一种建立含有Rickettisa菌和不含Rickettisa菌的烟粉虱种群的方法

摘要

本发明涉及昆虫侵染型内共生菌种群的建立，具体为一种建立含有Rickettisa菌和不含Rickettisa菌的烟粉虱种群的方法。所述方法包括以下步骤：采集烟粉虱种群，在实验室培养；选取出若干烟粉虱于显微镜下观察辨别雌雄；吸取雌雄烟粉虱各一头，接于甜瓜叶片的背面；培养；提取单头烟粉虱的DNA，然后利用PCR方法对其DNA进行分子鉴，纯化至得到稳定的种群。根据本发明的技术方案，模拟烟粉虱自然生存条件下的生活条件建立种群，没有导致烟粉虱的生物学特性的改变，可以准确的得出Rickettisa菌对烟粉虱造成的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫侵染型内共生菌种群的建立，具体为一种建立含有Rickettisa菌 和不含Rickettisa菌的烟粉虱种群的方法。

背景技术

烟粉虱(Bemisiatabaci Gennadaius)属半翅目Hmioptera，粉虱科Aleyrodiae,小粉 虱属Bamisia，广泛分布于全球除南极洲外各大洲的90多个国家和地区，其寄主范 围广，可危害包括蔬菜、棉花及观赏植物在内的600多种田间和温室作物。烟粉虱 主要存在以下三种危害，一是取食植物汁液，引起其生理异常，二是分泌蜜露诱发 煤污病，三是传播植物的双生病毒，对我国的农业经济造成了重大的影响。

内生菌在自然界中无处不在，几乎所有的昆虫都含有内共生菌。在长期进化的过 程中，内共生菌与其昆虫宿主已经形成互惠互利的关系。研究表明，昆虫内共生菌 可以协助宿主取食、消化与解毒，从而扩大宿主取食谱。昆虫内生菌可以增强昆虫 自身防御病原微生物和寄生物的能力，也可以帮助宿主逃避天敌寄生或捕食，也可 以调节宿主的耐热性和增强宿主抗药性，使得昆虫宿主对环境适应能力增强。在烟 粉虱中，Rickettisa菌可以提高其产卵量以及子代存活率；减少寄生蜂对其寄生。在 蚜虫中，Rickettisa菌可以改变其体表的颜色，增加其对瓢虫的抗性。另外，它还可 以提高昆虫宿主的耐热性，增加其适应性。目前，内共生菌在模式昆虫的相关研究 比较多，而关于烟粉虱此类具有较多复合种、遗传进化复杂的昆虫的研究还不成熟， 仅仅只涉及与其生殖有关的研究。

研究表明，昆虫内共生菌一般存在于一个特殊的组织—菌胞中，但肠腔和其他 组织中也有存在。有些肠道菌只是暂时存在肠道中，有些却是永久的存在肠道中。 所以，研究者很难区分这些细菌到底是存在肠道里还是体腔内。烟粉虱体内的共生 菌是属于次生内共生菌，原位杂交实验发现，这些内共生菌不仅存在菌胞中，也存 在肠道和体腔中。这类共生细菌很难从烟粉虱体内分离出来。同时，由于这类内共 生菌不能体外培养，对于这类共生菌功能的研究只能以烟粉虱为载体，这样就加大 对这类共生菌功能研究的难度。面对这一瓶颈问题，有些学者是用显微注射的方法 消除，但烟粉虱体型微小，导致死亡率高，同时对烟粉虱会造成一些物理性的伤害； 但大部分研究者则是通过抗生素利福平消除处理，这样会使烟粉虱体内的内共生菌 Portiera和Hamiltonella消除，但其结果并不理想，而且不能建立相对稳定的无菌种 群。而且，用抗生素福利平处理烟粉虱后，会导致烟粉虱发育迟缓，后代存活率降 低。引起这些不利于烟粉虱的生长发育的原因究竟是烟粉虱内共生菌被消除的结果 还是抗生素的副作用，目前不得而知。

鉴于以上方法都不能建立稳定的含菌和无菌种群，而且不能排除消除方法对烟 粉虱内共生菌功能研究的影响，这样会加大对烟粉虱内共生菌功能验证的难度。针 对这一瓶颈问题，本发明提供了一种建立稳定的无菌的烟粉虱种群的方法。

发明内容

为了解决现在昆虫内共生菌研究中，内共生菌不能体外培养，用抗生素和注射 法不能获得稳定的相应种群的问题，本发明的目的是一种建立稳定的含有Rickettisa 菌和不含有Rickettisa菌的烟粉虱种群的方法。

根据本发明建立烟粉虱的含有Rickettisa菌和不含Rickettisa菌的种群的方法， 所述方法包括以下步骤：

(1)从全国各地采集烟粉虱种群，在实验室培养，其中光照条件为白天14h： 黑夜10h，相对湿度为75％～85％；

(2)待种群量相对较大时，选取出若干烟粉虱于显微镜下观察辨别雌雄；

(3)取已长出两片真叶的甜瓜苗(Cucumismelo)，用微型养虫笼夹在甜瓜苗的 叶片上，用吸虫管吸取雌雄烟粉虱各一头，接于微型养虫笼的下养虫室，即甜瓜叶 片的背面；

(4)3-4天过后，用自制吸虫器将微型养虫笼的烟粉虱取出，将甜瓜放在大型 养虫笼生长，其中光照条件为白天14h：黑夜10h，相对湿度为75％～85％；

(5)将微型养虫笼的烟粉虱，单头提取DNA，然后利用PCR方法对其DNA 进行分子鉴定，所用引物如以下表1所示，利用烟粉虱内共生菌鉴定引物，鉴定种 群内共生菌情况；

(6)待烟粉虱羽化后，取同一养虫笼里的雌雄烟粉虱，重复(3)～(5)步骤，；

(7)纯化至得到稳定的种群，经过连续单头饲养并纯化5代，即可以得到稳定 的含菌种群和无菌种群。

根据本发明的方法，其中烟粉虱的DNA提取方法包括以下步骤：

1)吸取10μl加Proteinase K的裂解液滴于封口膜上，用灭菌0.2ml国产PCR管 管底将从微型养虫笼吸出的烟粉虱单头在裂解液中充分匀浆，将匀浆液吸入1.5ml 进口离心管中。

2)再吸取15μl裂解液清洗封口膜研磨烟粉虱处清洗数次(1次就行)，吸取清 洗液与匀浆液合并。

3)提取液金属浴65℃(PCR仪)30分钟以上，简易离心机短暂离心；金属 浴96℃10分钟以灭活蛋白酶K,短暂离心，该提取液则为烟粉虱的DNA。

根据本发明的方法，其中PCR的反应体系以及程序：

反应体系：2X Trans PCR Mix为12.5μL、前引物为0.5μL、后引物为0.5μL、模 板为2μL、灭菌水为9.5μL

反应程序：94℃ 3min，94℃ 30s，52-60℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环， 最后72℃ 10min延伸，扩增产物4℃保存。

根据本发明的技术方案，模拟烟粉虱自然生存条件下的生活条件建立种群，没 有导致烟粉虱的生物学特性的改变，可以准确的得出Rickettisa菌对烟粉虱造成的影 响。以前对烟粉虱Rickettisa菌作用的研究主要是通过注射法或抗生素饲喂法，注射 法是指用显微注射器向烟粉虱体内注射抗生素，抗生素饲喂法是指烟粉虱羽化后， 将烟粉虱吸取到饲养液与抗生素混合的养虫瓶中，注射法导致烟粉虱死亡率高，抗 生素饲喂法可以导致烟粉虱发育迟缓，这样的方法不能明确是否是Rrickettisa菌对烟 粉虱生物学特性的影响，本发明则可以排除这些因素对实验结果造成的影响。

附图说明

图1显示饲养烟粉虱的微型养虫笼；

图2显示大型养虫笼；

图3显示Rickettsia massiliae菌的烟粉虱种群DNA的电泳图的阳性对照；

具体实施方式

实施例1

(1)从全国各地采集烟粉虱种群，在实验室培养，其中光照条件为白天14h： 黑夜10h，相对湿度为75％～85％。

(2)待种群量相对较大时，选取出若干烟粉虱于显微镜下观察辨别雌雄。

(3)取已长出两片真叶的甜瓜苗(Cucumismelo)，用微型养虫笼(图1)夹在甜瓜 苗的叶片上，由于每头烟粉虱体内的内共生菌情况都不一样，用吸虫管吸取雌雄烟 粉虱各一头，接于微型养虫笼的下养虫室，即甜瓜叶片的背面。

(4)三至四天过后，用自制吸虫器将微型养虫笼的烟粉虱取出。将甜瓜放在大 型养虫笼生长(图2)，其中光照条件为白天14h：黑夜10h，相对湿度为75％～85％

(5)将微型养虫笼的烟粉虱，单头提取DNA，然后利用PCR方法对其DNA 进行分子鉴定(所用引物如以下表1所示)，利用烟粉虱内共生菌鉴定引物，鉴定种 群内共生菌情况。根据Rickettisa菌的序列，进行PCR以及凝胶电泳测定，当在250bp 位置显示有电泳条带且测序比对正确时则表明此烟粉虱是带有Rickettisa菌的，在 250bp位置无条带则表明此烟粉虱是不含有Rickettisa菌的，所得扩增结果通过NCBI 比对，为Rickettisa菌基因组中的特异性片段。

(6)待烟粉虱羽化后，可以辨别雌雄，取同一养虫笼里的雌雄烟粉虱，重复(3) ～(5)步骤。

(7)纯化至得到稳定的种群，经过连续单头饲养并纯化5代，即可以得到稳定 的含菌种群和无菌种群。

表1

烟粉虱的DNA提取方法包括以下步骤：

1)吸取10μl加Proteinase K的裂解液滴于封口膜上，用灭菌0.2ml国产PCR管 管底将从微型养虫笼吸出的烟粉虱单头在裂解液中充分匀浆，将匀浆液吸入1.5ml 进口离心管中。

2)再吸取15μl裂解液清洗封口膜研磨烟粉虱处清洗数次(1次就行)，吸取清 洗液与匀浆液合并。

3)提取液金属浴65℃(PCR仪)30分钟以上，简易离心机短暂离心；金属 浴96℃10分钟以灭活蛋白酶K,短暂离心，该提取液则为烟粉虱的DNA。

PCR的反应体系以及程序：

反应体系：2X Trans PCR Mix为12.5μL、前引物为0.5μL、后引物为0.5μL、模 板为2μL、灭菌水为9.5μL

反应程序：94℃ 3min，94℃ 30s，52-60℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环， 最后72℃ 10min延伸，扩增产物4℃保存。