell resuspension solution,使菌 体混匀；

(3)加入300μl cell lysis solution,颠倒4次,混匀；

(4)加入300μl neutralization solution,颠倒4次,混匀；

(5)104r/min离心5min；

(6)将3-5ml注射器的活塞取下,再将空注射器插到微型柱上, 向注射器内加入1ml resuspend resin；

(7)将第5步所得的上清轻轻转移到加入resin的注射器中；

(8)装上活塞,轻轻推溶液到微型离心柱中；

(9)取下注射器,抽出活塞,再将注射器装到小柱上；

(10)加入2ml column wash solution,插上活塞,慢推；

(11)取下注射器,将小柱转移到l.5ml离心管中,10⁴r/min离心 2min；

(12)将小柱转移到新的离心管中,加入50μl nuelease-free  water(65℃水浴),放置lmin；

(13)10⁴r/min离心20sec；

(14)所得溶液保存在-20℃。

以前述所获得的质粒作为模板,用T7引物(序列为:5’- TAATACGACTCACTATAGG-3')进行PCR扩增。

PCR扩增体系

PCR扩增程序如下:

将PCR产物进行纯化,纯化产物作为体外转录的模板

(1)将PCR产物加入等体积的苯酚:氯仿,轻打混匀。4℃， 12000r/min离心15min；

(2)转移上清于另一个离心管中,加入上清的2倍体积的无水乙 醇,4℃12000r/min离心10min；

(3)轻轻倒掉乙醇,再加200μl75％乙醇洗涤。4℃7500r/min离 心5min,倒掉上清,干燥沉淀；

(4)加入DEPC处理水溶解沉淀DNA。

7.体外转录合成dsRNA

以前述所获得的DNA作为模板,用T7RNA聚合酶进行转录

37℃反应2h。反应完毕,于70℃水浴15min后,冷却至室温。最 后,将转录产物dsRNA进行纯化:

(l)在反应产物中加入1μl DNaseⅠ和1μl RNaseH,37℃温育 30min；

(2)加入0.1倍体积醋酸钠(3M,pH5.2)和2.5倍体积的95％乙醇, 冰浴10min,4℃12000r/min离心10min；

(3)轻轻倒掉上清,再加500μl75％乙醇洗涤。4℃7500r/min离 心10mins,再倒掉上清,干燥沉淀；

(4)加入DEPC处理水溶解dsRNA,将合成好的dsRNA于-80℃保存 备用。

(5)紫外分光光度计测定260nm处的吸光度,计算反应产物浓度, 在1％琼脂糖凝胶上电泳检测dsRNA的完整性。

8.dsRNA处理线虫侵染实验

如图2、3所示，将构建好的dsRNA在25ng/μL浓度下喂饲禾 谷孢囊线虫(J2s)24h,通过解剖显微镜镜检统计活线虫和死亡线虫 的数目来计算线虫存活率，每个实验设置两个样本，样本之间的统计 比较采用统计学软件SPSS20中的Mann–Whitney U-test方法，显 著差异值为(P<0.05)。发现三条序列相比对照均有40％以上的致死 率，其中两条序列更是达到了显著致死(80％)。(图1)

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在 本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书 所限定的保护范围为准。